人线粒体 DNA 中核苷酸的同时定位与定量
November 14th, 2017
在这里, 我们描述一个方法可以同时定量和基因组范围内的地图核苷酸在高度完整的 dna 在核苷酸决议, 结合酶裂解的基因组 dna 与其碱性水解和随后5´端序.
本实验的总体目标是在单核苷酸分辨率水平上绘制掺入的核糖核苷酸的位置，并定量人类线粒体 DNA 中存在的核糖核苷酸的数量。这种方法可以帮助回答有关 DNA 完整性、DNA 复制机制、DNA 修复机制以及这些机制中的任何一个的缺陷如何导致疾病的关键问题。这种方法的主要优点是线粒体 DNA 中掺入的核糖核苷酸的位置和数量都可以在单个实验中确定。
虽然这种方法可以深入了解人类线粒体 DNA 中的核糖核苷酸含量，但它也可以应用于研究其他模式生物序列基因组中的核 DNA 和核糖核苷酸含量。本实验使用了先前从 HeLa 细胞中分离并在文本方案的第 2 节和第 3 节中描述的基因组 DNA。要消化 DNA，请在微量离心管中小心混合以下物质。
1 μg DNA、5 μL 10X 缓冲液 3.1、1 μL HincII 和无核酸酶水，最终体积为 50 μL。在 37 摄氏度下孵育 30 分钟。消化完成后，向每个样品中加入 1.8 体积的顺磁珠，通过移液小心混合，并在室温下孵育 10 分钟。
将试管放在磁架上 5 分钟以沉淀珠子，然后取出并丢弃上清液。用 150 微升 70% 乙醇洗涤沉淀约 30 秒，然后取出并丢弃上清液。用 200 微升 70% 乙醇重复洗涤，再洗涤 30 秒。
在室温下干燥样品约 15 至 20 分钟。接下来，从磁力架上取下试管。在 45 μL 洗脱缓冲液中洗脱每个沉淀，小心移液混合，然后孵育 5 分钟。
将磁珠沉淀在磁力架上，并将每个 DNA 样品的 45 μL 转移到新试管中。向每 45 μL 分离或纯化的 DNA 中加入 5 μL 3 摩尔氢氧化钾或 5 μL 3 mol 氯化钾，使总体积为 50 μL。这 8 个反应总结在此表中。
在 55 摄氏度的杂交炉中孵育 2 小时，然后将样品在冰上孵育 5 分钟。加入 10 μL pH 值为 5.2 的三摩尔乙酸钠和 125 μL 冷的 100% 乙醇，沉淀 DNA，并在冰上孵育 5 分钟。通过在 4 摄氏度下以 21， 000 倍 G 离心 5 分钟来沉淀 DNA。
弃去上清液，用 250 μL 冷的 70% 乙醇洗涤每个 DNA 沉淀，再次离心，弃去上清液。让沉淀在敞开的试管中干燥约 5 到 10 分钟，直到任何可见的液体蒸发。最后，加入 20 μL 洗脱缓冲液，让 DNA 沉淀在室温下溶解 30 分钟。
首先将每个样品的反应混合物制备为预混液。对于每个样品，加入 2.5 μL 的 10x T4 多核苷酸激酶反应缓冲液、2.5 μL 的 ATP 和 1 μL 的三种引物磷酸酶-负 T4 多核苷酸激酶。将每个 DNA 样品的 19 μL 转移到新的 200 μL 试管中，并在 85 摄氏度下在热循环仪中变性 3 分钟。
然后，将 DNA 样品放在冰上冷却，并向每个样品中加入 6 μL 制备的反应混合物。将反应混合物在 37 摄氏度下孵育 30 分钟，然后在 65 摄氏度下孵育 20 分钟以停止反应。如前所述，使用顺磁珠纯化 DNA，但用 14 μL 洗脱缓冲液洗脱。
提前将反应混合物制备为主混液，每个样品包含以下内容。5 微升 10x T4 RNA 连接酶反应缓冲液、5 微升氯化六胺钴（III）、0.5 微升 ARC140 寡核苷酸、0.5 微升 ATP 和 25 微升 50% PEG 8000。通过移液充分混合。
将 13 μL 每种纯化的 DNA 转移到新的 200 μL 试管中，并在 85 摄氏度下在热循环仪中变性 3 分钟。将 DNA 在冰上冷却，然后向每个样品中加入 36 μL 反应混合物，通过移液混合，并短暂离心。向每个反应中加入 1 μL T4 RNA 连接酶，通过移液混合，然后短暂离心。
将样品在室温下避光孵育过夜。当单链 DNA 连接完成后，如前所述纯化 DNA，但使用 0.8 体积的顺磁珠并将珠子沉淀 10 分钟。在 20 μL 洗脱缓冲液中洗脱，并将每个 DNA 样品 20 μL 转移到新的 200 μL 试管中。
用 0.8 体积的顺磁珠重复纯化，并在 14 μL 洗脱缓冲液中洗脱。对于每个样品，将反应混合物制备为预混液，由两微升 10x T7 DNA 聚合酶反应缓冲液、两微升 ARC76/77、两微升 dNTP 和 0.8 微升 BSA 组成。将 12.8 μL 纯化的 DNA 转移到新的 200 μL 试管中，并在 85 摄氏度下在热循环仪中变性 3 分钟。
将 DNA 置于冰上冷却，然后向每个样品中加入 6.8 μL 反应混合物，通过移液混合，短暂离心，并在室温下孵育 5 分钟。向每个反应中加入 0.4 μL T7 DNA 聚合酶，并在室温下孵育 5 分钟。使用顺磁珠纯化 DNA 后，在 11 μL 洗脱缓冲液中洗脱。
要开始 PCR 扩增，请在新的 200 μL 试管中单独制备每个样品的反应混合物，该试管由 7.5 μL ARC49、7.5 μL 独特索引引物和 25 μL 2X 热启动即用型混合物组成。向每个反应中加入 10 μL DNA 样品。使用以下条件放大库。
在 95 摄氏度下变性 45 秒，然后是 18 个循环，分别是 98 摄氏度 15 秒、65 摄氏度 30 秒、72 摄氏度 30 秒，最后在 72 摄氏度伸长 2 分钟。扩增后将样品保持在 4 摄氏度。按照文本方案中的说明纯化文库，并在 20 微升 TE 缓冲液中洗脱。
使用数字电泳系统确定每个文库的质量和平均片段大小。显示了氢氧化钾或氯化钾处理后合适文库谱的代表性结果。计算出每个文库的浓度后，如文本方案中的第 9 节和第 10 节所述，提取最多 24 个用不同索引引物扩增的文库的等摩尔量进行测序。
添加 TE 缓冲液至终体积为 25 微升，浓度为 10 纳摩尔。测序后，按照文本协议第 11 节的规定进行生物信息学数据分析。这些图表显示了氯化钾处理后人线粒体 DNA 轻链和重链 DNA 中所有 HincII 位点的汇总读数。
大约 70% 检测到位于切割位点的 5 个主要末端，证明了 HincII 消化的高效率。用氢氧化钾处理文库以水解包埋的核糖核苷酸处的 DNA 可将 HincII 的读取数减少到约 40%线粒体和核 DNA 中的相对读取数揭示了覆盖度的差异，并说明了适当归一化以消除链偏倚的重要性。将读取计数标准化为 HincII 可以定量测量重链或轻链上每个线粒体基因组的核糖核苷酸数量。
每个核糖核苷酸的氢氧化钾处理后的读数，归一化为每条链的序列组成，显示出与一不同的比率，表明读数的非随机分布，并表明独特的核糖核苷酸模式和高文库质量。将包埋核糖核苷酸位点的读数与 HincII 位点的读数以及基因组核苷酸含量标准化，可以生成每 1， 000 个互补碱基掺入每个核糖核苷酸数量的定量测量。一旦掌握，如果执行得当，该协议可以在两天内完成。
在尝试此过程时，重要的是要记住保持 DNA 高度完整，并避免在文库制备过程中引入任何双链断裂。按照此程序，可以执行其他方法，例如确认核糖核苷酸定量数据。观看此视频后，您应该对如何使用下一代测序制备用于核糖核苷酸和 DNA 图谱和定量的文库有很好的了解。
不要忘记，使用氢氧化钾等化学品可能很危险，因此在执行此程序时应始终采取预防措施，例如佩戴护目镜和手套。
概述
本研究提出了一种方法，用于同时定量和基因组范围内以单核苷酸分辨率测绘高完整性DNA中的核糖核苷酸。该技术结合了基因组DNA的酶解、碱性水解和随后的5'端测序。
关键研究组成部分
科学领域
- 基因组学
- 分子生物学
- DNA修复机制
背景
- 了解DNA中核糖核苷酸的整合对于研究DNA完整性至关重要。
- 核糖核苷酸可能会影响DNA复制和修复机制。
- 这些过程中的缺陷与各种疾病有关。
- 该方法可以应用于线粒体DNA和核DNA。
研究目的
- 测绘人类线粒体DNA中整合的核糖核苷酸的位置。
- 定量DNA中存在的核糖核苷酸数量。
- 提供关于DNA完整性及其对疾病影响的见解。
使用的方法
- 使用HincII对基因组DNA进行酶解。
- 使用超磁性珠纯化DNA。
- DNA制备的杂交和连接反应。
- PCR扩增以产生足够的DNA用于测序。
主要结果
- 该方法成功地以单核苷酸分辨率识别核糖核苷酸的位置。
- 定量分析揭示了线粒体DNA中核糖核苷酸的数量。
- 获得的见解可以为DNA复制和修复机制提供信息。
- 该技术适用于其他模式生物的研究。
结论
- 该方法增强了对DNA中核糖核苷酸整合的理解。
- 它为研究DNA完整性和相关疾病提供了宝贵的工具。
- 未来的应用可能扩展到各种基因组研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
This method enables simultaneous mapping and quantitation of ribonucleotides in human mitochondrial DNA, addressing a critical gap in DNA integrity assessment. By providing single-nucleotide resolution and absolute quantification, it supports mechanistic de-risking in target validation and preclinical model development. The approach enhances predictive confidence in studying replication and repair mechanisms linked to mitochondrial dysfunction and disease.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of ribonucleotide incorporation patterns to clarify mechanisms of DNA replication and repair.
- Operational Value: Provides quantitative readouts that support functional target validation and biological de-risking of nucleic acid metabolism pathways.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates normalized read counts that serve as quantitative endpoints for assessing ribonucleotide levels across experimental conditions.
- Operational Value: Utilizes standardized enzymatic digestion and ligation workflows compatible with next-generation sequencing platforms for reproducible assay development.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links ribonucleotide distribution to mitochondrial genome integrity, supporting disease-relevant system modeling.
- Operational Value: Enables longitudinal monitoring of DNA lesion accumulation as a biomarker for preclinical safety and efficacy evaluation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through preclinical development by providing quantitative DNA integrity data that informs go/no-go decisions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on ribonucleotide-induced replication stress and repair pathway activation.
- Screening: Delivers assay-ready, normalized quantitative outputs for compound effect assessment on DNA incorporation rates.
- Analytics: Produces strand-specific, genome-normalized ribonucleotide frequencies enabling cross-condition comparison and statistical analysis.
- Translational Research: Connects mitochondrial DNA ribonucleotide load to functional outcomes in preclinical models of metabolic and neurodegenerative disorders.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable sequencing-based platform for mapping various DNA lesions convertible to 5´-OH or 5´-phosphate ends.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in DNA integrity studies by providing direct, quantifiable measures of ribonucleotide incorporation.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized enzymatic cleavage, alkaline hydrolysis, and adapter ligation steps.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early detection of genotoxic liabilities in lead optimization.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted advancement decisions by quantifying mitochondrial DNA damage burden linked to therapeutic candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular biology, enzymatic DNA manipulation, and next-generation sequencing library preparation.
- Dependent on access to restriction enzymes (e.g., HincII), paramagnetic bead purification systems, and thermal cyclers.
- Necessitates cross-team standardization of DNA quality controls and normalization protocols to mitigate strand bias.
- Adaptation to nuclear DNA or other organisms requires validation of reference genome availability and adjustment of input DNA quantities.
- Practical limitations include the need for highly intact DNA to prevent confounding double-strand breaks during library preparation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:55
HincII Treatment and Alkaline Hydrolysis
4:11
5'-End Phosphorylation
5:21
Single Strand DNA Ligation
6:35
Second Strand Synthesis
8:23
PCR Amplification, Library Analysis and Pooling
10:10
Results: Simultaneous Quantitation and Genome-wide Mapping of Ribonucleotides
11:39
Conclusion
