人线粒体 DNA 中核苷酸的同时定位与定量

在这里, 我们描述一个方法可以同时定量和基因组范围内的地图核苷酸在高度完整的 dna 在核苷酸决议, 结合酶裂解的基因组 dna 与其碱性水解和随后5´端序.

本实验的总体目标是在单核苷酸分辨率水平上绘制掺入的核糖核苷酸的位置，并定量人类线粒体 DNA 中存在的核糖核苷酸的数量。这种方法可以帮助回答有关 DNA 完整性、DNA 复制机制、DNA 修复机制以及这些机制中的任何一个的缺陷如何导致疾病的关键问题。这种方法的主要优点是线粒体 DNA 中掺入的核糖核苷酸的位置和数量都可以在单个实验中确定。

虽然这种方法可以深入了解人类线粒体 DNA 中的核糖核苷酸含量，但它也可以应用于研究其他模式生物序列基因组中的核 DNA 和核糖核苷酸含量。本实验使用了先前从 HeLa 细胞中分离并在文本方案的第 2 节和第 3 节中描述的基因组 DNA。要消化 DNA，请在微量离心管中小心混合以下物质。

1 μg DNA、5 μL 10X 缓冲液 3.1、1 μL HincII 和无核酸酶水，最终体积为 50 μL。在 37 摄氏度下孵育 30 分钟。消化完成后，向每个样品中加入 1.8 体积的顺磁珠，通过移液小心混合，并在室温下孵育 10 分钟。

将试管放在磁架上 5 分钟以沉淀珠子，然后取出并丢弃上清液。用 150 微升 70% 乙醇洗涤沉淀约 30 秒，然后取出并丢弃上清液。用 200 微升 70% 乙醇重复洗涤，再洗涤 30 秒。

在室温下干燥样品约 15 至 20 分钟。接下来，从磁力架上取下试管。在 45 μL 洗脱缓冲液中洗脱每个沉淀，小心移液混合，然后孵育 5 分钟。

磁珠沉淀在磁力架上，并将每个 DNA 样品的 45 μL 转移到新试管中。向每 45 μL 分离或纯化的 DNA 中加入 5 μL 3 摩尔氢氧化钾或 5 μL 3 mol 氯化钾，使总体积为 50 μL。这 8 个反应总结在此表中。

在 55 摄氏度的杂交炉中孵育 2 小时，然后将样品在冰上孵育 5 分钟。加入 10 μL pH 值为 5.2 的三摩尔乙酸钠和 125 μL 冷的 100% 乙醇，沉淀 DNA，并在冰上孵育 5 分钟。通过在 4 摄氏度下以 21， 000 倍 G 离心 5 分钟来沉淀 DNA。

弃去上清液，用 250 μL 冷的 70% 乙醇洗涤每个 DNA 沉淀，再次离心，弃去上清液。让沉淀在敞开的试管中干燥约 5 到 10 分钟，直到任何可见的液体蒸发。最后，加入 20 μL 洗脱缓冲液，让 DNA 沉淀在室温下溶解 30 分钟。

首先将每个样品的反应混合物制备为预混液。对于每个样品，加入 2.5 μL 的 10x T4 多核苷酸激酶反应缓冲液、2.5 μL 的 ATP 和 1 μL 的三种引物磷酸酶-负 T4 多核苷酸激酶。将每个 DNA 样品的 19 μL 转移到新的 200 μL 试管中，并在 85 摄氏度下在热循环仪中变性 3 分钟。

然后，将 DNA 样品放在冰上冷却，并向每个样品中加入 6 μL 制备的反应混合物。将反应混合物在 37 摄氏度下孵育 30 分钟，然后在 65 摄氏度下孵育 20 分钟以停止反应。如前所述，使用顺磁珠纯化 DNA，但用 14 μL 洗脱缓冲液洗脱。

提前将反应混合物制备为主混液，每个样品包含以下内容。5 微升 10x T4 RNA 连接酶反应缓冲液、5 微升氯化六胺钴（III）、0.5 微升 ARC140 寡核苷酸、0.5 微升 ATP 和 25 微升 50% PEG 8000。通过移液充分混合。

将 13 μL 每种纯化的 DNA 转移到新的 200 μL 试管中，并在 85 摄氏度下在热循环仪中变性 3 分钟。将 DNA 在冰上冷却，然后向每个样品中加入 36 μL 反应混合物，通过移液混合，并短暂离心。向每个反应中加入 1 μL T4 RNA 连接酶，通过移液混合，然后短暂离心。

将样品在室温下避光孵育过夜。当单链 DNA 连接完成后，如前所述纯化 DNA，但使用 0.8 体积的顺磁珠并将珠子沉淀 10 分钟。在 20 μL 洗脱缓冲液中洗脱，并将每个 DNA 样品 20 μL 转移到新的 200 μL 试管中。

用 0.8 体积的顺磁珠重复纯化，并在 14 μL 洗脱缓冲液中洗脱。对于每个样品，将反应混合物制备为预混液，由两微升 10x T7 DNA 聚合酶反应缓冲液、两微升 ARC76/77、两微升 dNTP 和 0.8 微升 BSA 组成。将 12.8 μL 纯化的 DNA 转移到新的 200 μL 试管中，并在 85 摄氏度下在热循环仪中变性 3 分钟。

将 DNA 置于冰上冷却，然后向每个样品中加入 6.8 μL 反应混合物，通过移液混合，短暂离心，并在室温下孵育 5 分钟。向每个反应中加入 0.4 μL T7 DNA 聚合酶，并在室温下孵育 5 分钟。使用顺磁珠纯化 DNA 后，在 11 μL 洗脱缓冲液中洗脱。

要开始 PCR 扩增，请在新的 200 μL 试管中单独制备每个样品的反应混合物，该试管由 7.5 μL ARC49、7.5 μL 独特索引引物和 25 μL 2X 热启动即用型混合物组成。向每个反应中加入 10 μL DNA 样品。使用以下条件放大库。

在 95 摄氏度下变性 45 秒，然后是 18 个循环，分别是 98 摄氏度 15 秒、65 摄氏度 30 秒、72 摄氏度 30 秒，最后在 72 摄氏度伸长 2 分钟。扩增后将样品保持在 4 摄氏度。按照文本方案中的说明纯化文库，并在 20 微升 TE 缓冲液中洗脱。

使用数字电泳系统确定每个文库的质量和平均片段大小。显示了氢氧化钾或氯化钾处理后合适文库谱的代表性结果。计算出每个文库的浓度后，如文本方案中的第 9 节和第 10 节所述，提取最多 24 个用不同索引引物扩增的文库的等摩尔量进行测序。

添加 TE 缓冲液至终体积为 25 微升，浓度为 10 纳摩尔。测序后，按照文本协议第 11 节的规定进行生物信息学数据分析。这些图表显示了氯化钾处理后人线粒体 DNA 轻链和重链 DNA 中所有 HincII 位点的汇总读数。

大约 70% 检测到位于切割位点的 5 个主要末端，证明了 HincII 消化的高效率。用氢氧化钾处理文库以水解包埋的核糖核苷酸处的 DNA 可将 HincII 的读取数减少到约 40%线粒体和核 DNA 中的相对读取数揭示了覆盖度的差异，并说明了适当归一化以消除链偏倚的重要性。将读取计数标准化为 HincII 可以定量测量重链或轻链上每个线粒体基因组的核糖核苷酸数量。

每个核糖核苷酸的氢氧化钾处理后的读数，归一化为每条链的序列组成，显示出与一不同的比率，表明读数的非随机分布，并表明独特的核糖核苷酸模式和高文库质量。将包埋核糖核苷酸位点的读数与 HincII 位点的读数以及基因组核苷酸含量标准化，可以生成每 1， 000 个互补碱基掺入每个核糖核苷酸数量的定量测量。一旦掌握，如果执行得当，该协议可以在两天内完成。

在尝试此过程时，重要的是要记住保持 DNA 高度完整，并避免在文库制备过程中引入任何双链断裂。按照此程序，可以执行其他方法，例如确认核糖核苷酸定量数据。观看此视频后，您应该对如何使用下一代测序制备用于核糖核苷酸和 DNA 图谱和定量的文库有很好的了解。

不要忘记，使用氢氧化钾等化学品可能很危险，因此在执行此程序时应始终采取预防措施，例如佩戴护目镜和手套。