同时绘制并定量人线粒体DNA中的核糖核苷酸

本实验的总体目标是在单核苷酸分辨率水平上定位整合到人线粒体DNA中的核糖核苷酸，并定量线粒体DNA中核糖核苷酸的数量。该方法有助于解答有关DNA完整性、DNA复制机制、DNA修复机制的关键问题，以及这些机制中的任何缺陷如何导致疾病。该方法的主要优势在于，可在一次实验中同时确定线粒体DNA中整合核糖核苷酸的位置及其数量。

尽管该方法可用于研究人类线粒体DNA中的核糖核苷酸含量，也可应用于研究其他模式生物基因组序列中的核基因组DNA及核糖核苷酸含量。本实验所用的基因组DNA此前已从HeLa细胞中分离，并在文本方案的第二和第三部分中有所描述。为消化DNA，请在微量离心管中小心混合以下成分。

1微克DNA，5微升10X缓冲液3.1，1微升HincII，以及无核酸酶水补至终体积50微升。37摄氏度孵育30分钟。消化完成后，向每个样品中加入1.8倍体积的顺磁性磁珠，用移液器轻轻混匀，室温孵育10分钟。

将离心管置于磁力架上静置5分钟，使磁珠完全沉淀，然后移除并弃去上清液。用150 µL 70%乙醇洗涤沉淀约30秒，随后移除并弃去上清液。再用200 µL 70%乙醇重复洗涤一次，持续30秒。

将样品在室温下干燥约15至20分钟。随后，从磁力架上取下离心管。每份沉淀物中加入45 µL洗脱缓冲液，用移液器轻轻吹打混匀，并孵育5分钟。

将磁珠置于磁力架上沉淀，然后将每份DNA样品的45微升转移至新管中。向每份45微升的已分离或纯化DNA中加入5微升3摩尔氢氧化钾或5微升3摩尔氯化钾，总体积为50微升。这八个反应在此表中进行了汇总。

在55摄氏度的杂交炉中孵育两小时，然后将样品置于冰上孵育五分钟。加入10微升pH为5.2的3摩尔醋酸钠和125微升冰冷的100%乙醇，沉淀DNA，并在冰上孵育五分钟。在4摄氏度下以21,000 × g离心五分钟，使DNA形成沉淀。

弃去上清液，每份DNA沉淀用250微升冰冷的70%乙醇洗涤，再次离心后弃去上清液。将沉淀在敞口离心管中干燥约5至10分钟，直至可见液体完全蒸发。最后加入20微升洗脱缓冲液，室温下静置30分钟，使DNA沉淀充分溶解。

开始此实验步骤时，首先为每个样本配制反应体系，建议以总体系形式配制。每份样本中加入 2.5 微升 10x T4 多核苷酸激酶反应缓冲液、2.5 微升 ATP 以及 1 微升无 3' 磷酸酶活性的 T4 多核苷酸激酶。将每份 DNA 样本各 19 微升转移至新的 200 微升离心管中，在热循环仪中于 85 摄氏度变性 3 分钟。

然后将DNA样本置于冰上冷却，向每个样本中加入6 µL已配制好的反应混合液。先在37 °C孵育反应混合液30分钟，随后在65 °C孵育20分钟以终止反应。使用磁性 beads 纯化DNA，方法如前所述，但用14 µL洗脱缓冲液进行洗脱。

预先配制反应体系的总混合液，每份样品包含以下组分：5 微升 10x T4 RNA 连接酶反应缓冲液、5 微升六氨合钴(III)氯化物、0.5 微升 ARC140 寡核苷酸、0.5 微升 ATP 以及 25 微升 50% PEG 8000。用移液器充分混匀。

将每种纯化的DNA各13微升转移至新的200微升离心管中，在PCR仪中于85摄氏度变性3分钟。将DNA置于冰上冷却，然后向每个样品中加入36微升反应混合液，用移液器吹打混匀，并短暂离心。向每个反应体系中加入1微升T4 RNA连接酶，用移液器吹打混匀，再短暂离心。

将样品置于室温避光条件下孵育过夜。当单链 DNA 连接反应完成后，按照之前所述方法纯化 DNA，但使用 0.8 倍体积的磁性 beads，并将 beads 以 10 分钟离心沉淀。用 20 µL 洗脱缓冲液洗脱，并将每份 DNA 样品中的 20 µL 转移至新的 200 µL 管中。

用0.8倍体积的顺磁性磁珠重复纯化，并在14微升洗脱缓冲液中洗脱。对于每个样本，配制反应混合液作为主混合液，包含2微升10x T7 DNA聚合酶反应缓冲液、2微升ARC76/77、2微升dNTPs和0.8微升BSA。将12.8微升纯化后的DNA转移至新的200微升离心管中，在热循环仪中于85摄氏度变性3分钟。

将DNA置于冰上冷却，然后向每个样品中加入6.8微升反应混合液，用移液器吹打混匀，短暂离心，于室温孵育5分钟。向每项反应中加入0.4微升T7 DNA聚合酶，于室温孵育5分钟。使用磁性微珠纯化DNA后，用11微升洗脱缓冲液洗脱。

开始PCR扩增时，在新的200微升离心管中为每个样本单独配制反应体系，包括7.5微升ARC49、7.5微升特异性index引物和25微升2X热启动预混液。向每管反应体系中加入10微升DNA样本。使用以下条件扩增文库。

在95摄氏度变性45秒，随后进行18个循环：98摄氏度15秒、65摄氏度30秒、72摄氏度30秒，最后在72摄氏度延伸2分钟。扩增结束后将样品置于4摄氏度保存。按照文本方案中所述方法纯化文库，并用20微升TE缓冲液洗脱。

使用数字电泳系统测定每个文库的质量和平均片段大小。图中显示了经氢氧化钾或氯化钾处理后合适的文库谱型的代表性结果。在计算出每个文库的浓度后，按照文本方案中第9和第10节所述，等摩尔量混合最多24个使用不同索引引物扩增的文库用于测序。

加入TE缓冲液至终体积25微升，浓度为10纳摩尔。测序后，按照文本方案第11节所述进行生物信息学数据分析。这些图显示了经氯化钾处理后，人线粒体DNA轻链和重链上所有HincII位点的汇总读段。

所有检测到的5'端中约有70%定位于切割位点，表明HincII消化具有很高的效率。使用氢氧化钾处理文库，以在嵌入的核糖核苷酸处水解DNA，可使HincII位点的读段数量减少至约40%。线粒体DNA和核DNA中读段的相对数量揭示了覆盖度的差异，并说明了进行适当归一化以消除链偏向的重要性。将读段数归一化至HincII位点，可定量测量每条线粒体基因组重链或轻链上的核糖核苷酸数量。

每种核糖核苷酸经氢氧化钾处理后的读段数，在归一化至每条链的序列组成后，其比值不同于1，表明读段分布并非随机，提示存在特异的核糖核苷酸分布模式以及高质量的文库。将嵌入核糖核苷酸位点的读段数相对于HincII酶切位点以及基因组核苷酸含量进行归一化，可定量测定每1,000个互补碱基中掺入的各种核糖核苷酸的数量。一旦掌握，若操作得当，该实验方案可在两天内完成。

在进行该实验操作时，重要的是要始终确保DNA保持高度完整，并避免在文库构建过程中引入任何双链断裂。完成本实验步骤后，还可采用其他方法来验证核糖核苷酸定量数据。观看本视频后，您应能够充分掌握如何利用下一代测序技术对核糖核苷酸及DNA进行定位与定量分析的文库制备方法。

请注意，使用氢氧化钾等化学品可能存在危险，因此在进行本实验操作时，必须采取佩戴护目镜和手套等防护措施。