Cell Membrane Repair Assay Using a Two-photon Laser Microscope

该程序的总体目标是量化肌营养不良患者细胞中的质膜可修复性。这种方法可以帮助回答肌营养不良症的关键问题，例如给定突变与膜再密封动力学之间的关系是什么。该技术的主要优点是它允许实时定量活细胞中的膜重密封动力学。

首先在 37 摄氏度的二氧化碳培养箱中，在含有 40 毫升生长培养基的 T225 培养瓶中培养成纤维细胞。当培养物达到 70% 至 80% 汇合度时，用每次洗涤 40 毫升 PBS 冲洗细胞两次，然后在 37 摄氏度下加入 5 毫升 0.05% 胰蛋白酶 5 分钟。当细胞分离后，用 40 毫升新鲜生长培养基终止反应，并以每毫升 100， 000 个细胞的浓度将 2 毫升细胞接种到 35 毫米胶原蛋白涂层玻璃底板中，在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育过夜。

对于每个转染培养物，将 150 μL 新鲜无血清培养基添加到一个 1.5 mL 试管中。接下来，向每个试管中加入 3 μL 转染试剂，并在室温下孵育试管至少 5 分钟。在试管孵育时，将 175 μL 血清来源培养基和 3.5 μg dysferlin 质粒 DNA 添加到每板另外的 1.5 mL 试管中。

然后将 150 μL 质粒 DNA 溶液与 150 μL 转染试剂混合到每板一个新试管中，在室温下孵育 20 分钟。第二天早上，用 2 mL 血清来源培养基替换生长培养基。孵育结束时，将整个 300 微升质粒溶液均匀分布在每个板上，并在 37 摄氏度的二氧化碳培养箱中孵育板 24 小时。

第二天，用新鲜的生长培养基替换质粒上清液，并将板放回培养箱中再放置 24 小时。为了制备用于双光子损伤测定的细胞，请用 1 mL Tyrode 溶液冲洗转染的培养物一次。然后向细胞中加入 1 毫升新鲜的 Tyrode 溶液，并补充有 1 微升 2.5 毫摩尔 FM4-64 染料。

接下来，使用倒置共聚焦显微镜，在显微镜的软件中创建一个 0.2 x 2 微米的目标，并将目标放置在细胞膜的边缘，使目标线重叠并垂直于细胞膜。选择 543 纳米氦氖激光器激发 FM 染料信号，选择 488 纳米氩激光器激发 GFP 信号，并将检测范围分别设置为 600 至 760 纳米和 500 至 550 纳米。然后创建一个 5 分钟的连续图像扫描时间序列。

要生成膜损伤，请使用 820 纳米的双光子激光，激光功率为 15%，迭代 10 次，在时间序列开始 25 秒后漂白细胞。为了定量 FM4-64 染料荧光，使用软件绘制一个 6 x 6 微米的感兴趣区域，并将感兴趣区域放在细胞内的伤口位置附近。然后减去背景值，将净增加量除以时间零处的荧光值，以计算每个时间点的相对荧光值。

健康的人成纤维细胞在激光损伤后表现出低水平的 FM4-64 荧光激活，而未经治疗的患者成纤维细胞在损伤后表现出高水平的相对荧光强度。与未处理的患者对照相比，用全长 dysferlin 质粒转染的患者细胞表现出相对 FM4-64 荧光强度降低，但与健康对照中观察到的荧光值相似。在尝试此过程时，重要的是要记住细胞会在缓冲溶液中缓慢死亡，因此请快速工作并定期更换新鲜细胞。

观看本视频后，您应该对如何使用双光子显微镜再生膜病变以及如何实时量化膜再密封有很好的了解。