化学共轭法在戊型肝炎病毒纳米粒子表面功能化中的应用
May 11th, 2018
我们已将戊型肝炎病毒的衣壳蛋白作为 theranostic 纳米微粒 (HEVNP) 进行了设计。HEVNP 自组装成一个稳定的 icosahedral 笼在黏膜分娩。在这里, 我们描述了 HEVNPs 的改变的肿瘤靶向性的变异表面暴露残留到半胱氨酸, 共轭合成配体, 具体绑定肿瘤细胞。
HEV 纳米颗粒表面化学功能化的总体目标是提供一种可重复且一致的方法，用于将靶向免疫原性、治疗性和诊断分子偶联到 HEV 纳米颗粒表面，用于诊断和治疗目的。这种方法可以帮助回答纳米医学领域的关键问题，例如如何监测癌症的增强靶向和纳米疗法的分布。这种技术的主要优点是它具有高度可重复性、效率高，并且与生成基因工程相比更容易实现。
演示这些程序的是我们实验室的研究助理 Michelle Nguyen 和 Ivan Ruiz。如文本方案中所述，从戊型肝炎病毒纳米颗粒的生产和纯化开始该方案。用 10 毫摩尔 MES（pH 6.2）将 HEV 纳米颗粒样品稀释至 0.5 至 2 毫克/毫升之间，用于 TEM 成像。
用 40 毫安辉光放电电离碳涂层网格 30 秒，以产生亲水性碳表面。格栅的亲水性碳表面在辉光放电处理后只能持续 30 分钟。电离后，握住网格和镊子，向网格中加入两微升 HEV 纳米颗粒样品。
15 到 30 秒后，用滤纸吸干网格。然后立即用双蒸水清洗网格，并再次用滤纸吸干。立即向网格中加入 2 微升 2% 的乙酸铀酰。
15 秒后，用滤纸吸干网格。将样品网格放入电子除湿机干燥柜中过夜，使其干燥。根据样品的不同，可能需要低温电子显微镜或冷冻电镜进行结构可视化和表征。
将网格转移到 TEM 中，并以 10 至 80 K 的放大倍率成像。由于缺乏病毒 RNA，HEV 纳米颗粒在 TEM 中表现为直径约为 27 纳米的空二十面体蛋白。为了进行 HEV 纳米颗粒和马来酰亚胺连接的生物素的一步偶联，首先将 HEV 纳米颗粒应用于微型透析装置。
根据制造商的方案，在室温下用 0.01 摩尔 PBS pH 7.4 透析纳米颗粒 1 小时。透析后，将 HEV 纳米颗粒转移到 1.5 毫升试管中，并使用分光光度计测量 280 纳米的蛋白质浓度。将纳米颗粒以每毫升 1 毫克的浓度与等量的 100 微摩尔马来酰亚胺生物素和 0.01 摩尔 PBS pH 7.4 混合，形成 1 比 5 摩尔比。
在 4 摄氏度下反应过夜后，根据制造商的方案，用离心脱盐柱程序去除未结合的马来酰亚胺生物素。通过标准还原 SDS 页面分析样品。使用标准程序，使用 HRP 连接的链霉亲和素制备化学发光 Western 印迹，并通过 X 射线胶片捕获化学发光信号。
要将乳腺癌细胞特异性配体 LXY30 与 HEV 纳米颗粒表面暴露的半胱氨酸进行两步偶联，首先将纳米颗粒应用于微型透析装置，并在室温下用 0.01 摩尔 PBS pH 7.4 透析 1 小时。然后将 HEV 纳米颗粒转移到 1.5 毫升试管中，并使用分光光度计测量 280 纳米的蛋白质浓度。接下来，将 650 微摩尔马来酰亚胺叠氮化物和 650 微摩尔炔烃 LXY30 与 200 微摩尔硫酸铜和 1 毫摩尔抗坏血酸混合。
这在 650 微摩尔处形成马来酰亚胺连接的 LXY 30。将混合物在 4 摄氏度下孵育过夜。第二天，将 HEV 纳米颗粒与约 10% 体积的马来酰亚胺连接的 LXY 30 混合至每毫升 1 毫克，形成 1 比 3 的摩尔比。
在 4 摄氏度下反应过夜。由于马来酰亚胺 LXY 30 的浓度相对较高，因此混合后硫酸铜等反应物的最终浓度降低了约 10 倍。为了避免它们对戊型肝炎病毒纳米颗粒的损害，另一种选择是无铜贡献法。
根据制造商的方案，用离心脱盐柱去除未结合的马来酰亚胺 Click LXY 30。将 LXY 30 连接的 HEV 纳米颗粒保持在 4 摄氏度。要进行 LXY 30 HEV 纳米颗粒和 Cy5.5 荧光标签的一步偶联，首先将 LXY 30 连接纳米颗粒与等体积的 Cy5.5 荧光标签混合至每毫升 1 毫克，以形成 1 比 5 的摩尔比。
在 4 摄氏度下将混合物反应过夜后，根据制造商的方案，用离心脱盐柱程序去除未结合的 Cy5.5 NHS。将 LXY 30 Cy5.5 连接的 HEV 纳米颗粒保持在 4 摄氏度。尝试了两种方法将 HEV 纳米颗粒的 LXY 30 功能化用于肿瘤细胞靶向。
当 HEV 573C 纳米颗粒首先与马来酰亚胺叠氮化物结合，然后与 LXY 30 炔烃发生点击化学反应时，HEV 573C 纳米颗粒在 TEM 观察下似乎发生了分解。然而，LXY 30 炔烃和马来酰亚胺叠氮化物之间的初始点击化学反应形成马来酰亚胺连接的 LXY 30，然后共轭以辅助修饰的 HEV 纳米颗粒，这不会影响其结构，并且 HEV 573C 纳米颗粒保持完整。将 LXY 30 和 Cy5.5 连接的 HEV 纳米颗粒应用于培养的乳腺癌细胞，并通过共聚焦显微镜观察。
共聚焦显微镜的近红外荧光图像表明，与 Cy5.5 连接的 HEV 纳米颗粒相比，LXY 30 Cy5.5 连接的 HEV 纳米颗粒对 MDA MB 231 乳腺癌细胞内化增加具有更高的结合亲和力。该技术的意义延伸到检查多模式靶向和治疗分子，从而可以在不对正常细胞造成损害的情况下准确靶向和诊断肿瘤。虽然这种方法可以通过化学表面调制提供对癌症和肿瘤靶向的见解，但它可以应用于早期癌症诊断、筛查和影像学指导治疗。
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概述
本研究提出了将乙型肝炎病毒衣壳蛋白工程化为治疗诊断纳米粒子（HEVNP）以用于靶向肿瘤治疗。通过结合合成配体，修改了HEVNP以增强肿瘤靶向。
研究的关键组成部分
科学领域
- 纳米医学
- 治疗诊断学
- 肿瘤学
背景
- HEVNP能自组装成稳定结构。
- 修改纳米粒子可以提高靶向能力。
- 了解治疗剂的分布对癌症治疗至关重要。
- 与传统的基因工程方法相比，这种方法更高效。
研究目的
- 开发一种功能化HEVNP的一致方法。
- 通过合成配体增强对癌细胞的靶向。
- 促进肿瘤的诊断和治疗。
所用方法
- HEV纳米粒子的生产和纯化。
- 用于成像的HEVNP样品的稀释。
- 将配体结合到表面暴露的半胱氨酸残基上。
- 使用透射电子显微镜（TEM）进行分析。
主要结果
- HEVNP可以有效地修改以用于肿瘤靶向。
- 结合方法是可重复和高效的。
- 证明了癌细胞的靶向能力得到增强。
- 强调了在诊断和治疗中的潜在应用。
结论
- HEVNP代表了一种用于癌症治疗的有前景的平台。
- 表面修改允许治疗剂的靶向递送。
- 这种方法可能会推进纳米医学领域的发展。
常见问题
Executive Industry Relevance
Chemical surface functionalization of virus-like particles enables modular and reproducible conjugation of targeting ligands and imaging agents without genetic modification, supporting rapid prototyping of theranostic nanocarriers. This approach enhances predictive confidence in target validation by allowing systematic screening of diverse biomolecules on a stable nanoparticle scaffold. The method addresses a key discovery-stage challenge: achieving consistent, scalable display of functional entities for downstream oncology applications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through precise display of tumor-targeting ligands like LXY30 on HEV nanoparticles.
- Operational Value: Provides a reproducible platform for evaluating ligand-receptor interactions using cysteine-directed conjugation.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by allowing rapid comparison of ligand affinity and internalization efficiency in cancer cell models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable nanoconjugates with defined ligand density for standardized binding and uptake assays.
- Operational Value: Enables batch-to-batch consistency in nanoparticle functionalization, critical for assay reproducibility.
- Scalability: Supports preparation of validated biological systems for high-throughput screening of targeting moieties.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Produces tumor-targeted HEVNPs (LXY30-HEVNP-Cy5.5) validated in breast cancer cell models, supporting progression to preclinical studies.
- Mechanistic De-risking: Demonstrates that pre-forming maleimide-linked LXY30 via click chemistry preserves nanoparticle integrity, reducing structural failure risk.
- Disease-Relevant System: Uses MDA-MB-231 cells to assess internalization and binding affinity, aligning with therapeutic relevance in triple-negative breast cancer.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target validation to lead identification, enabling preparation of functionalized nanocarriers for preclinical evaluation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by allowing modular conjugation of immunogenic, therapeutic, and diagnostic molecules to HEV nanoparticles.
- Screening: Delivers assay-ready nanoparticles with reproducible surface modification for quantitative evaluation of targeting efficiency.
- Analytics: Generates measurable outputs via TEM, Western blot, and confocal microscopy to compare conjugation success and cellular uptake.
- Translational Research: Links discovery to preclinical continuity through demonstration of tumor-specific binding and internalization in cultured cancer cells.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable conjugation platform applicable to other macromolecular complexes with known structures.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances target validation confidence through precise, cysteine-specific ligand display without altering nanoparticle assembly.
- Operational Value: Offers high reproducibility and efficiency compared to genetic engineering, reducing batch variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling rapid screening of ligands and imaging tags on a stable nanocarrier.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted advancement by generating theranostic candidates with validated tumor targeting and imaging capabilities.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein chemistry, conjugation techniques, and nanoparticle purification.
- Depends on access to dialysis units, spectrophotometry, SDS-PAGE, Western blotting, and confocal microscopy.
- Necessitates standardization across teams for consistent protein concentration measurement and reaction conditions.
- Involves adaptation considerations when applying the method to other nanoparticle systems with different surface-exposed residues.
- Includes practical limitations such as nanoparticle disassembly if conjugation order is not optimized, as seen with premature maleimide azide binding.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:50
HEVNP Characterization
2:46
Chemical Conjugation of HEVNPs with Biotin, Cancer Targeting Ligand, and Fluorophores
7:05
Results: Production of LXY30-HEVNPs and Binding/Internalization of Fluorescently Labeled LXY30-HEVNPs in MDA-MB-231 Breast Cancer Cells
8:35
Conclusion
