蛋白质消化、超滤和尺寸排除色谱法优选人血浆和血清外来体的分离

该程序的总体目标是从血液中纯化囊泡，同时减少可能干扰下游分析（包括纳米颗粒追踪和蛋白质组学）的共纯化蛋白质和复合物。这种方法可以帮助回答关键问题，例如与健康状态相比，疾病状态下血清或血浆囊泡的蛋白质组学变化是什么。该技术的主要优点是提高了囊泡计数的准确性。

在去除丰富的非囊泡污染物时，我们增加了对低丰度蛋白质和疾病潜在生物标志物的鉴定。该方法的含义延伸到发现新的诊断生物标志物。它能够更准确地测定复杂基质（如血液）中细胞外囊泡的蛋白质组学组成。

一般来说，刚接触囊泡纯化的人会很挣扎，因为有很多已发表的技术。下游蛋白质组学分析的可重复性受丰度血清蛋白共纯化的影响。将试管置于非摇动条件下，置于 4 摄氏度冰箱中过夜，以平衡血清或血浆样品。

第二天，使用 1， 000 μL 移液管将 250 μL 样品分装到微量离心管中。将样品在 4 摄氏度下以 18， 000 倍 G 离心 30 分钟。使用 200 μL 移液器，去除 200 μL 澄清的上清液，并将其添加到新的微量离心管中。

转移上清液时避免任何沉淀材料。使用制造商的方案通过 BCA 测定定量样品的蛋白质含量。要进行检测，请将样品稀释在 1 至 50 的 X 磷酸盐缓冲盐水中。

测试每个样品一式两份。首先向锥形管中加入相应量的蛋白酶 K，在 PBS 中制备浓度为 50 μg/mL 的蛋白酶 K 溶液。然后加入缓冲液，在室温下涡旋 3 次，每次 30 秒。

接下来，将 50 微升蛋白酶 K 溶液添加到 10 毫克样品等分试样中，并使用 200 微升移液管上下移液轻轻混匀。将样品在 37 摄氏度下在水浴中孵育 30 分钟，然后将试管放在浮管架上。为防止潜在的泄漏，请避免将管子完全浸入水浴中。

孵育后，将样品和支架转移到 60 摄氏度的水浴中 10 分钟，以灭活蛋白酶 K.接下来，在使用前用 PBS 冲洗含有 100 kdalton 分子量截止过滤器的超滤装置。使用 1， 000 微升移液器向过滤器中加入 500 微升 PBS。将装置以 3， 700 倍 G 离心 5 分钟后，丢弃所有剩余的截留物和洗脱液。

通过添加 PBS 将样品体积增加到 500 微升。然后将样品移液到预冲洗的超滤装置中。在固定角度的台式离心机中以 3， 700 倍 G 和 4 摄氏度离心超滤装置，直到样品减少到 50 微升的体积。

接下来，将 500 微升 PBS 直接添加到滤膜上。并上下移液五次，然后像以前一样再次离心。将最后的 50 μL 截留物转移到新的微量离心管中。

用 200 微升 PBS 冲洗滤膜，上下移液 10 次。并将洗涤液转移到试管中。然后，将过滤器支架置于新试管中的相反位置。

以 2， 000 倍 G 的浓度运行反向离心回收 5 分钟，以从膜中取回剩余样品。将色谱柱放在尺寸合适的架子中。使用 1， 000 微升移液管加入 850 微升 SEC 浆液，其中珠子的截留分子量为 700 道尔顿。

打开色谱柱底部的盖子，让液体排入废液容器中 5 分钟。排干后，加入 10 μL PBS 洗涤树脂。等待 20 分钟，让清洗液从色谱柱中排出。

将经浓缩蛋白酶 K 处理的样品放入 15 mL 锥形管中。并通过用血清移液管添加 PBS 将样品体积增加到 5 毫升。摇动 1 分钟，轻轻混合试管。

然后，用血清移液管将样品缓慢地涂到准备好的柱上。将流出液收集到新的 15 mL 锥形管中。再次将收集的材料移液到树脂上，以去除低于 700 道尔顿的任何残留材料，将流出物收集在新的 15 mL 锥形管中。

每次加入 1 毫升 PBS，洗涤树脂两次。将流出液收集在试管中。最终总体积约为 7 毫升。

像以前一样，用 3 千道尔顿分子量过滤器冲洗超滤装置。在摆动桶转子中以 3， 700 倍 G 和 4 摄氏度离心。Buffer 将通过过滤器，可以丢弃。

浓缩的外泌体将保留在过滤器上方。离心样品，直到过滤器上方的体积减少到 200 μL。使用制造商的方案通过 BCA 测定定量样品的蛋白质含量。

将 5 微克纯化的外泌体添加到 1 毫升 PBS 中。并以中低速涡旋 15 秒。将样品放入 1 毫升一次性注射器中。

如果可用，将注射器设置在自动注射泵组中，以每分钟 30 μL 的速率注入稀释的外泌体样品。定义分析脚本，以运行三个技术重复，每次重复至少 30 秒，每个重复使用恒定流。对于分析，请将捕获阈值设置为 5。

最后，按照文本方案中的说明确定可溶性蛋白还原。显示了纯化血清囊泡的纳米颗粒跟踪分析的代表性结果。正如预期的那样，囊泡大小约为 100 纳米。

此处显示的是考马斯染色的蛋白质凝胶，比较了粗血清、SEC 前后馏分，显示蛋白和其他非囊泡污染物的减少。蛋白质印迹显示蛋白酶 K 处理和纯化后 CD63 的保留情况，CD63 是一种标志性的外泌体蛋白。蛋白酶 K 步骤旨在消化可溶性蛋白质。

CD63 是一种跨膜蛋白，在确定的浓度和孵育时间下不易受蛋白酶 K 的影响。在这里，蛋白质印迹显示了蛋白的消耗，蛋白是血液中最丰富的蛋白质，也是纯化后常见的共纯化蛋白。一旦掌握，这项技术可以在 6 小时内完成。

看完这个视频，你应该对如何使用离心机超滤、蛋白酶消化、体积排阻层析从生物体液中获得囊泡有了很好的了解。在色谱和纳米颗粒示踪之前，通过 BCA 或等效技术进行蛋白质定量非常重要。如果蛋白质浓度超过本协议中记录的浓度，结果会有所不同。

不要忘记，使用生物液体可能非常危险，并且在执行此程序时应始终采取预防措施，例如佩戴个人防护设备，包括手套、实验室外套和安全眼镜。在此程序之后，可以执行其他方法，如液相色谱质谱，以确定纯化的囊泡中所含的确切蛋白质。虽然这种方法可以深入了解血管的组成，但它也可以应用于其他样品类型，例如尿液、CSF 或细胞培养上清液。