Name: 蛋白质消化、超滤和尺寸排除色谱法优选人血浆和血清外来体的分离 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: 学习使用蛋白质消化、超滤和尺寸排除色谱法从人血浆和血清中纯化外泌体，减少非外泌体蛋白污染，提高囊泡计数准确性，助力疾病生物标志物发现。

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本研究得到了科罗拉多州立大学（CSU）内部资金（资助对象：KMD）、美国典型培养物保藏中心（ATCC）合同 #2016-0550-0002（美国国家过敏与传染病研究所 NIAID HHSN272201600013C 的分包合同）以及比尔和梅琳达·盖茨基金会（OPP1039688）（资助对象：KMD/NKG）的支持。我们感谢科罗拉多州立大学国家科学基金会本科生科研实习（REU）暑期项目提供的额外支持。

根据科罗拉多州立大学机构审查委员会（IRB）的初步审查，本研究被确定不属于人类受试者研究，因为所有人类样本均来自Bioreclamation IVT生物样本库的去鉴定样本，并且这些样本是在经IRB批准的方案下采集的。
1. 通过沉淀较大囊泡和细胞碎片制备粗样品（血浆或血清）
注意： 安全注意事项：血浆、血清及其他生物液体属于生物危害性材料，必须特别小心处理，并佩戴基本的个人防护装备，包括手套和实验服。强烈建议在生物安全柜中处理生物样本；若无条件提供，则建议佩戴眼部防护装置。
<ol>
	<li>将血清或血浆样品置于4 °C冰箱中，在不振荡的条件下过夜平衡（样品可来自-20 °C或-80 °C保存状态）。</li>
	<li>使用1,000 µL移液器，将250 µL样品分装至微量离心管中。</li>
	<li>在4 °C条件下，以18,000 × g离心30分钟。</li>
	<li>使用200 µL移液器，吸取200 µL澄清上清液并转移至新的微量离心管中。转移过程中避免接触沉淀物，并弃去沉淀物。</li>
	<li>按照生产商说明书，采用二辛可宁酸（BCA）法测定样品的蛋白含量。进行测定时，用1×磷酸盐缓冲液（PBS）将样品稀释1:50。每个样品设两个复孔。 
	注意：除非另有说明，本实验方案中均使用1× PBS。通常情况下，18,000 × g离心后的200 µL澄清血清或血浆样品可获得约15 mg总蛋白。其他类型的样品若蛋白含量较高或较低，可能需要调整BCA检测时的稀释倍数。</li>
	<li>将10 mg蛋白量的样品分装至新的微量离心管中。根据步骤1.5中测得的浓度计算所需样品体积，并使用200 µL移液器进行分装。 
	注意：建议将剩余样品储存于-80 °C。为避免后续使用中反复冻融，应将样品按每管10 mg分装至不同的离心管中。</li>
</ol>
2. 非外泌体血液蛋白的消化
注意： 消化步骤旨在减少与外泌体共同纯化的非外泌体蛋白。如果下游分析需要保留外泌体表面蛋白，则应考虑到此步骤可能干扰此类分析。外泌体表面暴露的四跨膜蛋白CD63在此过程中未受到显著的不利影响。
<ol>
	<li>在 PBS 中配制浓度为 500 µg/mL 的蛋白酶 K 溶液。将相应量的蛋白酶 K 加入锥形管中，然后加入缓冲液，并在室温下涡旋振荡 30 秒，重复 3 次。</li>
	<li>向 10 mg 样品分装物中加入 50 µL 蛋白酶 K 溶液，使用 200 µL 移液器轻轻吹打混匀。</li>
	<li>将样品置于 37 °C 水浴中孵育 30 分钟。将离心管放入浮管架中，并避免离心管完全浸入水浴，以防可能的泄漏。</li>
	<li>将样品及浮管架转移至 60 °C 水浴中孵育 10 分钟，以灭活蛋白酶 K。</li>
</ol>
3. 通过离心超滤去除小分子蛋白质和多肽
<ol>
	<li>使用前，用 PBS 冲洗含有 100 kDa 分子量截留值（MWCO）滤膜的超滤装置。方法是使用 1,000 µL 移液器向滤膜中加入 500 µL PBS，然后在 3,700 × g 条件下离心 5 分钟。弃去残留的截留液和流出液。 
	注意：超滤装置的样品体积容量必须为 0.5 mL - 4 mL，以确保最终样品体积可浓缩至 50 µL。</li>
	<li>取步骤 2.4 中的样品，加入 PBS 将体积调至 500 µL。用移液器将样品转移至预先冲洗过的超滤装置中。 
	注意：通常情况下，步骤 2.4 中的样品体积平均为 185 µL（120 至 150 µL 样品和 50 µL 蛋白酶 K 溶液）。</li>
	<li>将超滤装置置于固定角度台式离心机中，在 4 °C 条件下以 3,700 × g 离心，直至样品体积减少至 50 µL。 
	注意：当使用具有死端体积的超滤装置时，必须注意避免在离心过程中滤膜完全干燥。</li>
	<li>直接向滤膜中加入 500 µL PBS，上下吹打 5 次。按步骤 3.3 的条件进行离心。重复此洗涤步骤共 3 次。</li>
	<li>将最终的 50 µL 截留液转移至新的微量离心管中。</li>
	<li>用 200 µL PBS 冲洗滤膜，上下吹打 10 次，并将洗涤液转移至步骤 3.5 中的离心管中。</li>
	<li>将滤器支架倒置放入新的离心管中，在 2,000 × g 条件下进行反向离心回收 5 分钟，以回收膜上残留的样品。将回收的样品与步骤 3.5 中的样品合并。</li>
</ol>
4. 通过尺寸排阻色谱法（SEC）纯化囊泡
<ol>
	<li>使用 1,000 µL 移液器将 850 µL 分子量截留值（MWCO）为 700 kDa 的凝胶过滤介质浆液加入一个空的、带盖的重力流层析柱中。将层析柱置于配有滴液盘的合适尺寸支架上。</li>
	<li>打开层析柱底部盖子，让液体流出 5 分钟。排净后，加入 10 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤树脂。让洗涤液在柱中自然流尽，耗时约 20 分钟。</li>
	<li>将步骤 3.5 中获得的经蛋白酶 K 处理并浓缩的样品转移至一个 15 mL 圆底离心管中，用移液管加入 PBS 将样品体积调整至 5 mL。轻轻摇动离心管 1 分钟以混匀，然后用移液管缓慢将样品加至步骤 4.2 中准备好的层析柱中。 
	注意：一旦移除层析柱盖子，样品将在重力作用下流经树脂；5 mL 样品将在 10 分钟内完全流过层析柱。</li>
	<li>用一个新的 15 mL 圆底离心管收集穿流液。</li>
	<li>使用移液管将收集的穿流液再次加样至树脂上，以去除任何分子量低于 700 kDa 的残留物质。</li>
	<li>用一个新的 15 mL 圆底离心管收集穿流液。用 1 mL PBS 洗涤树脂两次，并将洗涤液收集至步骤 4.5 中使用的同一离心管中；最终总体积约为 7 mL。 
	注意：在步骤 4.6 之后，样品体积相对于原始样品稀释了约 35 倍；后续步骤将用于浓缩和减小体积，以获得纯化的外泌体样品。</li>
</ol>
5. 纯化外泌体的浓缩及总蛋白定量
<ol>
	<li>使用前，按照步骤 3.1 所述，用 PBS 冲洗带有 3 kDa 分子量截留值（MWCO）滤膜的超滤装置。</li>
	<li>将步骤 4.6 中的样品加入超滤装置中，在 4 °C 条件下，使用摆桶转子以 3,700 × g 离心。缓冲液将通过滤膜，可弃去。浓缩的外泌体将保留在滤膜上方。持续离心，直至滤膜上方（截留液）体积减少至 200 µL。</li>
	<li>将截留液转移至新的微量离心管中。</li>
	<li>用 200 µL PBS 对滤膜进行冲洗，通过移液枪在膜表面反复吹打 10 次，然后将洗涤液转移至步骤 5.3 中的离心管。此步骤有助于收集残留的外泌体样品。</li>
	<li>加入 PBS 将样品体积调整至 500 µL。通过缓慢上下吹打 10 次混匀。 
	注意：本方案可在此处暂停。样品应于 4 °C 短期保存过夜，或于 -20/-80 °C 长期保存。</li>
	<li>按照试剂盒说明书，采用 BCA 法测定样品的蛋白含量。用 PBS 将样品稀释 1:10 和 1:50，每个样品设两个复孔。 
	注意：若起始样品为 10 mg 血清或血浆总蛋白，经步骤 5.6 纯化后获得的外泌体总蛋白产量平均为 150 µg。若使用血清或血浆以外的样品，可能需要进一步稀释；产量可能因样品类型而异。</li>
</ol>
6. 通过纳米颗粒跟踪分析（NTA）对外泌体进行定量和粒径分析
<ol>
	<li>将5 µg纯化的外泌体（按5.6步骤定量）加入1 mL PBS中，低至中等速度涡旋振荡15秒。
	<ol>
		<li>将样品置于1 mL一次性注射器中。如有条件，将注射器安装在自动注射泵上，设定稀释后的外泌体样品注入速率为30 µL/min。</li>
		<li>使用以下视频采集参数进行纳米颗粒跟踪分析（NTA）：屏幕增益为3–4，相机水平为12–13。</li>
		<li>设定分析程序，对每个样品以恒定流速进行至少30秒的三次技术重复。分析时，将捕获阈值设为5。 
		注意： 自动注射器的使用方法及视频采集参数详见参考文献13。为确保不同样品间的可比性，NTA的捕获和分析参数必须保持一致。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 可溶性蛋白质还原的测定
<ol>
	<li>将1 - 10 µg纯化的外泌体加入SDS上样缓冲液中，使用4 - 12% Bis-Tris凝胶在1× MES SDS电泳缓冲液中进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE），200 V条件下电泳35分钟。以50 V电压转膜1 - 1.5小时，将分离的蛋白质转移至0.2 µm硝酸纤维素膜。按照标准方法进行Western印迹分析，检测白蛋白、载脂蛋白A和B以及外泌体标志物CD63的存在情况。 
	注意： 步骤7.1中所用方法的完整实验方案可参见参考文献14，特别是SP007：聚丙烯酰胺凝胶电泳操作和SP011：Western印迹实验方案。</li>
	<li>按照步骤7.1的方法，对10 µg纯化的外泌体进行PAGE分离，并按照标准建议使用考马斯亮蓝染色法对蛋白条带染色，以观察不同样本间蛋白质的差异及还原情况。 
	注意： 有关针对CD63的Western印迹实验方案的更多细节，可参见Diaz et al.15的描述。</li>
</ol>

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<li>Diaz, G., Wolfe, L. M., Kruh-Garcia, N. A., Dobos, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+Membrane-Associated+Proteins+of+Exosomes+Released+from+Human+Macrophages+after+Mycobacterium+tuberculosis+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Changes in the Membrane-Associated Proteins of Exosomes Released from Human Macrophages after Mycobacterium tuberculosis Infection.</a> Sci Rep. 6, 37975(2016).</li>
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<li>Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 3 Unit 3.22 (2006).</li>
<li>Muller, L., Hong, C. S., Stolz, D. B., Watkins, S. C., Whiteside, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+biologically-active+exosomes+from+human+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Isolation of biologically-active exosomes from human plasma.</a> J Immunol Methods. 411, 55-65 (2014).</li>
<li>Böing, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-step+isolation+of+extracellular+vesicles+by+size-exclusion+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Single-step isolation of extracellular vesicles by size-exclusion chromatography.</a> J Extracell Vesicles. 3, (2014).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

一种优化的血液外泌体纯化与得率提升方法将增强准确挖掘细胞外囊泡作为多种疾病生物标志物来源的能力。目前用于分离外泌体的标准方法，特别是超速离心法和沉淀法，存在若干缺点，包括外泌体聚集以及可溶性蛋白质的共沉淀7,17,18或者，使用SEC在外泌体分离方面已显示出显著改进，可保护外泌体免于聚集，并提高去除常见非外泌体污染物蛋白的效果9,11,18,19。然而，载脂蛋白10，如果仅使用尺寸排阻色谱法（SEC），较大的囊泡及蛋白质聚集体（包括白蛋白）常会与外泌体共同被分离出来。本方案中两个关键步骤有助于克服上述后两种局限性。首先，将血浆或血清样本在18,000 ...

外泌体是一类由人体几乎所有细胞释放的纳米级囊泡（大小范围为30 nm至150 nm），在细胞间通讯过程中发挥重要作用1,2。有趣的是，外泌体的组成会因来源细胞类型以及个体健康状况的不同而发生变化3,4,5。此外，外泌体可从多种生物液体中分离获得，例如唾液、尿液和血液2。由于这些特性，外泌体被认为是疾病生物标志物的良好来源。然而，目前尚无标准化的外泌体分离方法。一些实验室将多步离心法（最终在密度梯度条件下以100,000 × g高速离心）视为外泌体分离的金标准方法。但近期研究表明，超速离心会导致外泌体与可溶性蛋白及其他外泌体发生聚集，同时影响外泌体的完整性，这两者均可能妨碍后续应用6,7。其他常见的外泌体分离方法包括但不限于：基于市售聚乙二醇（PEG）试剂的沉淀法、离心超滤法以及尺寸排阻色谱法（SEC）。使用聚乙二醇（PEG）聚合物的商业试剂通过诱导外泌体沉淀并形成沉淀物来富集外泌体。该方法的局限性在于最终产物中可能残留PEG聚合物，并含有大量非外泌体来源的可溶性蛋白。超滤法利用离心力通过纤维素膜对外泌体进行纯化和浓缩；外泌体被截留在滤膜上方，而较小的杂质和其他蛋白则穿过膜孔7,8。与其它方法类似，离心超滤法在外泌体纯化方面能力有限，因其会同时保留高水平的非外泌体蛋白，包括蛋白复合物和聚集体。最后，SEC纯化利用多孔树脂根据分子大小进行分离。SEC已显示出良好的应用前景，能够克服其他方法中存在的大部分问题，通过捕获绝大多数污染物蛋白并保持外泌体完整性实现高效分离，且其分离过程依赖重力或低压系统7,9。然而，在SEC过程中大分子蛋白聚集体和脂蛋白的共分离10会影响最终外泌体样品的纯度。尽管已有研究评估了某些方法从细胞培养上清液和血浆7，或仅从血浆9,11中纯化外泌体的效果，但目前尚无关于直接比较同一供体来源的血液血浆与血清中外泌体分离方法性能的相关报道。
本文通过比较多种实验流程，重点研究血液外泌体的纯化方法，以确定囊泡富集技术是否可在血浆与血清之间通用。采用纳米颗粒追踪分析和蛋白质印迹法对终产物中外泌体的浓度、纯度及蛋白质组成差异进行定量分析。本方案详述的最终方法可提高囊泡数量并降低非外泌体蛋白水平。尤为重要的是，该方法显著减少了常与外泌体共沉淀的蛋白质（如白蛋白和载脂蛋白）的含量。由于这两种蛋白质在血液中丰度极高，且频繁与外泌体共纯化，导致不同&#34;纯化&#34;样品之间存在不一致性，从而影响下游分析结果。本方案使用一种市售的尺寸排阻色谱（SEC）树脂；该树脂由多孔微珠组成，分子量小于700 kDa的蛋白质可进入微珠内部，并被辛胺配体捕获保留。流出液则包含外泌体及分子量大于700 kDa的分子12。此外，为进一步减少逃避微珠捕获的蛋白聚集体和载脂蛋白，我们在实验流程中加入了蛋白酶消化步骤。目前尚无单一技术能够在最大化外泌体得率的同时有效降低共纯化的非外泌体蛋白。本研究表明，将蛋白酶消化预处理与多种回收和纯化方法相结合的纯化方案，可用于提高从血清和血浆中提取外泌体的得率和纯度。

<table><tbody><tr><td>纳米颗粒追踪分析仪</td><td>Malvern</td><td>NS300</td><td></td></tr><tr><td>台式微量离心机&amp;nbsp;</td><td>Thermo</td><td>Legend Mico21</td><td></td></tr><tr><td>台式离心机&amp;nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>Allegra 6R</td><td></td></tr><tr><td>水浴锅&amp;nbsp;</td><td>Benchmark</td><td>B2000-4</td><td></td></tr><tr><td>酶标仪</td><td>BIOTEK</td><td>Epoch</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA 蛋白检测试剂盒</td><td>THERMO</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>微量 BCA 蛋白检测试剂盒</td><td>THERMO</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>96 孔板</td><td>Corning</td><td>15705-066</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-0.5 离心过滤单元（含 Ultracel-100 膜）</td><td>EMD-Millipore</td><td>UFC510096</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-4 离心过滤单元</td><td>EMD-Millipore</td><td>UFC800324</td><td></td></tr><tr><td>Capto Core 700</td><td>GE Healthcare</td><td>17548103</td><td></td></tr><tr><td>Poly-Prep&amp;nbsp;层析柱</td><td>BIORAD</td><td>7311550</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris 蛋白凝胶</td><td>THERMO</td><td>NP0323BOX</td><td></td></tr><tr><td>硝酸纤维素膜，卷状，0.2 &amp;micro;m</td><td>BIORAD</td><td>1620112</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶 K，&amp;nbsp;&lt;em&gt;Tritirachium album&lt;/em&gt;</td><td>EMD-Millipore</td><td>539480</td><td></td></tr><tr><td>SimplyBlue SafeStain</td><td>THERMO</td><td>LC6065</td><td></td></tr><tr><td>SIGMAFAST&amp;nbsp;BCIP/NBT</td><td>Millipore-SIGMA</td><td>B5655</td><td></td></tr><tr><td>4-氯-1-萘酚</td><td>Millipore-SIGMA</td><td>C6788</td><td></td></tr><tr><td>抗 CD63 抗体（兔抗人）及羊抗兔 HRP 二抗</td><td>SYSTEM BIOSCIENCES</td><td>EXOAB-CD63A-1</td><td>一抗和二抗</td></tr><tr><td>ALB 抗体 (F-10)</td><td>SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC.</td><td>sc-271605</td><td>一抗</td></tr><tr><td>apoB 抗体 (C1.4)</td><td>SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC.</td><td>sc-13538</td><td>一抗</td></tr><tr><td>apoA-I 抗体 (B-10)</td><td>SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC.</td><td>sc-376818</td><td>一抗</td></tr></tbody></table>

蛋白质消化、超滤和尺寸排阻色谱法优化人血浆和血清中外泌体的分离

Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum

外泌体是一类由所有细胞类型释放的纳米级囊泡，可从任何体液中分离获得。外泌体的内容物（包括蛋白质和RNA）具有其来源细胞的独特特征，可作为疾病指示标志物。目前常用的多种富集方法（如超速离心法）所获得的外泌体通常含有可溶性蛋白质污染物。我们发现，血液中最丰富的蛋白质常常与外泌体共同纯化，干扰下游的蛋白质组学研究，阻碍低丰度生物标志物候选分子的鉴定。另一个令人关注的问题是，由于非外泌体来源蛋白质水平不一致，导致外泌体蛋白质定量结果不可重复。本文详述的实验方案旨在去除与外泌体共同纯化的非外泌体蛋白质，从而提高外泌体纯化的严谨性。本研究使用五名供体配对的血浆和血清样本，比较了五种方法。通过纳米颗粒追踪分析和微定量双辛可宁酸蛋白测定法分析发现，结合超滤和尺寸排阻色谱的联合方案可实现最佳的囊泡富集效果和可溶性蛋白质去除效果。采用蛋白质印迹法验证证实，预期存在的高丰度血液蛋白（包括白蛋白和载脂蛋白）已被有效去除。

以下数据来自五名健康献血者的配对血浆和血清样本。为确定每个处理步骤的影响，对本方案进行了五种不同变体的操作，并比较了外泌体回收率及非外泌体蛋白的去除效果。试验的方法包括：1）700 kDa 尺寸排阻层析（SEC）+ 3 kDa 超滤；2）100 kDa 超滤；3）蛋白酶K处理 + 100 kDa 超滤；4）700 kDa 尺寸排阻层析 + 100 kDa 超滤；以及 5）蛋白酶K处理 + 100 kDa 超滤 + 700 kDa 尺寸排阻层析 + 3 kDa 超滤。
总体而言，使用 SEC 700 kDa 方法（1、4 和 5）在两种样本类型（血清和血浆）中每微克蛋白所产生的囊泡数量均显著更高（图 1A-B）。然而，方法 5 在血浆中每微克蛋白所产生的囊泡数量显著高于血清（图 1C）。相反，采用基于 ...

本文介绍了一种从血浆和血清中纯化外泌体的方案，可显著减少非外泌体血液蛋白的共纯化。优化后的方案包括超滤、蛋白酶处理和尺寸排阻色谱。外泌体的高效纯化有助于后续分析，包括对外泌体更准确的定量以及蛋白质组学表征。

外泌体是一类由所有细胞类型释放的纳米级囊泡，可从任何体液中分离获得。外泌体的内容物包括蛋白质和……

本实验的总体目标是从血液中纯化囊泡，同时减少共纯化的蛋白质和复合物，这些杂质可能干扰后续分析，包括纳米颗粒追踪和蛋白质组学分析。该方法有助于回答一些关键科学问题，例如在疾病状态下与健康状态相比，血清或血浆囊泡的蛋白质组学特征发生了哪些变化。该技术的主要优势在于提高了囊泡计数的准确性。通过去除大量非囊泡污染物，我们能够提高对低丰度蛋白及潜在疾病生物标志物的鉴定能力。该方法的应用有助于发现新的诊断性生物标志物，能够在血液等复杂基质中更准确地确定细胞外囊泡的蛋白质组组成。通常，初次进行囊泡纯化的研究人员会遇到困难，因为已发表的技术种类繁多。下游蛋白质组学分析的可重复性会受到大量血清蛋白共纯化的影响。将血清或血浆样本置于4°C冰箱中，在不震荡的条件下静置过夜，以实现样本的平衡。第二天，使用1,000微升移液器将250微升样品分装至微量离心管中。在4°C条件下，以18,000 × g离心30分钟。使用200微升移液器，移除200微升澄清的上清液，并将其加入新的微量离心管中。转移上清液时避免接触任何沉淀物。使用BCA法并按照制造商的说明书测定样品的蛋白含量。进行测定时，用1×磷酸盐缓冲液将样品稀释1:50。每个样本重复检测两次。配制蛋白酶K溶液：先将相应量的蛋白酶K加入锥形管中，用PBS缓冲液定容至终浓度为50微克/毫升，然后在室温下涡旋振荡30秒，重复三次。接下来，向10毫克的样品分装物中加入50微升蛋白酶K溶液，使用200微升移液器轻轻吹打混匀。将样品置于浮管架中，于37摄氏度水浴中孵育30分钟。为防止可能的泄漏，避免将离心管完全浸入水浴中。孵育后，将样品和试管架转移至60摄氏度水浴中10分钟，以灭活蛋白酶K。接下来，使用前用PBS冲洗含有100千道尔顿截留分子量滤膜的超滤装置。用1,000微升移液器向滤膜中加入500微升PBS。在3,700 × g条件下离心装置5分钟后，弃去残留的截留液以及流出液。通过加入 PBS 将样品体积增加至 500 微升。然后将样品移液至预先冲洗的超滤装置中。将超滤装置置于固定角度的台式离心机中，在 3,700 × g 和 4 °C 条件下离心，直至样品体积减少至 50 微升。接着，将 500 微升 PBS 直接加入滤膜上。然后上下吹打 5 次，再按之前的方法进行离心。将最终的 50 微升截留物转移至新的微量离心管中。用200微升PBS冲洗滤膜，上下吹打10次。将洗涤液转移至离心管中。然后，将滤膜 holder 反向置于新的离心管中。以2,000 × g离心5分钟，进行反向旋转回收，以从膜上收集剩余样品。将柱子放入大小合适的支架中。使用1,000 µL移液器，加入850 µL分子量截断值为700 kDa的SEC珠状悬液。打开层析柱底部，让液体流入废液容器中，持续五分钟。排尽液体后，加入 10 µL 磷酸盐缓冲液（PBS）以洗涤树脂。静置 20 分钟，使洗涤液完全从层析柱中排出。将经蛋白酶K浓缩处理的样品放入一个15毫升的锥形管中。用移液管加入PBS，将样品体积调至5毫升。轻轻摇动管子1分钟，使溶液混匀。然后，使用血清移液管将样品缓慢加样至已准备好的层析柱中。用新的15毫升锥形管收集穿流液。将收集的样品再次移至树脂上，以去除任何分子量低于700千道尔顿的残留物质，并用新的15毫升锥形管收集穿流液。每次加入一毫升 PBS 缓冲液，洗涤树脂两次。将流出液收集至一个离心管中。最终总体积约为七毫升。用一个三万道尔顿分子量的超滤装置，按照之前的方法进行冲洗。在摆桶转子中以3,700 ×g、4°C离心。缓冲液将透过滤膜，可弃去。浓缩的外泌体将保留在滤膜上方。离心样品直至滤膜上方的液体体积减少至200 µL。按照制造商的说明书，使用BCA法测定样品的蛋白含量。将五微克纯化的外泌体加入一毫升磷酸盐缓冲液（PBS）中，低中速涡旋震荡15秒。将样品置于一毫升一次性注射器中。如果条件允许，将注射器置于自动注射泵中，以每分钟30微升的速度注入稀释后的外泌体样品。设定分析程序，对每次技术重复使用恒定流速，持续至少30秒，并运行三次技术重复。分析时，将捕获阈值设为5。最后，按照文本方案中所述方法测定可溶性蛋白的减少量。图中显示了纯化血清囊泡的纳米颗粒示踪分析的代表性结果。囊泡大小约为100纳米，符合预期。图中显示的是考马斯亮蓝染色的蛋白质凝胶，比较了粗制血清及尺寸排阻层析（SEC）前后的组分，可见白蛋白及其他非囊泡污染物的减少。Western 印迹显示，在蛋白酶 K 处理和纯化后，外泌体标志蛋白 CD63 仍得以保留。蛋白酶 K 处理步骤旨在降解可溶性蛋白质。CD63 是一种跨膜蛋白，在确定的浓度和孵育时间下对蛋白酶 K 的敏感性较低。此处的蛋白质印迹结果显示了血清白蛋白的减少，血清白蛋白是血液中最丰富的蛋白，也是纯化后常见的共纯化蛋白。一旦掌握，该技术可在六小时内完成。观看本视频后，您应能够充分掌握如何利用离心超滤、蛋白酶消化以及尺寸排阻色谱法从生物液体中分离囊泡。在进行色谱分析和纳米颗粒追踪之前，必须采用BCA法或等效技术进行蛋白质定量。若蛋白质浓度超过本实验方案中注明的水平，实验结果将出现差异。请注意，处理生物液体可能具有极高的危险性，在进行本操作时，必须采取预防措施，例如佩戴个人防护装备，包括手套、实验服和护目镜。在完成本操作后，可进一步采用其他方法，如液相色谱-质谱联用技术，以确定所纯化的囊泡中包含的具体蛋白质。尽管该方法可揭示血液囊泡的组成成分，但也同样适用于其他类型的样本，例如尿液、脑脊液（CSF）或细胞培养上清液。

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