抗磷 girdin 抗体在自由漂浮小鼠空肠 Cryosections 小肠簇细胞中的应用

该染色程序的总体目标是在小鼠空肠冷冻切片中可视化簇状细胞。这种方法可以帮助回答胃肠病学领域的关键问题，例如在寄生虫感染期间哺乳动物肠道中簇状细胞的增殖是如何发生的。该技术的主要优点是组织学经验有限的研究人员可以获得高质量的簇状细胞图像。

首先暴露新鲜福尔马林固定的小鼠尸体的盆腔器官。从肛门切掉直肠的末端，并通过切开肠系膜将肠道与身体分开。为了分离空肠，从胃窦的肛门侧切开 4 厘米的肠，并丢弃剩余小肠的肛门半部分。

将空肠夹成两半，以方便冲洗程序。将 20 毫升 10% 缓冲中性福尔马林溶液装入 20 毫升注射器中，并连接一个去除斜面的 18 号直针。然后，从夹住的空肠的一端注入 10% 缓冲的中性福尔马林溶液，以冲洗出肠道内容物，并固定肠腔表面。

通过注射 PBS 清洗肠腔。然后，用液体明胶溶液冲洗以替换 PBS。使用 6-0 尼龙切割缝合线，通过缝合结扎闭合夹住的空肠的一端。

用液体明胶填充空肠，并通过缝合结扎闭合另一端。接下来，在空肠的长度上打四个缝合结。将组织浸泡在 50 毫升 15% 蔗糖和 10% 缓冲中性福尔马林溶液中，在 4 摄氏度下过夜。

第二天，在缝合结处切开空肠，得到三个两端结扎的香肠状空肠块。在冷冻模具中对齐碎片，然后用包埋化合物覆盖。将冷冻模具置于用液氮冷却的异戊烷中。

要准备空肠切片，首先将低温恒温器室温度和物体温度都设置为零下 22 摄氏度。将冷冻的组织块放入低温恒温器室的冷冻模具中至少 15 分钟。15 分钟后，用剃须刀片将块切成两半，露出空肠的横切面。

将块的一半安装在低温恒温器适配器上。将充满明胶的空肠切成 30 微米厚的切片。使用冷冻镊子轻轻地将切片转移到含有 3 毫升 PBS 的 35 毫米培养皿中。

用 3 毫升 PBS-T 洗涤切片 3 次，每次 5 分钟后，将 3 毫升新鲜制备的抗原修复溶液添加到含有自由浮动切片的培养皿中。然后，盖上盖子，用一条乙烯基胶带密封培养皿和盖子之间的间隙，并在 50 摄氏度下在杂交培养箱中孵育 3 小时，不要摇晃。免疫染色后，将 PBS 中染色切片的培养皿转移到立体显微镜中。

将 200 微升 PBS 放入 MAS 编码的白色载玻片中心的液滴中。然后，使用 P200 移液器吸头将一个空肠切片从培养皿转移到液滴中。调整截面对齐后，吸出截面周围所有剩余的 PBS。

加入 20 微升水性封片剂，并在培养基上放置盖玻片。立即用二甲苯基封固剂密封盖玻片边缘，并在开始共聚焦显微镜检查前干燥 2 至 3 小时。空肠的明胶填充物保持圆盘形状并保持绒毛的直立定位。

在没有明胶填充物的情况下，空肠切片容易扭结，使绒毛向后摆动。pY1798 可重复地描绘整个簇状细胞，包括膜、线轴状体的细胞质和强烈染色的管腔尖端，其中稳健的信号浓缩对应于簇状细胞的突出簇。鬼笔环肽对丝状肌动蛋白具有高亲和力，丝状肌动蛋白存在于形成肠刷状边界的微绒毛中。

鬼笔环肽可重现且突出地标记加厚的灌木丛边缘，该边缘对应于从簇中伸出的大量小根。pY1798 信号与显着增厚的鬼笔环肽阳性刷状边界的一致共定位表明，该协议成功识别了簇状细胞，无论它们位于绒毛上还是隐窝中。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在三天内完成。

低发射点明胶、自由漂浮的冷冻切片和低温抗原修复的组合可用于其他项目组织的免疫染色。