Name: 抗磷 girdin 抗体在自由漂浮小鼠空肠 Cryosections 小肠簇细胞中的应用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 26 s
Description: 学习使用抗磷girdin抗体在小鼠空肠冷冻切片中可视化簇细胞的方法。该技术通过明胶填充保持绒毛结构，结合免疫荧光染色和共聚焦显微镜，可在三天内获得高质量图像，适用于寄生虫感染期间胃肠道细胞动态研究。

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我们感谢名古屋大学的Naoya Asai为游离空肠切片低温抗原修复技术的开发提供了宝贵的建议。本研究得到了日本学术振兴会（JSPS）2012年科学研究费补助金（KAKENHI）(C)（JP25460493）和2017年(B)（JP17H04065）、日本科学技术振兴机构（JST）2014年A-STEP补助金（AS251Z02522Q）和2015年A-STEP补助金（AS262Z00715Q），以及武田科学财团2014年武田远景研究补助金（授予M.A.）的资助。

本研究所述所有方法均经爱知人类服务中心发育研究所动物护理与使用委员会批准（申请编号：M-03）。
1. 准备工作
<ol>
	<li>配制 10 L 磷酸盐缓冲液（PBS）：将 32.27 g Na2HPO4·12H2O、4.5 g NaH2PO4·2H2O 和 80.0 g NaCl 溶解于超纯水中，定容至 10 L。溶液于室温（RT）保存。</li>
	<li>配制 200 mL PBS-T：取步骤 1.1 中的 PBS 200 mL，加入 100 µL 聚氧乙烯(10)辛基苯基醚，终浓度为 0.05%（体积比）。室温保存。</li>
	<li>佩戴手套和护目镜，配制 50 mL 15% 蔗糖的 10% 缓冲中性福尔马林溶液：将 7.5 g 蔗糖加入 10% 缓冲中性福尔马林溶液（材料表）中，定容至 50 mL。室温保存。 
	注意：吸入和/或皮肤/眼睛接触 10% 缓冲中性福尔马林溶液中的甲醛可能具有危害性。操作时需谨慎。</li>
	<li>配制 1.5 mL 浓度为 200 单位/mL 的鬼笔环肽-荧光染料偶联物储备液：将鬼笔环肽-荧光染料偶联物（每瓶 300 单位，冻干粉，激发波长和发射波长分别为 581 nm 和 609 nm）溶于 1.5 mL 甲醇中。溶液避光保存于 -20 °C。</li>
	<li>配制 5 mg/mL 4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）储备液：将 10 mg DAPI 溶于 2 mL N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中。溶液避光保存于 -20 °C。</li>
	<li>配制 PBS 中 5% 牛血清白蛋白（BSA）溶液：将 0.5 g BSA 溶于 10 mL PBS 中。4 °C 保存。</li>
	<li>使用剪钳去除 18 号直针的斜面针尖，并用镊子沿纵向夹压剪断端，使液体可通过针管内腔（图 1A1）。 
	注意：此处可暂停实验流程。</li>
</ol>
2. 动物解剖与空肠的分离
<ol>
	<li>小鼠灌注固定
	<ol>
		<li>佩戴手套并在通风良好的区域操作。</li>
		<li>准备一个100 mL玻璃烧杯、10%缓冲中性甲醛溶液、手术器械（剪刀、镊子）、金属托盘、6-0尼龙剪线缝合线、按1.7步骤准备的18号直针、22号带翼针头和20 mL注射器。</li>
		<li>从玻璃烧杯中吸取20 mL 10%中性缓冲福尔马林溶液至20 mL注射器中，并将22号带翼针头连接至注射器出口端。</li>
		<li>在50 mL离心管中，将1 g明胶粉末加入20 mL PBS中（终浓度为5%明胶），配制液态明胶。室温浸泡15 min后，于50 °C水浴中孵育15 min，期间不振荡。</li>
		<li>短暂涡旋混匀，50 °C 孵育 15 分钟以彻底溶解明胶。将离心管置于室温下备用。</li>
		<li>通过颈椎脱位法处死成年小鼠。</li>
		<li>将2.1.6步骤中的小鼠置于金属托盘上，使用手术工具通过剑突软骨在皮肤上做一个小切口。</li>
		<li>用双手撑开切口，暴露胸腔和腹腔区域。</li>
		<li>切开腹膜以暴露膈肌，然后在两侧切开膈肌。</li>
		<li>沿两侧前腋线切开胸廓，然后在胸腺位置横向切断，去除胸壁以暴露心脏。</li>
		<li>在右心房耳部做一小切口以排出血液，将22号翼状针头插入左心室心尖处。推动针栓，用10%中性缓冲甲醛溶液灌注组织。</li>
		<li>暴露盆腔器官后，从肛门处切断直肠末端，并通过切断肠系膜将肠道与身体分离。</li>
		<li>为分离空肠，从胃窦肛侧端起沿肠道截取4 cm处切断。丢弃剩余小肠的肛侧部分。</li>
		<li>将空肠剪成两段，以方便灌注操作。用20 mL注射器吸取20 mL 10%中性缓冲福尔马林溶液，并将步骤1.7中准备好的18号直针头连接至出口处。</li>
		<li>从剪下的空肠一端注入10%中性缓冲甲醛溶液，以冲洗肠腔内容物并固定肠腔内表面（图1A2).</li>
		<li>按照步骤2.1.15所述，通过注射PBS清洗肠腔。</li>
		<li>按照步骤2.1.15所述，将液态明胶灌注至肠腔中，以置换PBS。</li>
		<li>用6-0尼龙剪断缝线通过缝合结扎封闭夹闭的空肠一端，向空肠内注入液态明胶，再通过缝合结扎封闭另一端（图1A3).</li>
		<li>在冷冻模具的凹陷处，用四个缝合结将一段香肠状的空肠固定就位图1A4). 
		注意：对于具有 20 mm × 25 mm × 5 mm 凹陷区域的冷冻模具，建议使用长约 20 mm 的香肠状空肠节段。</li>
		<li>将组织浸泡于含有15%蔗糖的50 mL 10%中性缓冲甲醛溶液中，4 °C条件下过夜。 
		注意：这些步骤通过蔗糖实现冷冻保护，并通过甲醛实现明胶及组织的蛋白质固定。经甲醛固定的明胶化明胶在室温下不会融化，而未经固定的明胶化明胶在4 °C保存时，于室温下会融化。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 明胶填充空肠组织的速冻
<ol>
	<li>在缝合结处剪断空肠，获得三个两端结扎的香肠状空肠组织片段（图1A4）。将香肠状片段排列于冷冻模具中，加入包埋剂以制备冷冻组织标本。</li>
	<li>将冷冻模具置于液氮冷却的异戊烷中进行速冻。将冷冻模具储存于 -80 °C。
	 
	注意：此步骤可暂停。</li>
</ol>
4. 使用游离冰冻切片对簇细胞进行免疫荧光染色
<ol>
	<li>冷冻切片
	<ol>
		<li>将冷冻切片机腔室温度（CT）和样品温度（OT）均设定为 -22 °C。将冷冻的组织块放入冷冻切片机腔室内的冷冻模具中，至少放置 15 分钟。</li>
		<li>向一个 35 mm 培养皿中加入 3 mL PBS。</li>
		<li>从冷冻模具中取出冷冻组织块，用剃刀片将其切成两半，以暴露空肠的横截面。将其中一半组织块固定在持样夹（冷冻切片机适配器）上，以便用剃刀片对切割平面进行修整。</li>
		<li>将充满明胶的空肠组织切成 30 µm 厚的切片。使用冷冻镊子小心地将切片转移至步骤 4.1.2 中准备好的 35 mm 培养皿中（图 2B，右图）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>一抗孵育
	<ol>
		<li>在 35 mm 培养皿中用 3 mL PBS-T 对游离切片进行洗涤，温和振荡（约 36 次/分钟），每次 5 分钟，共洗 3 次。</li>
		<li>配制抗原修复液：将 0.3 mL 抗原修复液浓缩液（材料表）加入 2.7 mL 超纯水中。向含有游离切片的 35 mm 培养皿中加入 3 mL 抗原修复液。</li>
		<li>盖上盖子，用乙烯基胶带密封培养皿与盖子之间的缝隙，在杂交孵育箱中于 50 °C 孵育 3 小时，期间不振荡。</li>
		<li>从孵育箱中取出培养皿，在室温下冷却 20 分钟。撕去乙烯基胶带后，用 3 mL PBS-T 在温和振荡条件下洗涤切片，每次 5 分钟，共洗 3 次。</li>
		<li>吸除 PBS-T，向切片上滴加 5 滴封闭液（材料表），在室温下轻轻振荡孵育 5 分钟。</li>
		<li>配制一抗溶液：将 5 µL 磷酸化-Y1798 Girdin（pY1798）抗体（材料表）加入 495 µL 含 5% BSA 的 PBS 溶液中。将 500 µL 一抗溶液加至切片上（无需去除封闭液）。</li>
		<li>将培养皿置于湿化孵育盒中，在 4 °C 下轻轻振荡过夜孵育。 
		注：过夜孵育时间可延长至最多三个夜晚。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>二抗孵育
	<ol>
		<li>用 3 mL PBS-T 在温和振荡条件下洗涤切片，每次 5 分钟，共洗 3 次。</li>
		<li>配制稀释的 DAPI 储存液：取 2 µL DAPI 储存液（步骤 1.5），加入 998 µL PBS。</li>
		<li>配制二抗溶液：476 µL 含 5% BSA 的 PBS 溶液、10.5 µL 稀释后的 DAPI 溶液、12.5 µL 鬼笔环肽-荧光染料偶联物储存液、1 µL 山羊抗兔 IgG-荧光染料偶联物（激发波长：496 nm，发射波长：520 nm）。</li>
		<li>吸除 PBS-T 后，加入二抗溶液，置于避光孵育盒中，在室温下轻轻振荡孵育 30 分钟。</li>
		<li>用 3 mL PBS-T 在温和振荡条件下洗涤切片，每次 5 分钟，共洗 3 次。</li>
		<li>最后一次洗涤后，吸除 PBS-T，替换为 3 mL 不含聚氧乙烯(10)辛基苯基醚的 PBS。将培养皿转移至体视显微镜下。</li>
		<li>在 MAS 涂层白色玻片中央滴加 200 µL PBS，使用 P200 移液器吸头将一个空肠切片从培养皿转移至液滴中。</li>
		<li>在体视显微镜下调整切片位置后，吸除切片周围残留的所有 PBS。</li>
		<li>加入 20 µL 水溶性封片剂，再将一块 20 × 20 mm 的盖玻片覆盖在封片剂上。</li>
		<li>立即使用含二甲苯的封片剂密封盖玻片边缘。将玻片置于木制载片架上，在室温下静置 2–3 小时，使含二甲苯的封片剂固化。 
		注：本方案可在此处暂停。待含二甲苯的封片剂完全固化后，玻片可在室温下避光保存于玻片盒中，保存时间为 2–3 周。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 共聚焦显微镜
<ol>
	<li>在共聚焦显微镜的63倍物镜上滴加镜油。将盖玻片朝下翻转，然后将玻片放置在载物台上。</li>
	<li>对在405、488和555 nm激光波长下获取的透射光（TC）图像进行数字化处理，并将图像保存为TIFF格式（.tiff）。 
	注意：选择适合荧光染料的检测滤光片组（即激发/发射最大值：358/461 nm、490/525 nm和590/617 nm）。</li>
</ol>

<ol><li>Kuga, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tyrosine+phosphorylation+of+an+actin-binding+protein+Girdin+specifically+marks+tuft+cells+in+human+and+mouse+gut%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Tyrosine phosphorylation of an actin-binding protein Girdin specifically marks tuft cells in human and mouse gut.</a> J Histochem Cytochem. 65 (6), 347-366 (2017).</li>
<li>Jarvi, O., Keyrilainen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+cellular+structures+of+the+epithelial+invasions+in+the+glandular+stomach+of+mice+caused+by+intramural+application+of+20-methylcholantren%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Pathol+Microbiol+Scand+Suppl%22%5BJournal%5D)">On the cellular structures of the epithelial invasions in the glandular stomach of mice caused by intramural application of 20-methylcholantren.</a> Acta Pathol Microbiol Scand Suppl. 39 (Suppl 111), 72-73 (1956).</li>
<li>Enomoto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Akt%2FPKB+regulates+actin+organization+and+cell+motility+via+Girdin%2FAPE%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Akt/PKB regulates actin organization and cell motility via Girdin/APE.</a> Dev Cell. 9 (3), 389-402 (2005).</li>
<li>Asai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Similar+phenotypes+of+Girdin+germ-line+and+conditional+knockout+mice+indicate+a+crucial+role+for+Girdin+in+the+nestin+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Similar phenotypes of Girdin germ-line and conditional knockout mice indicate a crucial role for Girdin in the nestin lineage.</a> Biochem Biophys Res Commun. 426 (4), 533-538 (2012).</li>
<li>Kitamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+VEGF-mediated+angiogenesis+by+the+Akt%2FPKB+substrate+Girdin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of VEGF-mediated angiogenesis by the Akt/PKB substrate Girdin.</a> Nat Cell Biol. 10 (3), 329-337 (2008).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Girdin+is+an+intrinsic+regulator+of+neuroblast+chain+migration+in+the+rostral+migratory+stream+of+the+postnatal+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Girdin is an intrinsic regulator of neuroblast chain migration in the rostral migratory stream of the postnatal brain.</a> J Neurosci. 31 (22), 8109-8122 (2011).</li>
<li>Nahorski, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCDC88A+mutations+cause+PEHO-like+syndrome+in+humans+and+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">CCDC88A mutations cause PEHO-like syndrome in humans and mouse.</a> Brain. 139 (Pt 4), 1036-1044 (2016).</li>
<li>Lin, C., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21954290">Tyrosine Phosphorylation of the G alpha-Interacting Protein GIV Promotes Activation of Phosphoinositide 3-Kinase During Cell Migration.</a> Science signaling. 4 (192), ra64(2011).</li>
<li>Omori, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Girdin+is+phosphorylated+on+tyrosine+1798+when+associated+with+structures+required+for+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Girdin is phosphorylated on tyrosine 1798 when associated with structures required for migration.</a> Biochem Biophys Res Commun. 458 (4), 934-940 (2015).</li>
<li>Goto, H., Inagaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+a+site-+and+phosphorylation+state-specific+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Production of a site- and phosphorylation state-specific antibody.</a> Nat Protoc. 2 (10), 2574-2581 (2007).</li>
<li>Wulf, E., Deboben, A., Bautz, F. A., Faulstich, H., Wieland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+phallotoxin%2C+a+tool+for+the+visualization+of+cellular+actin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Fluorescent phallotoxin, a tool for the visualization of cellular actin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4498-4502 (1979).</li>
<li>Jiao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+sensitive+antigen+retrieval+method+for+free-floating+and+slide-mounted+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple and sensitive antigen retrieval method for free-floating and slide-mounted tissue sections.</a> J Neurosci Methods. 93 (2), 149-162 (1999).</li>
<li>Feltkamp-Vroom, T. M., Boode, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+embedding+and+sectioning+technique+for+immunohistochemical+studies+of+minute+specimens+of+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">An embedding and sectioning technique for immunohistochemical studies of minute specimens of tissue.</a> J Clin Pathol. 23 (2), 188-189 (1970).</li>
<li>Ushida, K. <a target="_blank" href="http://www.nibb.ac.jp/pamtbr/?active_action=repository_view_main_item_detail&page_id=15&block_id=15&item_id=1787&item_no=1">Pre-embedding technique with low melting temperature gelatin for preparation of histological sections.</a> Proceeding of the Annual Meeting on Technologies in Biological Research. 36, 66-69 (2014).</li>
<li>Howitt, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuft+cells%2C+taste-chemosensory+cells%2C+orchestrate+parasite+type+2+immunity+in+the+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tuft cells, taste-chemosensory cells, orchestrate parasite type 2 immunity in the gut.</a> Science. 351 (6279), 1329-1333 (2016).</li>
<li>von Moltke, J., Ji, M., Liang, H. E., Locksley, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuft-cell-derived+IL-25+regulates+an+intestinal+ILC2-epithelial+response+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tuft-cell-derived IL-25 regulates an intestinal ILC2-epithelial response circuit.</a> Nature. 529 (7585), 221-225 (2016).</li>
<li>Gerbe, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+epithelial+tuft+cells+initiate+type+2+mucosal+immunity+to+helminth+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Intestinal epithelial tuft cells initiate type 2 mucosal immunity to helminth parasites.</a> Nature. 529 (7585), 226-230 (2016).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案旨在使无组织学经验的研究人员能够获得可靠的簇细胞（tuft cells, TCs）图像。本方案有三个关键点：1）使用针对人girdin蛋白在酪氨酸1798位点磷酸化（pY1798抗体）的位点及磷酸化状态特异性兔多克隆抗体，该抗体由特定公司（Immuno-Biological Laboratories = Company X）提供；2）空肠腔内明胶灌注；3）低温抗原修复。从广义上讲，磷酸化状态特异性抗体可归类为修饰特异性抗体，其能够识别特定类型的翻译后修饰例如 乙酰化、甲基化或磷酸化）在特定氨基酸残基上的修饰。Omori 等 公司X与研究团队通过用磷酸化肽免疫兔子，并采用Goto方法以非磷酸化肽进行固相层析纯化，共同制备了pY1798抗体9,10pY1798 抗体经过了充分验证 体外 使用在酪氨酸1798位点带有或不带有点突变的全长人源Girdin表达载体进行磷酸化检测9。随后，Kuga 等 发现公司X的pY1798抗体是肠嗜铬细胞（TCs）特异且敏感的标志物1因此，在本方案中加入公司X的pY1798抗体是关键步骤。
明胶含有从动物组织中提取的胶原蛋白，长期以来被用于包埋组织样本，以便通过冷冻切片进行组织化学研究13。低熔点明胶在4 °C时呈凝胶状态，而在室温下熔化，其应用始于避免包埋过程中因维持明胶液态所需的加热带来的不利影响14。在本实验方案中，使用由在4 °C凝胶化、室温熔化的明胶粉末制备的低熔点明胶，以保存小鼠空肠横切冷冻切片的形态结构。当该明胶完全填充空肠后，样本经甲醛固定以实现不可逆的明胶凝胶化。热诱导抗原修复是一种有效暴露被含醛固定剂遮蔽抗原的方法12。然而，常用于石蜡切片分析的高温条件（95–99 °C，30分钟）可能会破坏组织/明胶复合物的形态结构。本文采用低温抗原修复方法（50 °C，3小时），既可实现抗原修复，又能保持组织形态的完整性。
pY1798 抗体不仅可以在小鼠空肠中标记 TC 细胞，还可以在小鼠和人类的多种器官（胃、回肠、结肠和胆囊）中标记 TC 细胞1。然而，由于任何组织未固定的样本中 pY1798 信号会迅速降解，本实验方案包含向空肠腔内注射甲醛（步骤 2.1.15，图 1A2）。
游离漂浮冷冻切片的厚度存在一定的局限性。尽管较薄的冷冻切片在显微镜观察时具有更好的透光性，但其物理强度较差，容易破损。相比之下，较厚的冷冻切片物理稳定性较好，但抗体渗透能力较低。在本实验方案中，采用了30 µm厚的切片，该厚度在保证物理稳定性的同时，也具有良好的抗体渗透性。尽管本方法主要面向组织学经验有限的研究人员设计，但如果该方案失败，可参考Kuga et al. 所采用的方法进行类似pY1798/villin/DAPI三重染色的石蜡切片实验1。本研究未采用石蜡切片，以避免F-肌动蛋白在石蜡切片中进行鬼笔环肽染色时可能遇到的技术困难。
由于靠近girdin酪氨酸-1798位点的氨基酸序列在不同物种间具有保守性，因此pY1798抗体可用于除小鼠外其他物种（包括大鼠和人类）中TCs的染色。本实验方案中使用的明胶灌注法也可适用于其他中空器官。事实上，除了pY1798或TC外，明胶灌注结合低温抗原修复的方法可能有助于暴露小鼠肠道中 notoriously &#34;difficult&#34; 的表位，因此可能引起众多研究人员的关注。
girdin 的生物学功能及其在 TCs 中磷酸化的意义尚不明确。然而，Lin et al. 的一项研究表明，girdin 的酪氨酸磷酸化与 F-actin 聚合程度相关8。与此同时，Kuga et al. 发现，致死剂量的凋亡诱导剂（例如，顺铂、X 射线辐射）会导致小鼠小肠中 TCs 的相对频率显著升高，他们推测这可能与肠上皮细胞向 TCs 的潜在转化有关，并伴随微绒毛中 girdin 的磷酸化1。这一可能性尚需未来进一步研究验证。最近有三个研究团队观察到寄生虫感染后 TCs 频率迅速升高15,16,17。因此，这种游离漂浮染色法不仅可用于分析内镜采集的人肠道组织，TCs 的积聚还有助于诊断人类肠道寄生虫感染。

簇细胞（TCs）是胃肠道上皮中数量稀少且分散分布的细胞成分，其特征为顶端具有毛刷状突起和纺锤形的胞体1。尽管簇细胞早在1956年即被首次描述2，但由于缺乏可靠的簇细胞标志物，其功能至今仍不明确。
Enomoto 等 首次表征了肌动蛋白结合蛋白girdin3在神经系统以及血管、心瓣膜、肌腱和骨骼肌等非神经组织中均有表达4. 缺失girdin基因的小鼠表现出生长迟缓和多种脑部异常4,5,6同时，人类girdin基因的功能缺失突变与进行性脑病、严重智力迟滞以及早发性癫痫发作相关。7.
2011年，Lin 等发现，在EGFR和Src等酪氨酸激酶的作用下，girdin蛋白在酪氨酸1798位点（Y1798）发生动态磷酸化8。他们还证明，磷酸化的girdin对于触发细胞迁移的肌动蛋白重塑是必需的8。Omori 等依据Goto的实验方案，开发了针对人源girdin在酪氨酸1798位点磷酸化（pY1798抗体）的位点特异性和磷酸化状态特异性抗体，并利用携带全长girdin的表达载体进行定点诱变实验对这些抗体进行了验证9,10。2017年，Kuga 等报道pY1798可高特异性、高灵敏度地标记纤毛细胞（TCs）1。pY1798抗体因其优异的染色特性，被证实优于以往的TC标志物，能够清晰显示整个细胞形态，包括管腔顶端特有的“簇状”结构；然而，girdin及磷酸化girdin在TC功能中的生物学作用仍不明确1。
本研究中描述的方法涉及免疫荧光染色，这是一种组织学技术，通过使用针对目标蛋白的一抗以及针对一抗的荧光标记二抗，在组织上标记特定蛋白。该方法的目的是使组织学经验有限的研究人员也能获得高质量的肠绒毛（TC）图像。本方案采用游离漂浮式冷冻切片，避免了使用载玻片支撑的冷冻切片或石蜡切片的需要。然而，由于缺乏玻璃载片的支撑，游离漂浮切片较为脆弱，且切片厚度可能降低抗体的渗透性。本方案包含两种克服上述问题的方法：1）用明胶完全填充空肠腔，以在染色过程中保持游离漂浮切片的形态结构；2）采用低温抗原修复以增强pY1798信号。

<table><tbody><tr><td>Slc:DDY 6周龄雌性小鼠</td><td>Chubu Kagaku Shizai</td><td>不适用</td><td></td></tr><tr><td>十二水合磷酸氢二钠 (Na2HPO4·12H2O)</td><td>Wako</td><td>196-02835</td><td></td></tr><tr><td>二水合磷酸二氢钠 (NaH2PO4·2H2O)</td><td>Wako</td><td>199-02825</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠 (NaCl)</td><td>Wako</td><td>199-10665</td><td></td></tr><tr><td>曲拉通 X-100，&amp;nbsp;聚氧乙烯(10)辛基苯基醚</td><td>Katayama Chemical</td><td>不适用</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Wako</td><td>190-00013</td><td></td></tr><tr><td>10% 缓冲中性甲醛溶液</td><td>Muto Chemical</td><td>20215</td><td>步骤 1.3.</td></tr><tr><td>鬼笔环肽-荧光染料偶联物，Alexa Fluor 594 标记鬼笔环肽</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A12381</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Nacalai Tesque</td><td>21915-35</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-二脒基-2-苯基吲哚，盐酸盐)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>N,N-二甲基甲酰胺 (DMF)</td><td>Nacalai Tesque</td><td>13015-75</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma</td><td>A9647-10G</td><td></td></tr><tr><td>18号不锈钢直针</td><td>Terumo</td><td>NN-1838R</td><td></td></tr><tr><td>U.S.P. 6-0，60 cm 尼龙切割缝线，Crownjun</td><td>Kono Seisakusho</td><td>不适用</td><td></td></tr><tr><td>22号带翼针头</td><td>Terumo</td><td>SV-22DLK</td><td></td></tr><tr><td>20 mL TERUMO 注射器</td><td>Terumo</td><td>SS-20ES</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 离心管</td><td>TPP</td><td>91050</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Iwaki 离心管</td><td>Iwaki</td><td>2325-015</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 微量离心管</td><td>Star</td><td>RSV-MTT1.5</td><td></td></tr><tr><td>明胶粉，Gelare-blanc</td><td>Nitta Biolab</td><td>2809</td><td></td></tr><tr><td>冷冻组织标本包埋剂，O.C.T. Compound 118 mL 12支装</td><td>Sakura FineTech</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>冷冻模具，CRYO DISH No. 3，125个装，孔尺寸 20 x 25 x 5 (mm)</td><td>Shoei Work's</td><td>1101-3</td><td></td></tr><tr><td>异戊烷</td><td>Nacalai Tesque</td><td>26404-75</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 细胞培养皿 35 x 10 mm Easy-Grip</td><td>Corning</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>抗原修复液浓缩液，Target Retrieval Solution pH 9 10倍浓缩液</td><td>Dako</td><td>S2367</td><td>步骤 4.2.2 中的抗原修复液浓缩液</td></tr><tr><td>蛋白阻断剂</td><td>Dako</td><td>X0909</td><td>步骤 4.2.5 中的封闭溶液</td></tr><tr><td>磷酸化-Y1798 girdin (pY1798) 抗体</td><td>Immuno-Biological Laboratories (IBL) = Company X</td><td>28143</td><td>步骤 4.2.6 中的磷酸化-Y1798 girdin 抗体</td></tr><tr><td>山羊抗兔 IgG (H+L) 高度交叉吸附二抗，Alexa Fluor 488 标记</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A11034</td><td></td></tr><tr><td>水性封片剂，Prolong Gold 抗荧光淬灭封片剂</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片，Matsunami 显微盖玻片 22 x 22 mm 100片装 厚度 No.1</td><td>Matsunami Glass</td><td>C022221</td><td></td></tr><tr><td>Entellan New，基于二甲苯的显微镜封片剂</td><td>Merck Millipore</td><td>107961</td><td></td></tr><tr><td>MAS涂层白片载玻片</td><td>Matsunami Glass</td><td>MI-MAS-01</td><td></td></tr><tr><td>木制标本盒 KO型</td><td>Shoei Work's</td><td>99-40007</td><td></td></tr><tr><td>浸油 518 F 无荧光 20 ml</td><td>Zeiss</td><td>444960</td><td></td></tr><tr><td>移液器，Pipetman P (P2, P20, P200, P1000)</td><td>Gilson</td><td>F144801, F123600, F123601, F123602</td><td></td></tr><tr><td>超纯水制备系统</td><td>Advantec</td><td>GS-590</td><td></td></tr><tr><td>塑料手套，Star 丁腈手套</td><td>Star</td><td>RSU-NGVM</td><td></td></tr><tr><td>冷冻切片机</td><td>Leica Microsystems</td><td>CM1950</td><td></td></tr><tr><td>超低温冰箱，SANYO 超低温</td><td>Sanyo</td><td>MDF-382</td><td></td></tr><tr><td>展示用冰箱</td><td>Nihon Freezer</td><td>NC-ME50EC</td><td></td></tr><tr><td>水浴锅，Thermominder SDminiN（用于在50°C下溶解明胶）</td><td>Taitec</td><td>0068750-000</td><td></td></tr><tr><td>杂交孵育箱（用于50°C抗原修复）</td><td>Taitec</td><td>HB-100</td><td></td></tr><tr><td>免疫染色孵育盒</td><td>Cosmo Bio</td><td>10DO</td><td></td></tr><tr><td>免疫组织化学用往复式摇床（室温用）</td><td>Taitec</td><td>NR-1</td><td></td></tr><tr><td>免疫组织化学用往复式摇床（4°C用）</td><td>Tokyo Rika Kikai</td><td>MMS-3010</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜（用于组织操作）</td><td>Olympus</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜（用于图1B）</td><td>Leica Microsystems</td><td>M165FC</td><td></td></tr><tr><td>荧光显微镜（用于图3）</td><td>Nikon</td><td>E800</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦激光扫描显微镜</td><td>Zeiss</td><td>LSM700</td><td></td></tr></tbody></table>

利用抗磷酸化girdin抗体在游离小鼠空肠冷冻切片中可视化肠道簇细胞

Use of Anti-phospho-girdin Antibodies to Visualize Intestinal Tuft Cells in Free-Floating Mouse Jejunum Cryosections

肌动蛋白结合蛋白girdin是一种胞质蛋白，在多种组织中参与触发细胞迁移的肌动蛋白重塑过程。girdin在酪氨酸1798位点（Y1798）可被受体和非受体酪氨酸激酶磷酸化。Omori 等开发了针对人girdin酪氨酸1798位点（pY1798）的位点特异性和磷酸化状态特异性抗体，该抗体仅特异性结合磷酸化的酪氨酸1798，而不结合未磷酸化的酪氨酸1798。pY1798抗体已被用于特异性标记存在于哺乳动物胃肠道组织中的簇细胞（TCs），但这些细胞的功能尚不明确。本实验方案利用pY1798抗体结合免疫荧光技术，可有效可视化空肠中的簇细胞。为确保簇细胞可视化操作的成功与简便，本方案包含两种组织学技术：使用明胶灌注的空肠组织制备游离冷冻切片，以及在50 °C下进行3小时的低温抗原修复。空肠组织中灌注明胶可在整个染色过程中维持游离切片的形态完整性，而低温抗原修复则可确保簇细胞产生强而清晰的信号。成功应用本方案后，可在从绒毛顶端至隐窝区域均观察到pY1798标记的簇细胞。染色后的簇细胞呈线轴状胞体，荧光信号聚集于管腔顶端，对应于突出的“簇状”结构。鬼笔环肽（Phalloidin）染色与pY1798阳性簇细胞在增厚的刷状缘处共定位，对应于从簇细胞“簇状”结构延伸出的根丝样结构。本方案可用于检测经胃肠内窥镜采集的人体活检样本中的簇细胞。此外，近期研究报道，在小鼠寄生虫感染后簇细胞会积累增多，提示本方案可能在人类肠道寄生虫感染的诊断中具有应用潜力。

明胶填充空肠
显示了用明胶填充小鼠空肠的典型操作步骤（图1A)，以及明胶填充的好处（图1B）。简而言之，需移除18号直针的斜面针尖，以防止刺破肠壁（图1A1）。明胶填充通过从一段夹闭的空肠一端注入10%中性缓冲甲醛溶液，以冲洗肠道并固定肠腔表面图1A2) 在填充液态明胶之前 (图1A3). 所得香肠状片段（图1A4) 被包埋、冷冻，并进行横向切片 30 µm- 在冷冻切片机中切取厚切片。若未用明胶填充，空肠切片容易发生弯曲，导致绒毛向后摆动（图1B，左侧）。明胶填充可保持切片的圆形盘状结构，并维持绒毛的直立位置（图1B，正确). 图像清楚地表明，明胶包埋有助于保持游离空肠切片的形态结构。
肠道簇细胞的成功成像
pY1798 抗体可用于多种免疫染色技术，包括点印迹、蛋白质印迹、石蜡切片染色、冷冻切片贴片染色或游离漂浮冷冻切片染色1,9。在本方案中，我们重点采用游离漂浮冷冻切片，利用 pY1798 抗体、鬼笔环肽（phalloidin）和 DAPI 染色对小鼠空肠中的簇细胞（TCs）进行荧光染色，以展示 TCs 的结构特征1。通常情况下，TCs 从绒毛顶端到隐窝区域呈散在分布，密度约为每 100 个上皮细胞中有一个 TC1。代表性结果表明，pY1798 可重复地清晰标记完整的 TCs，包括膜结构、纺锤形胞体的细胞质以及强染的管腔顶端，其中强烈的信号聚集对应于 TCs 向外突出的“簇状”结构1（图 2A-2B）。同时，鬼笔环肽是一种来源于毒伞菌（Amanita phalloides）的毒蕈碱类双环七肽毒素，对丝状肌动蛋白（F-actin）具有高亲和力，而 F-actin 存在于构成肠道刷状缘的微绒毛中11。鬼笔环肽可稳定且显著地标记增厚的刷状缘，该结构对应于从簇状突起延伸出的一束根样结构1。因此，pY1798 信号（纺锤形胞体、管腔顶端的信号聚集）与显著增厚的鬼笔环肽阳性刷状缘之间的一致共定位表明，本方案能够成功识别位于绒毛（图 2A）或隐窝（图 2B）的 TCs。
低温抗原修复对自由漂浮切片的染色有效
在95 - 99 °C下进行基于加热的抗原修复被广泛用于石蜡切片和载玻片贴附冷冻切片的分析。然而，将该方法应用于游离切片时，若不造成损伤则较为困难，因为游离切片通常比由载玻片支撑的贴附切片更为脆弱12。由于在预实验中，使用水浴在50 °C下进行3小时的低温抗原修复并未影响游离空肠切片的形态，因此我们通过盲法测试评估了抗原修复的客观有效性，统计结果证实了低温抗原修复的有效性(图3)。
<img alt="水凝胶形成过程；注射器挤出；明胶比较；显微图像；组织支架。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57475/57475fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 1"> 
图1：小肠节段明胶填充以实现冷冻切片的形态学保存 
(A) 小鼠空肠腔内注射明胶操作步骤的示意图。(A1) 切除18号直针的斜面针尖，以避免刺穿肠壁。(A2) 从夹闭的空肠一端注入10%中性缓冲福尔马林溶液，以冲洗肠内容物并固定肠腔表面。(A3) 将液态明胶注入夹闭的空肠段，并使用6-0尼龙缝线结扎两端 （黑色箭头）。(A4) 在原有缝合结之间 （黑色箭头） 再添加四个缝合结 （白色箭头），形成三段较短的肠段。随后在所示位置 （白色箭头头） 将组织分离为三个香肠状片段。(B) 明胶填充对游离式冷冻切片形态的有益影响。未进行明胶填充时，切片容易发生弯曲，导致绒毛易于向后摆动 （左）；而经明胶填充后，30 µm 厚的切片保持圆盘状，绒毛的直立状态得以维持 （右）。图像采用诺马尔斯基微分干涉对比显微技术拍摄。比例尺：1 mm。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57475/57475fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示上皮细胞中 pY1798、鬼笔环肽和 DAPI 染色的免疫荧光显微图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57475/57475fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2：小鼠小肠簇细胞的代表性荧光图像 
簇细胞（TCs）在绒毛（A）或隐窝（B）中的共聚焦荧光图像，来自游离漂浮的小鼠空肠切片，使用针对酪氨酸1798位点磷酸化的girdin（pY1798，绿色，最佳激发/发射波长490/525 nm）、鬼笔环肽（红色，590/617 nm）和4,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，蓝色，358/461 nm）的位点特异性及磷酸化状态特异性抗体进行染色。低倍镜图像中白色方框包围的区域（比例尺：50 µm）在右侧放大显示（比例尺：10 µm）。无论位置如何（位于绒毛（A）或隐窝（B）），pY1798 抗体均可稳定地标记簇细胞，染色信号出现在纺锤形簇细胞胞体的管腔顶端（箭头）、细胞膜及细胞质中。鬼笔环肽染色中明显增厚的刷状缘（箭头）是簇细胞的另一显著特征。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57475/57475fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="柱状图，可见的pY1798阳性簇细胞，抗原修复效果，统计学显著性P=0.00075。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57475/57475fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 3"> 
图3：低温抗原修复可增强pY1798免疫荧光信号 
通过比较两组实验流程，验证低温抗原修复的有效性。取自同一冷冻组织块的游离漂浮空肠切片（厚度30 µm，n = 13）被分为两组，每组切片分别按照完整实验流程或省略低温抗原修复步骤（步骤4.2.2）的相同流程进行染色。染色完成后，将切片分别贴附于标记有组号的载玻片上，并用遮蔽胶带覆盖载玻片上的原始标签。所有载玻片经随机混排后，在遮蔽胶带上重新编号，随后使用FITC滤光片在荧光显微镜下观察。统计每组中可见的pY1798阳性簇细胞（TCs）总数，并计算平均值，以柱状图形式展示结果（均值 ± 标准差）。采用双尾t检验比较两组间的平均细胞数，P值小于0.05被认为具有统计学显著性。结果显示，低温抗原修复显著提高了pY1798免疫荧光染色的效果。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57475/57475fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

Kuga 等人发现，针对肌动蛋白结合蛋白 girdin 在酪氨酸 1798 位点（pY1798）发生磷酸化的磷酸化状态特异性抗体，可用于标记簇细胞（TCs）。本实验方案通过使用 pY1798 抗体对游离漂浮的空肠冷冻切片进行免疫荧光染色，可实现对 TCs 的稳定可视化。

肌动蛋白结合蛋白girdin是一种胞质蛋白，在多种组织中参与肌动蛋白重塑，从而启动细胞迁移。Girdin是……

本染色实验的总体目标是可视化小鼠空肠冷冻切片中的簇细胞。该方法有助于回答胃肠病学领域的一些关键问题，例如在寄生虫感染期间哺乳动物肠道中簇细胞增殖的过程。该技术的主要优势在于，即使组织学经验有限的研究人员也能获得高质量的簇细胞图像。首先暴露一只新近经甲醛固定的鼠类尸体的盆腔器官。从肛门处切断直肠末端，并通过切断肠系膜将肠道与身体分离。为分离空肠，从胃窦肛侧4厘米处切断肠道，并弃去剩余小肠的肛侧部分。将空肠剪成两半，以方便冲洗操作。取20毫升10%中性缓冲福尔马林溶液注入20毫升注射器中，并连接一支已去除斜面的18号直针。然后从剪开的空肠一端注入10%中性缓冲福尔马林溶液，以冲出肠内容物并固定肠腔表面。通过注射 PBS 清洗肠腔。然后用液体明胶溶液灌注，以置换 PBS。使用6-0尼龙剪断缝线，通过缝合结扎封闭夹闭的空肠一端。用液体明胶填充空肠，并通过缝合结扎封闭另一端。接着，在空肠长度方向上打四个缝合结。将组织浸泡在50毫升含15%蔗糖的10%缓冲中性甲醛溶液中，于4摄氏度下过夜。第二天，在缝合结处剪断空肠，获得三段两端结扎的香肠状空肠组织。将组织段排列于冷冻模具中，覆盖包埋剂。将冷冻模具置于液氮预冷的异戊烷中快速冷冻。 为制备空肠切片，首先将冷冻切片机腔室温度和样品温度均设置为零下22摄氏度。将冷冻的组织块置于冷冻切片机腔室内的冷冻模具中，至少放置15分钟。15分钟后，用剃刀片将组织块切成两半，以暴露空肠的横切面。将半块组织置于冷冻切片机适配器上，将充满明胶的空肠切成30微米厚的切片。使用冷冻镊子轻轻将切片转移至含有3毫升PBS的35毫米培养皿中。用 3 毫升 PBS-T 溶液将切片洗涤三次，每次五分钟。随后，向含有游离切片的培养皿中加入 3 毫升新鲜配制的抗原修复液。然后盖上盖子，用一段乙烯基胶带密封培养皿与盖子之间的缝隙，在杂交孵育箱中于 50 摄氏度孵育三小时，期间不进行振荡。免疫染色完成后，将盛有染色切片的培养皿连同 PBS 一起转移至体视显微镜下观察。在 MAS 编码的白色玻片中央滴加 200 微升 PBS 液滴。然后，使用 P200 移液器吸头将一片空肠组织从培养皿转移至液滴中。调整组织位置对齐后，吸除组织周围所有残留的 PBS。加入 20 µL 水性封片介质，并将盖玻片置于介质上方。立即用含二甲苯的封片介质封固盖玻片边缘，室温静置干燥 2 至 3 小时，然后开始共聚焦显微镜观察。空肠中的明胶填充可保持其圆形盘状结构，并维持绒毛的直立位置。在无明胶填充的情况下，空肠节段容易发生弯曲，导致绒毛向后摆动。pY1798 可重复地清晰标记整个簇细胞，包括细胞膜、纺锤形胞体的细胞质，以及染色强烈的管腔顶端；该顶端的强信号聚集区域对应于簇细胞向外突出的毛发状结构。Phalloidin 对丝状肌动蛋白具有高亲和力，而丝状肌动蛋白存在于构成肠道刷状缘的微绒毛中。鬼笔环肽可稳定且显著地标记对应于从簇状细胞顶端延伸出的根丝束的增厚刷状缘。pY1798信号与显著增厚的鬼笔环肽阳性刷状缘的一致共定位表明，该方案能够成功鉴定位于绒毛或隐窝中的簇状细胞。一旦掌握，若操作得当，该技术可在三天内完成。低荧光点明胶、游离漂浮冷冻切片与低温抗原修复相结合的方法可应用于其他项目组织的免疫染色。

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