电穿孔对小鼠膀胱 Urothelium 质粒 DNA 传递的新方法

该方法的总体目标是在体内将 DNA 质粒递送到活小鼠的膀胱尿路上皮中，用于基因过表达或基因组编辑。这种方法可以帮助回答膀胱癌领域的关键问题，例如不同的基因突变如何促进膀胱癌的进展？该技术的主要优点是它提供了一种快速便捷的方式，可以将基因递送到膀胱中，而不会出现与病毒载体相关的安全问题和技术障碍。

我最初想到了这种方法，即尝试使用任何工程化的相关病毒进行 DNA 递送，这种方法在膀胱中效果不佳。这项技术的影响也可以扩展到基因治疗，因为电穿孔可以实现 DNA 质粒的有效递送到尿路上皮细胞中。演示该程序的是我实验室的 Ofir Stefanson 和 Yueli Liu。

要开始此过程，请高压灭菌所有手术器械并用 70% 乙醇对工作区进行消毒。在执行后续程序时，经常用 70% 乙醇喷洒手术器械和手套，以保持无菌条件。首先，麻醉鼠标并剃除手术区域。

要耗尽尿液，请在导管上涂抹润滑剂并确保其外表面被完全覆盖。接下来，将导管插入小鼠的尿道口，慢慢推动直至到达膀胱。轻轻按压腹部以帮助尿液消耗。

随后，用移液管将尿液倒入废烧杯中，然后将 80 微升 PBS 移液到导管的外端，另一端仍在膀胱中。接下来，小心地将 1 毫米注射器连接到导管上。轻轻推动注射器，将 PBS 注射到膀胱中。

在导管中留下一些 PBS，以避免在膀胱中产生气泡。然后，取出注射器并等待 PBS 从膀胱中排出。轻轻按压腹部以排出 PBS，然后用移液管将导管中的 PBS 丢弃到废烧杯中。

重复 PBS 洗涤 2 次。对于每个要转染的膀胱，以每微升 1 微克的剂量制备至少 20 微升的 DNA 质粒。接下来，将 1 微升台盼蓝加入 20 微升质粒溶液和 1.5 毫升微量离心管中，并移液管混合均匀。

要递送质粒，请将 70% 乙醇涂在腹部。垂直切开 1 厘米，打开膀胱上方的腹部皮肤。接下来，切开肌肉层以露出膀胱。

至少 20 微升质粒加台盼蓝溶液移液到导管的外端，然后将其拆下到注射器上。然后，将质粒溶液注射到膀胱中。如果膀胱变蓝，则注射成功。

在导管中留下一些液体，以避免在膀胱中产生气泡。然后，抓住尿道外口并取出导管和注射器。用绳子收紧尿道外口。

用绳子做两个圈，然后打两个结。这是需要两个人合作的关键步骤。确保打结紧密，这样质粒就不会泄漏出来。

现在，打开电穿孔发生器。用两个电极捏住气囊，然后推动脚踏板进行电穿孔。为了保持膀胱的支撑，可以用镊子捏住腹部切口的后部。

避免镊子和电极之间有任何接触，因为这可能会产生火花。完成后，用无菌手术缝合缝合腹部和皮肤开口。移除琴弦并应用剪辑。

将碘涂抹在伤口上，然后从异氟醚系统中取出动物。皮下注射丁丙诺啡镇痛药以减轻术后疼痛。将动物放在加热垫上，完全康复后将其放回家笼。

每天至少检查一次动物的活动能力、饮水和喂食行为是否正常，并且在切口愈合之前是否有感染迹象。然后，一周后，删除剪辑。如果动物出现疼痛症状，例如梳理减少、攻击性和发声增加，则随后注射丁丙诺啡镇痛药。

为了证明基因成功递送到膀胱尿路上皮中，通过尿道注射 20 μL pCAG-GFP 质粒和台盼蓝溶液，并给予 5 次电脉冲。这里显示的是成功的电穿孔，48 小时后膀胱变绿，而未进行电穿孔的阴性对照膀胱没有显示 GFP 信号。用 CK5 、 CK18 和 GFP 抗体对切片的膀胱组织进行免疫荧光染色。

观察到 GFP 信号存在于伞细胞、中间细胞和基底细胞中，但不存在于肌肉层，表明质粒递送到尿路上皮细胞具有良好的特异性。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在 15 分钟内完成。开发后，这项技术为膀胱癌领域的研究人员构建新的本土小鼠模型来研究疾病进展机制铺平了道路。