通过电穿孔法将质粒DNA递送至小鼠膀胱尿路上皮的新方法

本方法的总体目标是将DNA质粒在活体小鼠体内递送至膀胱尿路上皮，以实现基因过表达或基因组编辑。该方法有助于回答膀胱癌研究领域中的关键问题，例如不同的基因突变如何促进膀胱癌的进展？该技术的主要优势在于，它提供了一种快速且便捷的基因递送方式进入膀胱，同时避免了病毒载体相关的安全顾虑和技术障碍。

我最初提出了这种尝试利用经过改造的关联病毒进行DNA递送的方法，但该方法在膀胱中的效果不佳。由于电穿孔能够高效地将DNA质粒递送至尿路上皮细胞，该技术的应用前景还可拓展至基因治疗领域。本次实验操作将由我实验室的Ofir Stefanson和Yueli Liu进行演示。

开始此操作前，需将所有手术器械进行高压灭菌，并用70%乙醇对工作区域进行消毒。在后续操作过程中，应频繁使用70%乙醇喷洒手术器械和手套，以维持无菌条件。首先，对小鼠实施麻醉，并剃除手术区域的毛发。

为排空尿液，先将润滑剂涂抹于导管上，确保其外表面完全覆盖。接着，将导管插入小鼠的尿道口，并缓慢推进直至到达膀胱。轻压腹部以协助排空尿液。

随后，用移液器将尿液弃入废液杯中，然后用另一端仍留在膀胱中的导管，向其外端加入 80 微升 PBS。接下来，小心地将一个 1 毫升注射器连接到导管上。轻柔推动注射器，将 PBS 注入膀胱。

在导管中保留一些 PBS，以避免在膀胱中产生气泡。随后，取下注射器，等待 PBS 从膀胱中排出。轻轻按压腹部以排空 PBS，然后用移液器将导管中的 PBS 弃入废液杯中。

用 PBS 再重复洗涤两次。每只用于转染的膀胱，准备至少 20 微升浓度为 1 微克/微升的 DNA 质粒。接着，向 20 微升质粒溶液中加入 1 微升台盼蓝，置于 1.5 毫升微量离心管中，并用移液器充分混匀。

为了递送质粒，将70%乙醇涂抹于腹部。在膀胱上方的腹部皮肤做一厘米长的垂直切口。接着，切开肌肉层以暴露膀胱。

将至少20微升质粒与台盼蓝溶液移液至导管的远端，并将其从注射器上取下。然后将质粒溶液注入膀胱。若膀胱变为蓝色，则表明注射成功。

保留导管中的部分液体，以避免在膀胱内产生气泡。随后，夹住尿道外口，拔出导管和注射器。使用细线结扎尿道外口。

用绳子打两个环，然后用两个结系紧。这是需要两人协作的关键步骤。确保结扎紧实，以免质粒泄漏。

现在，打开电穿孔仪。用两个电极夹住膀胱，并踩下脚踏开关进行电穿孔。为保持膀胱固定，可用镊子夹住腹部切口的背面。

避免镊子与电极接触，因为这可能会产生火花。操作完成后，使用无菌外科缝合线缝合腹部和皮肤切口。移除缝线并应用夹子。

将碘涂抹于伤口，然后将动物从异氟烷系统中取出。皮下注射布托啡诺镇痛剂以缓解术后疼痛。将动物保持在加热垫上，待其完全恢复后放回饲养笼中。

每天至少检查动物一次，观察其活动能力、饮水和进食行为是否正常，以及是否有感染迹象，直至伤口愈合。之后一周，移除皮钉。若动物出现疼痛症状，如理毛行为减少、攻击性增强或发声增多，应给予后续的布托啡诺镇痛剂注射。

为了证明成功将基因递送至膀胱尿路上皮，通过尿道注入20微升pCAG-GFP质粒与台盼蓝溶液，并施加了五个电脉冲。图中显示，经过48小时后，成功进行电穿孔的膀胱呈现绿色，而未进行电穿孔的阴性对照膀胱则未显示GFP信号。对切片的膀胱组织进行了免疫荧光染色，所用抗体包括CK5、CK18和GFP抗体。

GFP信号在伞状细胞、中间细胞和基底细胞中均有观察到，但在肌层未见表达，表明质粒递送至尿路上皮具有良好的特异性。一旦掌握，若操作得当，该技术可在15分钟内完成。该技术的建立为膀胱癌领域的研究人员提供了构建新型同源小鼠模型的途径，有助于深入研究疾病进展机制。