使用莱迪思光片显微镜可视化表面 T-Cell 受体动力学四维

莱迪思光片显微镜是一种强大的成像技术，但世界上很少有实验室能够使用它。该协议详细介绍了如何使用市售的晶格光片显微镜。这是一个极其强大的系统，能够对单个细胞或胚胎进行四维成像，能够实时跟踪分子。

该技术的主要优点是，它可以以高时空分辨率和最小的光漂白对单个活细胞或器官进行三维成像。光片的晶格模式使我们能够高速图像样本，并获取具有其他技术无法实现的三维活细胞和器官的实时视频。这第一个视频协议，显示如何格子光片显微镜图像单细胞四维。

由于对齐和样品制备，这是一项非常复杂的技术。我们相信，视觉演示将提高可访问性，让更多的科学家在生物学中对许多不同的分子、细胞和器官进行成像。为了开始这个程序，在室温下孵育5毫米圆形盖玻片，用0.1%聚-L-莱辛孵育10分钟。

吸走液体，让盖玻片自然干燥。接下来，在 15 毫升锥形管中加入三毫升密度梯度。小心地将细胞滴到管的边缘。

在930倍g和4摄氏度的离心机10分钟。在此之后，小心地去除完整介质和密度梯度试剂之间的薄中间层细胞，确保将每种细胞类型放入单独的锥形管中。在300次g下离心5分钟清洗细胞。

丢弃上流水，在T细胞和CH27细胞的管中加入5毫升的RPMI。使用新鲜 RPMI 重复洗涤，直到执行三次总洗涤。然后，用一毫升完整的RPMI重新暂停每个管中的细胞，然后用血细胞计对细胞进行计数。

在500微升完整的RPMI中重新增加100万抗原呈现细胞，并加入10微摩尔MCC。在37摄氏度下孵育，用5%的二氧化碳孵育3小时。在此之后，在 500 微升完整 RPMI 中重新发送 100 万个 T 细胞。

加入两微克的抗 TCR 测试版 Alexa 488 标记 FAB，并在 37 摄氏度下孵育 5%二氧化碳 30 分钟。接下来，将两个细胞在300倍g下离心5分钟，然后丢弃上一代。添加 500 微升完整的 RPMI，并重复离心机清洗细胞。

使用新鲜的 RPMI 重复洗涤，直到每次洗涤后进行三次总洗涤，然后丢弃上经液。在此之后，在 500 微升成像介质中重新发送两种细胞类型。首先，在 LLSM 浴池中加入 10 毫升水和 30 微升荧光素。

按"图像主页"可将对象移动到图像位置，并查看单个贝塞尔激光束图案。使用参考线和预设感兴趣区域对齐激光束，使光束成为在所有方向上平衡的薄型。光束还应在查找器摄像机中聚焦。

使用两个镜面倾斜调节器、顶部对焦千分尺和目标颜色来调节光束。接下来，用至少200毫升的水洗洗浴缸和目标，以完全去除任何荧光素。要对标准荧光珠进行图像成像，请通过在 Xgalvo 范围框中设置为 3 来打开抖动，然后按 Live 查看当前字段。

手动调整倾斜镜、目标颜色和焦点千分尺，以达到最高的灰色值。然后，根据需要进行调整，以获得目标扫描、Z galvo、Z 加目标和样本扫描捕获模式的正确模式。在此之后，按"在样本扫描模式下执行"以收集样本点分布函数，以进行去倾斜和去卷积。

将激光更改为三种颜色模式，然后再次按"执行"。首先，在准备好的5毫米直径的圆形盖玻片中加入10万个抗呈现细胞，让它们沉淀10分钟。润滑样品架，并将盖玻片向上添加到其细胞侧。

接下来，在盖玻片的背面添加一滴成像介质。将样品架拧到压电器上，然后按图像主页。查找抗原呈现细胞以进行图像，并确保 LLSM 和成像软件正常运行。

按"实时"以查看当前图像。沿 Z 移动以查找盖玻片和单元格。通过向 Z 方向移动找到抗原呈现细胞的中心，然后按"停止"暂停激光。

检查 3D 并输入所需的设置。按"中"，然后按"执行"以收集数据。将舞台降到负载位置，并直接在盖玻片上添加 50 微升的 T 细胞和成像介质。

最好让滴在移液器尖端的末端，然后触摸浴液的尖端。单击"图像返回"将舞台升起。开始成像。

确保设置所需的 Z 堆栈和延时长度。例如，图像 60 Z 堆栈的步长为 0.4 微米，并输入 500 个时间帧。在达到 500 帧之前停止录制，以避免照片漂白。

使用实时模式搜索单元格对，当输入就绪和所需的设置时，按"执行"以收集数据。在这项研究中，原发性小鼠5CC7 T细胞被分离和准备，然后使用晶格光片显微镜进行成像。此处显示使用荧光素成像时，正确的光束路径和光束对齐。

目标扫描应在 XZ 和 YZ 投影中显示尽可能对称的大 X 形状。它们也应该调整为尽可能小的 X。Z galvo 扫描应显示 XZ 和 XY 中的椭圆形，两侧都显示单点。

最后，Z 加目标扫描和样本扫描都应显示看起来尽可能圆的点。利用该协议，可以看到T细胞表面T细胞受体的四维动力学。这种显微镜的主要优点在于能够跟踪T细胞受体的可视化表面单位，并可以从其大小、运动、信号强度和排泄物获取量化数据。

要记住的最重要的事情是对齐的质量。晶格光片必须每天对齐，如果这样做不当将导致成像失真。同样，收集的PSF质量直接影响去卷积的质量，最终导致最终图像的质量。

这种方法之所以如此强大，其中一个原因就是每个细胞和标签都可以被替换，以可视化许多细胞类型和分子。因此，此方法可用于回答与分子的四维跟踪相关的任何问题。我们认为，这项技术将为研究人员探索分子贩运领域的新问题铺平道路。

由于复杂的系统，它还没有被广泛使用，所以我们希望这个Jove视频将提高对技术的可访问性。系统中使用的激光器为四级，因此必须绝对小心，以确保激光安全。在使用此方法之前，请进行必要的激光安全培训。