利用基于细胞的检测法检测中和酶替代疗法细胞摄取的抗体

该方法有助于解答免疫原性和生物分析领域中的关键问题，例如中和抗体对药物安全性、有效性以及药代动力学和药效动力学特征的影响。该技术的主要优势在于，它提供了一种灵敏且具有生物学相关性的基于细胞的方法，可对药物特异性的中和抗体进行半定量检测。在该技术中，荧光标记的酶通过甘露糖-6-磷酸残基与非依赖阳离子的甘露糖-6-磷酸受体（CI-M6PR）结合，进入Jurkat细胞。

通过流式细胞术检测，可阻断酶与受体相互作用的中和抗体将导致荧光信号降低。首先，在96孔圆底细胞培养板中，每孔加入100微升细胞培养基，接种7.5 × 10⁴个Jurkat细胞，在37°C、5%二氧化碳及95%湿度条件下培养14至20小时。先用无血清培养基以1:2.5的比例稀释检测样品。

然后将每种样品各 60 µL 加入 96 孔白色圆底非结合性聚丙烯板的相应孔中。此板将作为样品孵育板。对于初筛呈阳性且需要确认的样品，涡旋混匀一瓶酶替代疗法（ERT）磁珠，然后将适量磁珠加入一个 15 mL 圆锥形离心管中，再次进行涡旋处理。

然后将离心管置于磁力架上静置2分钟，小心移除上清液。第四次洗涤后，向新的白色96孔圆底非结合性聚丙烯板的相应孔中加入100微升磁珠。当所有磁珠均加入孔板后，将该板置于96孔侧边磁板上，使磁珠沉降形成沉淀，再小心移除澄清的上清液。

接下来，将每份样品各140微升加入相应的孔中，并用塑料封膜密封，于室温下在约800转/分钟的旋转摇床上振荡至少60分钟。然后将确认板置于96孔侧边带磁铁上，使磁珠形成另一个沉淀，再将60微升样品加入96孔白色圆底非结合性聚丙烯样品孵育板的相应孔中。对于已筛查并确认为阳性的样品，可进行滴度系列实验。

为制备滴度系列，将样品在混合基质中进行连续稀释，稀释次数需足够以跨越预设的滴度临界值；根据文本方案，向样本孵育板的相应孔中加入60 µL每种稀释后的样品，并向新的96孔白色圆底非结合性聚丙烯板的相应孔中加入60 µL适当浓度的荧光标记ERT。随后反复吹打荧光标记ERT样品溶液以充分混匀，并用铝箔包裹各板，在2至8°C条件下孵育14至20小时。次日早晨，将样品板置于37°C珠浴中温育10至15分钟，并在倒置显微镜下检查已接种细胞，确认细胞状态健康且在各孔中分布均匀。

当培养板升温后，根据实验板图，向细胞培养板中加入 100 微升样品和荧光标记的 ERT 混合物，并将细胞放回细胞培养箱中继续孵育 3 小时 15 分钟。孵育结束后，通过离心收集细胞，并确认每个孔底部均有细胞沉淀。将培养板倾斜 30 至 45 度角，小心吸除上清液，避免扰动沉淀，随后每次用 200 微升 DPBS 按每孔每次离心洗涤细胞，共洗涤三次。

最后一次洗涤后，每孔加入 100 微升活死染料，在室温避光条件下孵育 15 分钟。孵育结束后，通过离心收集细胞，并用 200 微升 DPBS 每孔洗涤细胞。将洗涤后的细胞沉淀重悬于每孔 100 微升 2 至 8 摄氏度的 1% 多聚甲醛中，密封培养板后进行轻柔脉冲涡旋振荡。

然后用铝箔包裹培养板，在 2 至 8 摄氏度下固定 10 分钟。为通过流式细胞术分析细胞活力，将细胞与每孔 50 µL 的 DPBS 混合，以获得单细胞悬液，并根据标准流式细胞术方案在流式细胞仪上检测细胞。随后可根据活单细胞的中位荧光强度（MFI）评估荧光素标记的 ERT 摄取情况。

在进行检测之前，需计算实验性筛选临界值，作为判定样本阳性或阴性的阈值。本示例中展示了添加了高浓度或低浓度中和抗体的质量对照样本。随后，阳性样本将使用药物偶联磁珠进行确证性检测，以从样本中去除针对该药物的特异性抗体。

回收率高于确证临界值的样本被视为阳性。经筛查和确证均为阳性的样本将进行连续稀释，并在滴度检测中测定各样本中中和抗体的相对滴度。滴度是指跨越滴度临界值的两个稀释度之间通过插值法计算得到的数值。

如图所示，通过活单细胞的平均荧光强度（MFI）评估了荧光染料偶联的酶替代疗法（ERT）的摄取情况。例如，在本实验中，加入阳性对照抗体的基质抑制了荧光染料偶联ERT的摄取，导致中位荧光强度较低。相反，未添加阳性对照抗体而仅与基质孵育的细胞表现出较高的中位荧光强度，表明其摄取了荧光染料偶联的ERT。

在进行该实验操作时，必须严格遵守孵育时间，以获得可靠且一致的结果。同时，针对每一种酶替代疗法，优化检测方法也至关重要。该技术建立后，为药物研发中的免疫原性和生物分析科学家提供了研究细胞摄取中和抗体对酶替代疗法安全性和有效性影响的新途径。

请注意，处理人类样本可能具有极高的危险性，在进行本实验操作时，所有样本均应被视为可能具有传染性并加以处理。