细胞法检测酶替代疗法中细胞吸收的抗体

该方法可以帮助回答免疫原性和生物分析领域中关于中和抗体对药物安全性、疗效、药代动力学和药效学特征影响的关键问题。该技术的主要优点是它提供了一种灵敏且生物学相关的基于细胞的方法，用于以半定量方式测量药物特异性中和抗体。在这种技术中，荧光团标记的酶通过甘露糖-6-磷酸残基与阳离子非依赖性甘露糖-6-磷酸受体或 CI-M6PR 的结合进入 Jurkat 细胞。

通过流式细胞术测量，阻止酶受体相互作用的中和抗体会诱导荧光减弱。首先，在 96 孔圆底细胞培养板中，将 7.5 乘以 10 至 4 个 Jurkat 细胞接种在每孔 100 微升细胞生长培养基中，在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳和 95% 湿度下孵育 14 至 20 小时。首先在无血清培养基中以 1 比 2.5 的比例稀释检测样品。

然后将每个样品 60 μL 添加到 96 孔白色圆底非结合聚丙烯板的相应孔中。这将是样品孵育板。对于筛查呈阳性且需要确认的样品，涡旋一小瓶酶替代疗法或 ERT 微珠，并将适当数量的微珠添加到 15 毫升锥形管中，以便再次涡旋。

然后将试管置于磁力管架中 2 分钟，并小心去除上清液。第四次洗涤后，将 100 微升珠子添加到新的白色 96 孔圆底非结合聚丙烯板的适当孔中。当所有磁珠都铺板后，将板放在 96 孔侧裙磁力架上，让磁珠形成沉淀，然后小心地去除透明上清液。

接下来，将 140 μL 每个样品加入适当的孔中，并用塑料薄膜密封板，在旋转振荡器上以约 800 RPM 的速度在室温下振荡至少 60 分钟。然后将确认板放在 96 孔侧裙边磁力架上，让珠子形成另一个沉淀，并将 60 微升样品添加到 96 孔白色圆底非结合聚丙烯样品孵育板的相应孔中。对于已筛查并确认为阳性的样本，可以进行滴度测定。

要制备滴度系列，将混合基质中的样品连续稀释足够次数以越过预定的滴度切割点，并将 60 微升每个稀释的样品添加到样品孵育板的适当孔中，并将 60 微升适当浓度的荧光团标记的 ERT 添加到新的 96 孔白色圆底非结合聚丙烯板的适当孔中根据文本方案。然后移液荧光团 ERT 样品溶液数次，混合并用箔纸包裹板，在 2 至 8 摄氏度下孵育 14 至 20 小时。第二天早上，在 37 摄氏度的微珠浴中加热样品板 10 至 15 分钟，然后在倒置显微镜上检查铺板的细胞，以确认细胞健康且均匀分布在孔中。

板加热后，根据实验板图向细胞板中加入 100 微升样品和荧光团标记的 ERT 混合物，然后将细胞放回细胞培养箱中再放置 3 小时 15 分钟。在孵育结束时，通过离心使细胞沉淀，并确认每个孔底部存在沉淀。将板保持在 30 至 45 度角，小心地去除每个孔中的上清液，不要干扰沉淀，每次离心用每孔 200 微升 DPBS 洗涤细胞 3 次。

最后一次洗涤后，向每个孔中加入 100 μL 活死病菌染色剂，在室温下避光孵育 15 分钟。在孵育结束时，通过离心沉淀细胞，并用每孔 200 微升 DPBS 洗涤细胞。将洗涤后的沉淀重悬于每孔 100 微升 2 至 8 摄氏度的 1% 多聚甲醛中，并密封板以进行温和的脉冲涡旋。

然后用铝箔纸包裹板，在 2 到 8 摄氏度下固定 10 分钟。为了通过流式细胞术分析细胞活力，将细胞与每孔 50 μL DPBS 混合以获得单细胞悬液，并根据标准流式细胞术方案在流式细胞仪上读取细胞。然后可以根据活单细胞的中位荧光强度或 MFI 评估荧光团偶联的 ERT 摄取。

在检测之前，计算实验筛选切点作为确定阳性和阴性样品的阈值。在本例中，显示了加标高量或低量中和抗体的质控品。然后使用药物偶联的磁珠在确认测定中检测阳性样品，以耗尽样品中的药物特异性抗体。

回收率大于确认切割点的样品被视为阳性。对筛选和确认阳性的样品进行连续稀释并在滴度测定中进行测试，以确定每个样品中中和抗体的相对滴度。Titer （滴定度） 是跨越滴度切割点的两个稀释度之间的插值。

此处显示的活单细胞 MFI 评估了荧光团偶联的 ERT 摄取。例如，在本实验中，加标阳性对照抗体的基质抑制了荧光团偶联的 ERT 摄取，导致中位荧光强度较低。相比之下，在没有阳性对照抗体的情况下与基质一起孵育的细胞表现出更高的中位荧光强度，表明摄取了荧光团偶联的 ERT。

在尝试此过程时，请务必记住保持严格的孵育窗口，以获得可靠和一致的结果。优化每种酶替代疗法的检测也很重要。开发后，该技术为药物研发中的免疫原性和生物分析科学家铺平了道路，以探索细胞摄取中和抗体对 ERT 安全性和有效性的影响。

不要忘记，处理人类样本可能非常危险，并且在执行此程序时，所有样本都应被视为具有潜在传染性。