Name: 细胞法检测酶替代疗法中细胞吸收的抗体 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 52 s
Description: 了解基于细胞的流式细胞术方法，用于检测酶替代疗法中的中和抗体。该技术利用Jurkat细胞模型和荧光标记酶，通过半定量分析评估抗体对药物摄取的影响，为免疫原性研究提供灵敏可靠的检测手段。

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作者无致谢。

人源基质经商业渠道购得，并已获得其机构审查委员会（IRB）的批准，但仍应视为具有潜在传染性。确保所使用的实验室环境始终秉持安全文化12。
1. 开始实验前的准备
<ol>
	<li>根据制造商说明书制备 ERT-偶联链霉亲和素磁珠13.</li>
	<li>制备质量控制样本（QCs）：加入阳性对照抗体（PC）例如，一种物种特异性基质中的中和抗体（NAb）例如，混合脑脊液或血清。 
	注：美国食品药品监督管理局（FDA）和欧洲药品管理局（EMA）指南建议，在方法学验证和常规检测中应制备高浓度和低浓度质控样本。1,14.
	<ol>
		<li>例如，为了获得一个QC在 10 µg/mL，添加 10 µL 1 mg/mL 储备液阳性对照 990 µL 相应基质的例如，脑脊液（CSF）总体积为 1,000 µL.</li>
		<li>将质控样品分装为适合单次使用的体积（例如, 50 µL) 并将等份试样在 -60 至 -80 °C1.</li>
		<li>取一份未经受试物处理的种属特异性基质作为切割点对照（CC）例如，用于单次使用的混合脑脊液或血清）例如, 50 µL) 并将等份试样在 -60 至 -80 °C1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用蛋白质标记试剂盒，按照生产商的说明书将荧光染料与ERT进行偶联反应15将样品分装为适合单次使用的体积（例如, 50 µL) 并将等份试样在 -60 至 -80 °C.</li>
</ol>
2. 第1天：细胞铺板与样品准备
<ol>
	<li>细胞板制备
	<ol>
		<li>使用组织培养罩，并在以下步骤中维持无菌环境。将要放入培养罩中的每个物品用70%乙醇喷洒，并保持洁净环境16,17,18。</li>
		<li>在37 °C的水浴或珠浴中预热细胞生长培养基（例如，含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的RPMI-1640）19。</li>
		<li>计数人T淋巴细胞Jurkat细胞，并以每孔100 µL、细胞密度为7.5 × 105 个细胞/mL接种至适用于配备板加载器的流式细胞仪的96孔圆底细胞培养板中。
		<ol>
			<li>例如，使用血细胞计数板或自动细胞计数器进行细胞计数20,21。</li>
			<li>确保细胞活力至少达到70%后再进行实验（例如，通过台盼蓝染色评估细胞活力）17。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将细胞置于37 °C、5% CO2和95%湿度的培养箱中孵育过夜14–20小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>筛查样本制备
	<ol>
		<li>使用无血清培养基（例如，RPMI-1640）稀释待测样本或检测对照样本。在此示例方法中，将样本以1:2.5的比例在RPMI-1640中稀释，即向90 µL无血清培养基中加入60 µL样本（例如，8联管）。随后进入步骤3.1，进行检测流程以制备荧光标记的ERT。 
		注：1:2.5的稀释比例是通过实验确定的，适用于本方法。每种新建立的方法应分别确定最佳样本稀释比例。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>确证性磁珠与样本制备
	<ol>
		<li>计算确证性样本所需的ERT偶联磁珠数量。
		<ol>
			<li>例如，对于10个样本，所需磁珠体积为：10个样本 × 每样本100 µL ERT偶联磁珠 + 30%额外量以补偿洗涤过程中的损失 = 共1,300 µL ERT偶联磁珠。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>充分涡旋混匀磁珠。将计算所得体积的磁珠转移至15 mL锥形管中以进行洗涤。</li>
		<li>通过加入1,300 µL偶联缓冲液或按制造商建议（例如，含0.1%吐温-20的磷酸盐缓冲液）对ERT偶联磁性微珠进行洗涤，操作步骤如下13。</li>
		<li>充分涡旋混匀管内液体。将管置于磁力架中静置2分钟。在不扰动磁珠的前提下，小心吸除并弃去上清液。 
		注：当磁珠被吸附至磁铁一侧时，溶液颜色会由深棕色变为透明。</li>
		<li>用1,300 µL偶联缓冲液重悬磁珠。重复上述洗涤步骤，共洗涤四次。</li>
		<li>最后一次洗涤后，将磁珠重悬于1,300 µL偶联缓冲液中（该体积已在步骤2.3.1.1中预先计算）。根据板图，每孔加入100 µL至96孔白色圆底非结合性聚丙烯板中（例如，每样本或质控样本对应一个确证孔；样本将在与荧光标记ERT孵育时分为复孔）。</li>
		<li>将板置于96孔侧磁裙磁板架上，使磁珠形成沉淀。小心吸除透明上清液并弃去。 
		注：在侧磁裙磁板架上静置约1–2分钟后，溶液由深棕色变为透明。所得磁珠称为“干磁珠”。</li>
		<li>若样本经筛查呈阳性并需进行确证，则向相应/指定孔中分别加入含和不含ERT偶联磁珠的各100 µL样本。用塑料封膜密封板，于室温（RT）下以约800 rpm在旋转摇床上孵育至少60分钟。 
		注：每次检测均应包含先前制备并冻存的阳性与阴性质控样本以及试剂对照（CC）。</li>
		<li>孵育结束后，将确证板置于96孔侧磁裙磁板架上，使磁珠形成沉淀。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>滴度稀释系列制备
	<ol>
		<li>为制备滴度系列，将样本在合并基质中进行连续稀释，稀释次数应足够多，以跨越预设的滴度截断值1。</li>
		<li>例如，在1:3稀释系列中，将30 µL样本与60 µL合并基质混合，共进行8个梯度稀释（例如，8联管）。随后进入步骤3.1，进行检测流程以制备荧光标记的ERT。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 第1天：检测操作步骤
<ol>
	<li>在无血清培养基中配制荧光标记的 ERT（例如, 60 µL 每孔，或每板约 6 mL。
	<ol>
		<li>例如，要制备 10 mL 的 1 µg/mL 荧光标记的 ERT，添加 10 µL 将1 mg/mL荧光标记的ERT原液9.99 mL加入无血清培养基中例如，RPMI-1640）</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在新的培养板中（例如，96 孔，白色，圆底，非结合性聚丙烯板），将步骤 2.2、2.3 或 2.4 中制备的样品与荧光标记的 ERT 以 1:1 混合，加入至复孔中例如，转移 60 µL 每个制备样品的量并加入 60 µL 每孔荧光标记的ERT量 
	注意：实验板布局示例见下文 图1.</li>
</ol>
<img alt="样本筛选与确认的板布局；显示高、低、无质量控制的表格" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57777/57777fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：实验板布局示例。 样本与荧光标记的ERT在2–8 °C下孵育过夜。为评估板间均匀性，在板的对角位置设置了高质量控制（HQC）、低质量控制（LQC）和阴性质量控制（NQC）等对照，并对其进行筛选与确认。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57777/57777fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol start="3">
	<li>使用多通道移液器反复吹打数次，将样品与荧光标记的 ERT 混合。用铝箔包裹板子，在 2–8 °C 下孵育过夜 14–20 小时。</li>
</ol>
4. 第2天：将制备好的样品加入细胞中
<ol>
	<li>从 2–8 °C 的孵育环境中取出样品孵育板，将其放入 37 °C 的珠浴中预热 10–15 分钟。</li>
	<li>从 CO2 培养箱中取出细胞，使用倒置显微镜对已接种的细胞进行目视检查，确保细胞状态良好且在各孔中分布均匀17,19。</li>
	<li>根据实验板图，向细胞板的各孔中加入 100 µL 已预先混合的样品和荧光标记的 ERT。</li>
	<li>将加样后的细胞板放回 37 °C 的 CO2 培养箱中，孵育 3 小时 ± 15 分钟。 
	注意：该孵育时间已在实验室中确定为本检测中信噪比响应的最佳时间。</li>
	<li>在 14–18 °C 条件下，使用台式离心机以 320 x g 离心 6 分钟。确认各孔底部存在细胞沉淀。</li>
	<li>将板倾斜 30–45° 角，小心吸除上清液，避免扰动细胞沉淀。向每孔中的细胞沉淀加入 200 µL 1x DPBS，以重悬细胞。</li>
	<li>重复细胞洗涤步骤，共洗涤 3 次。随后立即进入步骤 5，进行细胞活力染色。</li>
</ol>
5. 第2天：细胞活力染色
<ol>
	<li>使用多通道移液器，向每个选定的孔中加入 100 µL 工作浓度为 1x 的 Live/Dead 染料溶液，该染料的发射波长需与荧光标记的 ERT 所用荧光染料不同，并按照试剂盒说明书进行配制22。</li>
	<li>在室温避光条件下孵育 15 分钟。将板置于 14–18 °C 的台式离心机中，以 320 × g 离心 6 分钟。</li>
	<li>小心吸除各孔中的上清液，避免扰动细胞沉淀。用 1x DPBS 轻柔洗涤细胞一次。</li>
</ol>
6. 第2天：使用1%多聚甲醛固定细胞
<ol>
	<li>使用多通道移液器，向每个孔中加入 100 µL 冷却的（2–8 °C）1% 多聚甲醛（PFA）。</li>
	<li>密封板孔，轻轻脉冲振荡以混匀。用铝箔包裹板子，置于 2–8 °C 至少 10 分钟，以完成固定。 
	注意：操作时需避免液体溅到板封膜上。</li>
	<li>分析前，使用多通道移液器向每个孔中加入 50 µL 1x DPBS，并上下吹打混匀。</li>
</ol>
7. 流式细胞术
<ol>
	<li>使用板加载器将板放入流式细胞仪并运行。</li>
	<li>使用流式细胞术软件获取并记录测得的中位荧光强度（MFI）（参见材料表）。 
	注意：参见图2中的加载器设置示例。该检测已对样本流速、样本体积、混匀体积、混匀速度及混匀次数进行了优化。可根据所使用的流式细胞术采集软件，通过各参数数值旁的“向上箭头”或“向下箭头”按钮对这些参数进行调整23。</li>
</ol>
<img alt="用于样本采集的96孔板布局；高通量筛选；详细设置面板。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57777/57777fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2：流式细胞仪进样器设置示例。 进样器设置应针对每种开发的检测方法进行优化。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57777/57777fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol start="3">
	<li>按照图3所示创建流式细胞仪分析/设门/图谱。 
	注意：设门的创建和应用可能因不同的流式细胞术软件而异23。</li>
</ol>
<img alt="流式细胞术图解；细胞分选过程；中位荧光强度分析" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57777/57777fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：流式细胞术设门策略。 Jurkat 细胞通过前向散射（FSC）图从总事件中分离并收集 与 侧向散射（SSC）通道，并在目标细胞群周围绘制门控。使用前向散射面积（FSC-A）和前向散射高度（FSC-H）通道将单细胞（单细胞）与双联体或更大的细胞聚集体区分开。通过门控排除能被活细胞染料染色的单细胞，从而选取出活细胞。在单个活Jurkat细胞中测量中位荧光强度（MFI），并以直方图形式展示。药物摄取被阻断的细胞的MFI值（例如，HQC）以及对照摄取量的细胞（分别以红色和蓝色表示）的图像。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57777/57777fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<ol start="4">
	<li>从分析中排除死细胞，并记录约 10,000 个事件23。</li>
</ol>
8. 数据分析
<ol>
	<li>将数据（原始 MFI）导出至分析软件（参见 材料表）。 
	注意：根据所需的分析类型，可使用分析软件执行以下数据分析。</li>
	<li>计算复孔（质控品和样本）的平均 MFI 及变异系数（%CV），以评估复孔值相对于平均值的离散程度。 
	<img alt="均值计算公式，方程；统计分析，数学方程示意图。" src="/files/ftp_upload/57777/57777eq1v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程 1"> 
	<img alt="标准差公式，Σ(x−x̄)²/(n−1)，统计分析方程。" src="/files/ftp_upload/57777/57777eq2v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程 2"> 
	<img alt="变异系数公式，%CV=(SD/Mean)×100，统计分析方程。" src="/files/ftp_upload/57777/57777eq3v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程 3"></li>
	<li>对于在检测中进行筛查的样本和质控品，计算相对于合并基质质控品（CC）平均 MFI 的信号抑制百分比（%SI）。 
	<img alt='信号抑制百分比公式，"%SI=(1-MFI_sample/MFI_CC)*100"，以方程形式展示。' src="/files/ftp_upload/57777/57777eq4v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程 4"></li>
	<li>如需要，计算确认阶段的质控品和样本相对于相应筛查值的回收率（RR）。 
	<img alt="确证样本与筛查样本的回收率公式，用于数据分析，教育用途。" src="/files/ftp_upload/57777/57777eq5v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程 5"></li>
</ol>

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</ol>

作者为 BioMarin Pharmaceutical Inc. 的员工及股东。

通过CI-M6PR介导的ERT摄取可能受到中和抗体或其他因素的抑制，从而影响ERT的安全性或疗效1因此，使用与药物作用机制相关的稳健模型来评估受试者样本中的中和抗体（NAbs）显得尤为重要。我们及其他研究者发现，某些生物测定方法的性能（例如受体二聚化，荧光素酶表达 等等。不符合卫生主管部门对检测精密度、重复性和灵敏度的建议29在本文所述的生物测定方法中，采用表达内源性CI-M6PR的Jurkat细胞来监测特异性针对溶酶体酶替代疗法（ERT）摄取的中和抗体（NAbs）。该方法结合流式细胞术检测读数，利用生理相关的细胞模型，具有适当的检测精密度、灵敏度、可重复性以及高通量样本处理能力。基于流式细胞术读数的中和抗体检测方法也已应用于其他疾病领域。例如，已有方法被开发用于检测针对戊型肝炎病毒和腺相关病毒（AAV）的预存抗体30,31.
实验方案中的关键步骤包括选择合适的荧光染料、加入用于监测检测灵敏度的低质控品（LQC）、确保足够水平的细胞活力，以及严格遵守孵育时间。在本示例中，连接至溶酶体酶替代疗法药物（ERT）的荧光染料（例如，Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 647 和 CypHer 5e）在性能上表现出显著差异。其中 Alexa Fluor 647 的荧光信号最强32，被选用于后续检测方法的开发。我们建议在检测方法开发早期即对多种荧光染料进行评估，以获得最佳的灵敏度和动态范围。在样本检测过程中，应通过包含一个接近检测灵敏度限值的 LQC 来监控检测灵敏度，使其在 1% 的检测运行中出现失败1。结合高质控品（HQC），LQC 还可作为系统适用性质控，用于长期监测检测系统的漂移情况3。通过制备一次性分装的细胞库，并根据可比的质控结果对新细胞库进行验证，可实现最佳的细胞活力和检测性能3,18。细胞与荧光染料偶联药物的孵育时间对检测结果的一致性也至关重要，因为药物摄取量随其与细胞共孵育时间的延长而增加。为减少药物摄取在不同实验日之间的变异性，可将样本数据归一化至每块板上的混合基质对照样本（例如，上述方法中的临界值对照样本）。使用该方法获得稳定数据的另一个重要因素是监控板内均一性，并尽量减少可能的边缘效应。初步实验可包括在整个微孔板上使用单一质控品进行检测，而更全面的实验则可在方法验证阶段进行（例如，精密度和准确度验证）1。这凸显了板图设计的重要性33。如板图示例所示，将质控样本置于板的两侧，可监测板内均一性，并通过 Levey-Jennings 图表对均一性进行长期追踪34。
尽管该检测方法可监测中和抗体及其他可能抑制溶酶体酶替代疗法（ERT）摄取的因素，但仍需进行额外实验以确认是否存在由抗体引起的摄取抑制。一种可行方案是使用蛋白A/G/L处理样本，该蛋白可非特异性地结合免疫球蛋白35。若经蛋白A/G/L去除处理后样本仍呈阳性，则可能存在非抗体类抑制因子导致药物摄取受阻。本文所述方法旨在检测抗体介导的摄取抑制作用；若发现大量受试样本中的抑制效应源于非抗体类抑制因子，则应重新评估阳性对照及其他检测参数。
还可进一步表征该检测方法，以证明基于药物作用机制，荧光标记药物可转运至相应的细胞区室。在本示例中，预期酶替代疗法药物（ERT）将结合细胞表面的CI-M6PR，并将其转运至溶酶体。我们此前报道过多个实验结果，表明本方法中观察到的几乎所有荧光信号均来源于溶酶体内的荧光标记ERT8。我们发现，用细胞松弛素B处理细胞后，荧光标记ERT的信号消失，而细胞松弛素B可通过抑制肌动蛋白重排来阻断内吞作用。此外，通过台盼蓝淬灭细胞外荧光或在4 °C条件下孵育细胞以减缓内吞过程的实验表明，荧光标记ERT可被迅速内化，仅有极少荧光来自结合于细胞表面的ERT。通过共聚焦显微镜观察pH敏感性溶酶体示踪染料与荧光标记药物的共定位，可确认药物向溶酶体的靶向性。还可使用外源性M6P与标记药物竞争受体结合，以验证CI-M6PR介导内吞的特异性。对于其他检测中的荧光标记药物，也应进行类似的实验，以验证其摄取动力学及细胞内定位。
该基于细胞的检测平台已被用于研究利用CI-M6PR受体介导的内吞作用的治疗性药物的中和抗体（NAbs）。我们近期报道了使用该检测平台的研究结果，表明elosulfase alfa的中和抗体（NAb）产生与药物疗效之间无相关性36,37。为验证该检测方法在临床样本检测中的适用性，应根据既定的指导原则3,4评估其各项参数，包括检测灵敏度、精密度、选择性、特异性、药物耐受性、稳健性以及临界值。此外需注意，对于溶酶体酶替代疗法（ERT），可能产生中和抗体（NAbs），其通过结合于酶催化位点附近而潜在干扰药物活性。通常情况下，我们认为监测此类中和抗体的优先级较低，因为溶酶体内部严苛的酸性及蛋白水解环境不利于抗体与ERT之间的相互作用2,39,40。然而，可能存在具有抗蛋白水解能力的中和抗体，并抑制药物的催化功能40。本检测方法通过监测荧光标记的ERT被摄取至溶酶体的过程进行评估，其局限性在于无法检测抗蛋白水解的中和抗体。若基于安全性或疗效数据怀疑存在此类中和抗体，则应开发并采用可监测ERT活性的检测方法对样本进行检测。
免疫原性评估对于理解中和抗体对药物安全性和有效性的影响至关重要。识别能够抑制 体外 药物摄取 通过 CI-M6PR 为理解中和抗体活性提供了机会 体内本方法利用表达CI-M6PR的人源细胞系，检测荧光标记的溶酶体酶替代疗法（ERT）药物在细胞摄取过程中的干扰作用。该方法已用于监测多种用于治疗溶酶体贮积症的ERT药物中的中和抗体（NAbs）。该检测平台也可适用于其他研究中和抗体对需细胞内化才能发挥功能的生物治疗药物影响的方法。

免疫原性评估是任何生物治疗产品（包括酶替代疗法，ERT）安全性与有效性监测项目的重要组成部分。患者可能产生免疫反应，从而直接影响药物的安全性、有效性以及药代动力学/药效动力学特征。其中一部分抗药抗体（ADA）被称为中和性抗体（NAbs），可通过两种机制抑制ERT的疗效：一是抑制ERT被靶细胞摄取，二是抑制ERT的催化活性。本文所述方法旨在检测干扰ERT进入细胞的中和性抗体。为了全面监测治疗用ERT的安全性和有效性，持续监测中和性抗体对于阐明其与临床结局或药效动力学效应之间可能存在的相关性至关重要1。
用于评估针对蛋白质治疗药物的中和抗体（NAbs）的平台包括基于细胞的检测、酶活性检测和配体结合检测1根据多种标准选择最佳的检测平台：治疗产品的作用机制、检测平台的灵敏度、选择性、精密度，以及尤为重要的是其模拟能中和抗体（NAbs）抑制作用的能力。 体内配体结合实验在某些情况下可能是合适的（例如，当无法确定相关细胞系或基于细胞的检测方法无法达到适当灵敏度时）。然而，在2016年美国食品药品监督管理局（FDA）发布的行业指南草案文件及其他业内公认的技术白皮书中，推荐使用基于细胞的中和抗体（NAb）检测方法，因为该方法可能更真实地反映药物的生物学作用机制 体内1,2,3.
开发基于流式细胞术的细胞中和抗体（NAb）检测方法的关键组分包括：一种能够对药物刺激产生反应的合适细胞系、一种可中和酶替代疗法药物（ERT）的替代性阳性对照中和抗体、一种荧光染料标记的ERT，以及待测物种的生物基质4,5,6。细胞系的选择取决于ERT的作用机制，在方法开发过程中应评估多种细胞系3。在本研究所描述的方法中，选择人Jurkat T细胞是因其在细胞表面内源性表达CI-M6PR，且不表达抗体片段受体（FcRs），从而避免非特异性结合大多数抗体的Fc区域7,8。在方法开发过程中，建立阴性对照对于验证研究和患者样本检测至关重要，例如可使用未接受受试药物治疗的个体血清混合物作为阴性对照1。为确保药物研发在非临床、临床及上市后阶段的一致性，细胞系还应能耐受来自不同物种的相关基质1。另一个关键组分是检测方法中阳性对照的选择。ERT细胞摄取检测的阳性对照是根据其能否结合治疗性药物并阻断其通过CI-M6PR介导的摄取能力而选定的9,1。通常很难从人类受试者获得足量且稳定的中和抗血清用于检测对照，尤其是在罕见病患者群体中更为困难2。替代方案包括来自高免疫动物的抗血清，或将亲和纯化的多克隆或单克隆抗体添加至与检测相关的基质中1。当使用物种特异性基质时，需注意基质中除抗体外的其他抑制性因子也可能抑制ERT的摄取。检测方法的另一个关键组分是荧光染料标记的ERT。针对不同ERT，应根据检测对荧光亮度、pH稳定性以及在流式细胞仪其他检测通道中可能产生的光谱重叠等因素，评估并选择合适的荧光染料进行偶联。
此处所述的检测方法可用于测量针对进入细胞的治疗性蛋白质（如酶替代疗法药物）的中和抗体 通过 CI-M6PR。多种用于治疗溶酶体贮积症（LSDs）的酶替代疗法（ERT）利用该途径实现细胞摄取和溶酶体靶向，包括用于黏多糖贮积症ⅣA型（Morquio A综合征）的elosulfase alfa、用于CLN2型Batten病的cerliponase alfa、用于法布里病的agalsidase alfa，以及用于庞贝病的alglucosidase alfa。10,11该方法的目的是测量干扰药物结合和内化的中和抗体（NAbs）的相对水平。 通过 CI-M6PR。该过程分为分级筛选、确认和滴定三个步骤3样本首先进行中和抗体（NAb）阳性筛查，随后在确证步骤中确认为阳性。最终，经筛查和确证均为阳性的样本可进行系列稀释，以测定抗体滴度1基于细胞的流式细胞术药物摄取检测方法具有高灵敏度且在机制上具有相关性 体外 检测可能影响药物药理学特征的药物特异性中和抗体的方法。我们此前已对该方法进行了验证，并利用此平台对临床样本中用于药物elosulfase alfa的检测进行了测试8本文详细描述了一种可应用于其他治疗性蛋白或酶替代疗法（ERT）的逐步操作方案。

<table><tbody><tr><td>0.22 &amp;micro;m 滤膜装置，500 mL 真空滤瓶</td><td>康宁</td><td>CLS430769</td><td></td></tr><tr><td>圆底96孔培养板</td><td>Thermo-Nunclon</td><td>163320</td><td></td></tr><tr><td>无菌试剂储液槽</td><td>VistaLab</td><td>3054-1004</td><td></td></tr><tr><td>96孔白色圆底聚苯乙烯微孔板</td><td>康宁</td><td>3605</td><td></td></tr><tr><td>96孔聚丙烯管，8管条</td><td>康宁</td><td>4408</td><td></td></tr><tr><td>磁珠分离器试管架</td><td>V&amp;amp;P Scientific, Inc</td><td>VP 772F2M-1、VP 772F2R-2、VP 772F2R-3</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2 磁力架</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag -96 侧边带裙边磁铁</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>12027</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSCanto II 流式细胞仪</td><td>BD 生物科学</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD 高通量采样器（HTS）</td><td>BD 生物科学</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioRad TC20 自动细胞计数仪</td><td>伯乐（BioRad）</td><td>1450103</td><td></td></tr><tr><td>微孔板振荡器</td><td>VWR</td><td>12620-928</td><td></td></tr><tr><td>Galaxy MiniStar 微型离心机</td><td>VWR</td><td>C1413</td><td></td></tr><tr><td>组织培养 CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱</td><td>Nuaire</td><td>NU-4750</td><td></td></tr><tr><td>生物安全柜</td><td>Labcono</td><td>Purifier Cell Logic +</td><td></td></tr><tr><td>Jurkat细胞系</td><td>ATCC</td><td>TIB152&amp;trade;</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 蛋白质标记试剂盒</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A20173</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads M270 链霉亲和素</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>65306</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link NHS-LC-LC-生物素</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>21343</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 1x 培养基</td><td>Life Technologies</td><td>A10491-01-500mL</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>ATCC</td><td>30-2020</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（100倍浓缩液）</td><td>康宁</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>不含钙和镁的1x DPBS</td><td>康宁</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>4% 甲醛</td><td>电子显微镜科学</td><td>15735-85</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD 可固定紫红色死细胞染色试剂盒（适用于405 nm激发）</td><td>Life Technologies</td><td>L34955</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P1379-100mL</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma</td><td>3059</td><td></td></tr><tr><td>混合人源基质&lt;em&gt;例如&lt;/em&gt; 人血清或脑脊液</td><td>Bioreclamation IVT</td><td>从网站请求报价</td><td></td></tr><tr><td>VWR 聚酯板膜</td><td>VWR</td><td>60941</td><td></td></tr><tr><td>密封 &amp;铝箔样品</td><td>贝克曼库尔特</td><td>538619</td><td></td></tr></tbody></table>

利用基于细胞的检测法检测中和酶替代疗法细胞摄取的抗体

Detection of Antibodies That Neutralize the Cellular Uptake of Enzyme Replacement Therapies with a Cell-based Assay

向患者给予酶替代疗法（ERT）及其他生物制剂疗法可能会引发抗药物免疫反应。对抗药物抗体（ADA）进行表征，特别是那些可能中和药物生物学活性的抗体（称为中和抗体，NAbs），对于理解这些抗体对药物药理学特性的影响至关重要。本方案描述了一种基于细胞的流式细胞术方法，用于检测在人源基质中能够中和代表性溶酶体ERT细胞摄取的中和因子。该方案包括三个步骤：筛选、确证试验和滴度检测，用以在受试者样本中检测、鉴定并确定中和抗体相对滴度水平。
在此方法中，样品首先与荧光素标记的 ERT 产物混合，然后与细胞孵育。例如，表达细胞表面无阳离子依赖性甘露糖-6-磷酸受体（CI-M6PR）的人T淋巴细胞（Jurkat细胞），最后通过流式细胞仪进行分析。无中和抗体（NAbs）的样本将导致荧光标记的酶替代疗法（ERT）产物被细胞摄取 通过 CI-M6PR，而NAbs的存在会与药物结合，从而干扰CI-M6PR的结合与摄取。通过流式细胞术检测Jurkat细胞内化的荧光标记ERT的量，并以相对于代表性无药基质样本所获得信号的百分比（%）抑制率进行评估。在确证步骤中，样本先与ERT偶联的磁珠预孵育，以清除与药物特异性结合的因子（如NAbs），然后再与细胞孵育。在本检测中筛查并确证为药物特异性NAbs阳性的样本，将进行连续稀释以测定抗体滴度。半定量的抗体滴度可与药物安全性和有效性的测量结果相关联。

在实验的第一天，将一份冻存的Jurkat细胞解冻并接种，同时制备待测样品。图1展示了一个示例板图。第二天，将样品与Jurkat细胞混合，在37 °C下孵育约3小时15分钟。随后对细胞进行洗涤、PFA固定，并在流式细胞仪上进行分析。图2展示了流式细胞仪的示例设置。
流式细胞术设门策略旨在测定活体单个Jurkat细胞中荧光素偶联药物的含量24 (图3). 通过设门排除细胞碎片（通常为低前向散射光信号，FSC）和死细胞（通常为高侧向散射光信号，SSC），从而将活细胞分离出来用于后续分析25通过绘制排除高FSC面积和低FSC高度区域的门，将单个细胞从细胞簇中分离出来26细胞经活力染色处理，该染料可标记细胞膜不完整的死亡或不健康细胞，并设置额外的门控以排除死细胞22活单细胞的MFI用于分析荧光染料标记的ERT摄取。作为潜在筛选检测结果的一个示例，基质中添加了高浓度的替代性抗药抗体阳性对照[例如，高质量对照（HQC）] 抑制了荧光素偶联的 ERT 摄取，导致 MFI 较低，约为 300（图3）。相比之下，未加入阳性对照抗体而仅与基质孵育的细胞应具有更高的MFI（MFI = 37,830） 图3），表明荧光素标记的酶替代疗法药物已被摄取。
本实验中的中和性阳性对照抗体是根据药物的作用机制（即，通过CI-M6PR介导的酶替代疗法（ERT）摄取）进行选择的。同时测试并比较了多种荧光染料，以优化检测方法的灵敏度和动态范围1。CypHer 5e被纳入测试，因其在酸性pH条件下荧光信号增强，这一特性可能对某些ERT药物的溶酶体靶向性提供额外的评估依据27。此外，还考察了一种绿色荧光染料（例如，Alexa Fluor 488）和一种远红荧光染料（例如，Alexa Fluor 647）。不同荧光染料表现差异的示例如图4a和4b所示。在该示例中，Alexa Fluor 647标记的ERT表现最佳，因其具有更高的灵敏度（例如，在最低阳性对照浓度下达到最高的刺激指数百分比%SI）以及宽广的动态范围（约3个数量级）。
<img alt="荧光抑制分析，剂量-反应曲线；信号抑制率与MFI的对照滴定" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57777/57777fig4v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图4"> 
图4：不同荧光染料-ERT偶联物的示例结果。 (A在检测方法开发过程中，应使用不同荧光染料标记的ERT对阳性对照（PC）稀释曲线进行评估。在本示例中，两种荧光染料标记的ERT（Alexa Fluor 488 和 CypHer 5e）在 6.25 µg/mL 以及一种更亮的荧光团偶联的 ERT（Alexa Fluor 647）在 1.56 µg/mL 在存在浓度递增的阳性对照中和抗体（NAbs）的情况下进行了检测。（B) 该图展示了上一面板中的曲线 A 使用MFI绘制图表，显示采用Alexa Fluor 647标记的ERT后动态范围的显著增加。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57777/57777fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
所述方法是一种分层次的方法，用于检测、确认并内插估算中和抗体（NAb）滴度的半定量水平3。为确定该检测方法已具备开展验证的条件，应依据既定的指导原则1,3，对包括检测灵敏度、精密度、选择性、特异性、药物耐受性、稳健性以及界值等参数进行评估。
当 %SI 值大于筛查临界值（SCP）时，样本在此检测中被视为潜在阳性。SCP 通过检测来自代表性人群的未经药物治疗样本，并测量信号强度（SI）的相对降低，经统计学方法确定。3。监管机构（例如美国食品药品监督管理局，FDA）建议将SCP设定在95th 正态分布数据集的百分位数，且关于SCP的计算方法在其他文献中已有详细描述1任何在SCP浓度或高于SCP浓度时使检测信号降低（以%SI增加表示）的样本被判定为潜在阳性；而检测结果高于SCP浓度但未引起%SI变化或%SI降低的样本则视为阴性。
初筛阳性（%SI 高于 SCP）的样本需进行确证试验，以确定中和抗体（NAbs）对 ERT 的特异性。确证试验通过将样本与 ERT 偶联的磁珠预先孵育，以去除药物特异性抗体或抑制因子。通过评估确证试验 MFI 与初筛 MFI 的比值（RR），确定样本中被清除的 NAbs 数量。若 RR 高于计算得出的阳性阈值[即，确证性切点（CCP）] 表示存在抗药性中和抗体（NAbs）。与筛选试验相同，应在确证试验中通过评估来自代表性人群的未经治疗样本，首先建立CCP。CCP基于统计学确定的1%假阳性率，作为判定样本确证为阳性的阈值图5)3.
筛查并确认阳性的样本进行连续稀释后，在滴度检测中测定各样本中中和抗体（NAbs）的相对水平或滴度。样本在超过指定阈值时仍呈阳性的最高稀释倍数即为该样本的滴度。例如， 滴度临界值（TCP）是指样品滴度（图5)1,3.
<img alt="中和抗体检测结果，图表序列，显示抑制效果和滴度比较。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57777/57777fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 5"> 
图5：样本检测结果示例。 这些图示展示了在筛选过程中高于或低于17.51 %SI的SC值时检测为阳性或阴性的样本示例。阳性样本随后使用药物偶联磁珠进行确证试验，以在检测前从样本中去除药物特异性抗体。在确证试验中，恢复率（RR）大于确证临界值（i.e.，RR = 1.315）的样本被视为确证阳性。对确证阳性的样本进行系列稀释，直至信号穿过滴度临界点（TCP），以确定样本结果等于滴度临界点时的滴度（稀释倍数）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57777/57777fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
在多天内由不止一名分析人员对检测的重复性和变异性进行了测试。质控样品（QCs）最初一次性配制，并分装为单次使用的小份。在连续3天内，两名分析人员使用多组质控样品进行了检测，以评估检测的精密度。在所示的示例数据中，质控样品的批间和批内精密度的变异系数（%CV）均低于美国食品药品监督管理局（FDA）指南推荐的%CV &lt; 20%的标准（图6）1。
<img alt="显示%SI测量值在批内和批间变异的HQC和LQC统计表。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57777/57777fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 6"> 
图6：两名分析人员在三天内生成的质量控制精密度数据示例。 精密度数据通过方差分析（ANOVA）计算，所用公式引自DeSilva et al.28。批内（运行内）和批间（运行间）变异性以%CV形式报告。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57777/57777fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本文介绍一种基于细胞的流式细胞术方法，用于检测中和抗体或其他干扰酶替代疗法在人源性基质（如脑脊液（CSF）或人血清）中细胞摄取的因素。

酶替代疗法（ERTs）及其他生物疗法在给予患者时，可能会引发抗药物免疫反应。

该方法有助于解答免疫原性和生物分析领域中的关键问题，例如中和抗体对药物安全性、有效性以及药代动力学和药效动力学特征的影响。该技术的主要优势在于，它提供了一种灵敏且具有生物学相关性的基于细胞的方法，可对药物特异性的中和抗体进行半定量检测。在该技术中，荧光标记的酶通过甘露糖-6-磷酸残基与非依赖阳离子的甘露糖-6-磷酸受体（CI-M6PR）结合，进入Jurkat细胞。通过流式细胞术检测，可阻断酶与受体相互作用的中和抗体将导致荧光信号降低。首先，在96孔圆底细胞培养板中，每孔加入100微升细胞培养基，接种7.5 × 10⁴个Jurkat细胞，在37°C、5%二氧化碳及95%湿度条件下培养14至20小时。先用无血清培养基以1:2.5的比例稀释检测样品。然后将每种样品各 60 µL 加入 96 孔白色圆底非结合性聚丙烯板的相应孔中。此板将作为样品孵育板。对于初筛呈阳性且需要确认的样品，涡旋混匀一瓶酶替代疗法（ERT）磁珠，然后将适量磁珠加入一个 15 mL 圆锥形离心管中，再次进行涡旋处理。然后将离心管置于磁力架上静置2分钟，小心移除上清液。第四次洗涤后，向新的白色96孔圆底非结合性聚丙烯板的相应孔中加入100微升磁珠。当所有磁珠均加入孔板后，将该板置于96孔侧边磁板上，使磁珠沉降形成沉淀，再小心移除澄清的上清液。接下来，将每份样品各140微升加入相应的孔中，并用塑料封膜密封，于室温下在约800转/分钟的旋转摇床上振荡至少60分钟。然后将确认板置于96孔侧边带磁铁上，使磁珠形成另一个沉淀，再将60微升样品加入96孔白色圆底非结合性聚丙烯样品孵育板的相应孔中。对于已筛查并确认为阳性的样品，可进行滴度系列实验。为制备滴度系列，将样品在混合基质中进行连续稀释，稀释次数需足够以跨越预设的滴度临界值；根据文本方案，向样本孵育板的相应孔中加入60 µL每种稀释后的样品，并向新的96孔白色圆底非结合性聚丙烯板的相应孔中加入60 µL适当浓度的荧光标记ERT。随后反复吹打荧光标记ERT样品溶液以充分混匀，并用铝箔包裹各板，在2至8°C条件下孵育14至20小时。次日早晨，将样品板置于37°C珠浴中温育10至15分钟，并在倒置显微镜下检查已接种细胞，确认细胞状态健康且在各孔中分布均匀。当培养板升温后，根据实验板图，向细胞培养板中加入 100 微升样品和荧光标记的 ERT 混合物，并将细胞放回细胞培养箱中继续孵育 3 小时 15 分钟。孵育结束后，通过离心收集细胞，并确认每个孔底部均有细胞沉淀。将培养板倾斜 30 至 45 度角，小心吸除上清液，避免扰动沉淀，随后每次用 200 微升 DPBS 按每孔每次离心洗涤细胞，共洗涤三次。最后一次洗涤后，每孔加入 100 微升活死染料，在室温避光条件下孵育 15 分钟。孵育结束后，通过离心收集细胞，并用 200 微升 DPBS 每孔洗涤细胞。将洗涤后的细胞沉淀重悬于每孔 100 微升 2 至 8 摄氏度的 1% 多聚甲醛中，密封培养板后进行轻柔脉冲涡旋振荡。然后用铝箔包裹培养板，在 2 至 8 摄氏度下固定 10 分钟。为通过流式细胞术分析细胞活力，将细胞与每孔 50 µL 的 DPBS 混合，以获得单细胞悬液，并根据标准流式细胞术方案在流式细胞仪上检测细胞。随后可根据活单细胞的中位荧光强度（MFI）评估荧光素标记的 ERT 摄取情况。在进行检测之前，需计算实验性筛选临界值，作为判定样本阳性或阴性的阈值。本示例中展示了添加了高浓度或低浓度中和抗体的质量对照样本。随后，阳性样本将使用药物偶联磁珠进行确证性检测，以从样本中去除针对该药物的特异性抗体。回收率高于确证临界值的样本被视为阳性。经筛查和确证均为阳性的样本将进行连续稀释，并在滴度检测中测定各样本中中和抗体的相对滴度。滴度是指跨越滴度临界值的两个稀释度之间通过插值法计算得到的数值。如图所示，通过活单细胞的平均荧光强度（MFI）评估了荧光染料偶联的酶替代疗法（ERT）的摄取情况。例如，在本实验中，加入阳性对照抗体的基质抑制了荧光染料偶联ERT的摄取，导致中位荧光强度较低。相反，未添加阳性对照抗体而仅与基质孵育的细胞表现出较高的中位荧光强度，表明其摄取了荧光染料偶联的ERT。在进行该实验操作时，必须严格遵守孵育时间，以获得可靠且一致的结果。同时，针对每一种酶替代疗法，优化检测方法也至关重要。该技术建立后，为药物研发中的免疫原性和生物分析科学家提供了研究细胞摄取中和抗体对酶替代疗法安全性和有效性影响的新途径。请注意，处理人类样本可能具有极高的危险性，在进行本实验操作时，所有样本均应被视为可能具有传染性并加以处理。

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