改进的人类胰岛手术标本激光显微切割操作方案

您好，我叫 Dorte，来自 Reen Laser 科技大学的 Thea Hands 研究所。显微切割是一种能够从极少量原发肿瘤组织中获取特定细胞群体的技术。所分离的细胞可用于转录组学和蛋白质组学研究、DNA 检测或染色体分析。

本文提供了从手术标本中获取人胰腺间质细胞用于转录组学研究的实验方案。将胰腺组织切成小块。取一块置于冷冻模具中央，并用预冷的包埋剂覆盖。

立即将组织用预冷的两种材料——不丹（Bhutan）包埋，并在 -80 °C 下保存。将 40 张带粘附剂的载玻片贴上标签，并置于冷室（Christed Chamber）内预冷。修整冷冻组织块后，用 OCT 包埋剂将冷冻组织固定在样品托上。

切取40片10微米厚的切片。通过用手指触碰载玻片背面，仅加热放置切片的位置，将一片切片转移至一张载玻片上。将切片在冷冻切片机内干燥2至3分钟，随后于-80摄氏度保存。准备染色试剂，并将除硒以外的所有液体置于冰上预冷。这将增强显微切割前组织细胞的固有自发荧光。

每次处理四个切片。每次操作两个切片。先用70%乙醇固定30秒。

然后用去离子水快速浸洗切片五到六次。随后将组织在100%乙醇中脱水一分钟，并重复此步骤一次，再将载玻片置于二甲苯中孵育四分钟。

同时，开始对另一对切片进行脱水。最后，在避光条件下将载玻片空气干燥三到五分钟。将两张载玻片背对背放入铝箔包裹的50 ml离心管中，以保护组织免受潮气影响，并防止自发荧光被漂白。在切片前，用RNAs away清洁显微镜，并将粘性帽夹入robo Mover中。

将载玻片插入载物台，并将盖玻片轻轻移至切片上方，避免接触。通过识别自体荧光较强的贝塔细胞区域来定位小孔。在该实验设置中，人贝塔细胞的内在自体荧光呈黄色，而胰腺导管则呈现明亮的绿色自体荧光。

使用套索选择工具选取较佳的细胞区域，并通过启动激光进行显微切割。在40至60分钟内，将四个已降级的冷冻切片上的小孔切割并收集到一个粘附帽中。如需要，可将收集组织后的帽移至显微镜的检查点，以观察所捕获的组织。

取下 robo mover 的盖子，向盖内加入 10 µL 裂解缓冲液以裂解细胞。将盖子倒置，在 42 °C 下孵育 30 分钟。

离心收集裂解液，标记试管并将其在-80°C下保存，直至进行RNA提取。对全部40个冷冻切片样本执行激光显微切割及裂解操作。随后，合并10个裂解液样本，并按照提供的说明书使用UR PU RNA提取试剂盒继续进行RNA纯化，以获得11 µL RNA。

总体而言，我们未发现显微切割组织量与 RNA 产量之间存在直接关系。外科医生取材后至病理医生检查完胰腺标本并进行冷冻保存之间的时间间隔差异，可能部分影响所获得 RNA 的质量和数量。其他需要考虑的关键因素包括用于显微切割的激光能量——较低能量有助于获得更高的 RNA 完整性，以及激光聚焦程度和激光压力切割点的位置距离。此外，通过尽量缩短粘附帽与组织之间的距离，可进一步优化 RNA 产量。

在具备激光显微切割显微镜的条件下，应避免在捕获过程中丢失显微切割的组织。该方法可在任何开展部分胰腺切除术的研究机构中实施，从而增加获取来自非糖尿病和糖尿病受试者的人眼睑组织的机会。