从手术标本的人类胰岛细胞激光显微切割的改进方法
2013年1月6日
激光显微切割是一种技术，使选定单元格的恢复微量的实质。在这里，我们描述了一个协议，收购手术标本用于转录组研究人类胰岛。我们的协议提高了内在的自发荧光的人类β细胞，从而有利于他们的收藏。
您好，我是来自科技大学 Thea Hands Institute 的 Dorte，Reen Laser。显微切割是一种允许从极少量的母瘤中获得特殊细胞群的技术。解剖的细胞可用于转录组学和蛋白质组学研究、DNA 评估或染色体分析。
在这里，我们提供了从手术标本中获取人胰腺元细胞以用于转录组学研究的方案。将胰腺组织切成小块。将一块放在冷冻模具的中心，并用 Chilled 包埋化合物覆盖。
立即冷冻组织 用冷藏的两种材料不丹并储存在零下 80 摄氏度。对 40 个粘性载玻片进行切片，并在 Christed Chamber 内对其进行预冷。修剪冷冻块后，用 OCT 化合物将冷冻组织固定在标本架上。
切 40 个 10 微米厚的切片。用手指触摸载玻片的背面，将一个切片转移到一个载玻片上，以仅加热放置切片的位置。在冷冻机中尝试切片 2 到 3 分钟，然后在零下 80 摄氏度下储存，准备 Ation 试剂并将除塞林外的所有液体冷却在冰上。这将在显微解剖之前增加 pet 细胞的内在自发荧光。
每次将有四个部分被降额。一次处理两个部分。首先将它们在 70% 乙醇中固定 30 秒。
然后用 5 到 6 次快速浸泡清洗切片。在 DPC 处理过的水中。在 100% 乙醇中将组织脱水 1 分钟，然后重复此步骤，将玻片在 seline 中孵育 4 分钟。
同时，开始另一对部分的脱水。最后，在黑暗中风干载玻片 3 到 5 分钟。通过将两张载玻片背靠背放入铝箔中，保护组织免受潮湿和自发荧光的漂白 包裹 50 ml 试管 切片前，用 RNA 清洁显微镜，并将胶帽夹入 robo Mover。
将载玻片插入载物台中，将盖子紧紧地移到该部分上，不要触摸它。通过识别自发荧光更好的细胞区域来定位孔眼。人类较好细胞的内在自发荧光在设置中显示为黄色，而胰管显示亮绿色自发荧光。
使用徒手选择工具选择更好的细胞区域，并通过启动激光对其进行显微解剖。在 40 到 60 分钟内将四个降额冷冻切片的孔眼解剖到一个粘合帽中。如果需要，通过将盖子移动到显微镜的检查点来检查捕获的组织。
取下盖子 从机器人搬运器中取出并用管道输送。将 10 μL 提取缓冲液放入盖子中 用于细胞破碎的盖子。将瓶盖在 42 摄氏度下倒置孵育 30 分钟。
离心裂解物，标记试管并将其储存在零下 80 摄氏度，直到可以提取 RNA。对所有 40 种冷冻解剖进行 Ation 激光、显微解剖和裂解。然后，将 10 种裂解物合并，并按照提供的方案使用 UR PU RNA 分离试剂盒继续进行 RNA 分离，以获得 11 μL RNA。
一般来说，我们没有发现显微解剖组织的数量与 RNA 产量之间的直接关系外科医生采集与病理学家检查后胰腺标本冷冻之间的时间间隔差异，可以部分解释回收 RNA 的质量和数量。其他需要考虑的关键因素是用于微切割的激光能量，能量较低，使用较高的 RNA 完整性，以及激光聚焦和激光加压切割机指向点的距离。此外，可以通过保持尽可能低的粘附帽和粘附帽之间的距离来优化 RNA 量。
如果可以使用激光显微解剖显微镜，则避免在捕获过程中丢失显微解剖组织。该程序可以在任何进行部分胰腺切除术的研究机构实施，从而增加非糖尿病和糖尿病受试者对人眼睑材料的获取。
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概述
本文介绍了一种从手术样本中恢复人胰腺胰岛的激光显微解剖协议。该技术可增强对转录组研究的β细胞收集。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 转录组学
背景
- 激光显微解剖可用于分离特定细胞群。
- 对小组织样本特别有用。
- 该技术可应用于各种研究，包括转录组学和蛋白质组学分析。
- 改进自体荧光有助于收集目标细胞。
研究目的
- 提供获取人胰腺胰岛的详细协议。
- 促进转录组学研究中β细胞的研究。
- 增强从手术样本中收集细胞的效率。
所用方法
- 应用于胰腺组织的激光显微解剖技术。
- 通过切割将组织样本制备成小片。
- 将组织嵌入冷却的化合物中以实现最佳解剖。
- 收集β细胞进行进一步分析。
主要结果
- 成功分离出人胰腺胰岛。
- 观察到β细胞的自体荧光改善。
- 协议在转录组学研究中表现出有效性。
- 促进从小样本中收集目标细胞群。
结论
- 该协议增强了人胰腺胰岛的恢复。
- 激光显微解剖是细胞分析的有价值工具。
- 改进的方法可带来转录组学研究中更好的洞见。
常见问题
Executive Industry Relevance
Laser microdissection enables precise isolation of human pancreatic beta cells from limited surgical specimens, addressing a critical bottleneck in transcriptomic studies of diabetes-relevant tissues. By enhancing intrinsic autofluorescence through ice-cold reagent processing, the protocol reduces tissue handling time and improves RNA preservation, directly supporting target validation in metabolic disease research. This approach strengthens mechanistic de-risking by providing purified cell populations for downstream omics applications in early discovery workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating pure beta cell populations for pathway analysis in type 2 diabetes models.
- Operational Value: Facilitates biological de-risking through rapid, accurate identification of target cells via enhanced autofluorescence, reducing false positives in target selection.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for assay standardization by providing consistent, high-integrity RNA inputs from microdissected islets.
- Operational Value: Supports reproducible quantitative outputs essential for screening readiness and platform reuse in biomarker discovery pipelines.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains disease relevance by enabling transcriptomic analysis of human pancreatic islets directly linked to diabetic pathophysiology.
- Operational Value: Ensures continuity from discovery through preclinical validation by supplying defined cell populations for mechanistic follow-up studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum by enabling hypothesis testing in early biology, supporting assay development through standardized inputs, and informing translational decisions via quantitative molecular profiling.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and biological de-risking by isolating beta cells for functional target validation in metabolic disease models.
- Screening: Delivers assay-ready samples with reproducible RNA yields, critical for screening compound effects on isolated islets.
- Analytics: Generates quantitative transcriptomic readouts that allow comparison between diabetic and non-diabetic states to inform lead identification.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by providing human-relevant samples that bridge in vitro findings to disease mechanisms.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for accessing primary human islets across multiple projects, reducing dependency on variable donor sources.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in beta cell-specific signaling pathways.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility through controlled tissue processing and defined dissection parameters.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early assessment of target engagement in human-relevant cells, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of diabetes targets based on validated human islet transcriptomic profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in histology, cryosectioning, and laser microdissection instrumentation.
- Dependent on access to a PALM MicroBeam system or equivalent LMD platform with AutoLPC capability.
- Necessitates standardized reagent handling protocols to maintain autofluorescence and RNA integrity across users.
- Involves adaptation considerations for varying pancreatic specimen quality and ischemic time between harvest and freezing.
- Limited by RNA yield constraints, necessitating pooling of multiple microdissected samples for sufficient input to downstream kits.
