在使用微深皮质层的活体成像

直角microprisms允许插入到小鼠大脑皮层多个皮质层的深成像与通常在切片中发现了一个观点。一毫米microprisms提供了一个广阔的领域的视图（〜900微米）和空间分辨率足以解决树突棘。我们证明V层神经成像和新皮层的血管成像，使用microprisms。

荧光显微镜技术对组织深处的结构进行成像的能力有限，尤其是在脑组织等高光散射材料中。即使在双光子显微镜的情况下，也很难产生距离新皮层表面深度超过 500 微米的神经结构的高质量体内图像。在这里，绿线表示 500 微米的深度。

一般来说，新皮层第 4 层、第 5 层和第 6 层距离表面大于 500 微米。我们将展示插入新皮层的一毫米玻璃微棱镜如何将光传入和传出浅层和深层皮层。在鼠标中使用这种技术，可以拥有一毫米的视野，并在成像角度同时可视化所有六个皮层，这通常只存在于切片脑组织中。

微棱镜提供了宽广的视野，能够可视化第五层多金属细胞体及其长顶端树突和新皮层中复杂的血管网络，同时保持能够分辨树突棘和通过微毛细血管的红细胞流的空间分辨率。我叫 Thomas Chia，是耶鲁大学生物医学工程系 Michael Levine 教授实验室的研究生。我们将在本视频中讨论的协议将是关于如何使用一毫米直角玻璃微棱镜生成小鼠新皮层中一毫米深的结构的荧光图像。

我们使用的微棱镜是由从 Opto Sigma Corporation 购买的 BK 7 玻璃制成的一毫米直角棱镜。尽可能使用镊子处理微棱镜。微棱镜的斜边涂有增强型银，可在 400 至 2000 纳米范围内提供大于 97% 的反射率。

这提供了激光激发光和入射荧光的内部反射。我们使用定制的双光子显微镜，能够进行小动物成像。连接到立体定向装置的动物被放置在三轴电动载物台上。

显微镜连接到运行 Scan Image 的 Windows PC。软件扫描图像是由 Polo Gudo 等人用 MATLAB 编写的图像采集软件。对于微棱镜成像，我们以 10 24 x 10 24 或 5 12 x 5 12 像素的分辨率收集图像。

此外，我们通常以每行 2 毫秒或每行 4 毫秒的速度进行扫描。该协议的一个重要方面是与微棱镜结合使用的显微镜物镜类型。实验中使用了两种类型的物镜。

左侧的物镜是用于宽视场成像的低数值孔径空气物镜，在本例中为 4 x 0.28 NA 的奥林巴斯物镜。右侧的物镜是一个 40 x 0.60 高 NA 空气物镜，带有玻璃校正环，能够最大限度地减少 0 到 2 毫米玻璃引起的球面像差。为了准备小鼠进行手术和插入微棱镜，第一步是将动物适当麻醉至适合外科手术的水平。

首先，根据既定剂量记录动物的体重。将适当体积的氯胺酮和甲苯噻嗪混合物吸入注射器中。麻醉药物使用 28 号针头通过 IP 注射给药。

一旦小鼠处于适合外科手术的麻醉平面，就会使用带有 40 号刀片的震颤剃掉动物头上的大部分毛发。然后将 nare 应用于头部剩余的毛发，以帮助创建一个没有可能妨碍微棱镜的毛发的表面。在成像过程中，五分钟后，将 NA 清除 使用棉签，将被麻醉的动物正确放入小鼠立体定向装置中。

在外科手术和成像过程中，动物被保存在设置为 36 摄氏度的装满水的加热垫上。将动物的头部正确固定到位后，沿着颅骨的内侧线做一个干净的切口。为了分离皮肤，将少量 3% 过氧化氢放在棉签上并涂抹在颅骨上以清除颅骨和皮肤之间的膜。

过氧化氢还有助于揭示 BMA，这是知道在哪里进行开颅手术和插入微棱镜的重要里程碑。在开颅手术开始之前，适当调整耳杆和咬杆，使暴露的颅骨倾斜，使其与桌子基本齐平。这为开颅手术提供了更好的平台。

一个小的牙科毛刺连接到用于开颅手术的 Dremel 工具。我们将速度设置为大约 7， 000 到 10， 000 RPM。沿着颅骨撇去牙刺，直到在骨骼中形成一个方形凹槽。

正方形的边长约为 2 到 3 毫米，居中。1.5 毫米的 coddle，1 毫米的侧向 rema 继续使骨骼变薄，直到在颅骨上开一个小口。一对镊子可以提起骨瓣。

将微棱镜插入皮层之前，需要去除硬脑膜。让血液在表面凝固几分钟，最好控制出血。之后，使用手术海绵去除凝固的血液，以帮助棱镜与皮层对齐。

微棱镜的垂直面与镊子上的手柄平行排列。正确握住棱镜后，插入整个微棱镜，直到棱镜的顶部与新皮质表面齐平。在这里，我们可以看到棱柱位于新皮层中。

正确插入后，微棱镜应保持在正确的位置。任何导致的出血都是轻微的，可以用小手术海绵吸收。一旦棱镜就位，动物就可以与动物一起成像了。

在低放大倍率物镜下，人们可以看到大脑表面微棱镜上的激光光栅扫描。以下是从表达黄色荧光蛋白的转基因小鼠拍摄的一些代表性图像示例。在使用微棱镜的第五层皮质神经元中，人们可以在第五层看到一组大型的寄生金属细胞体，距离皮层表面以下近 1 毫米。

还可以看到顶端树突，这些树突在使用带有玻璃校正环的高数值孔径物镜发散成簇绒之前延伸到所有表层，在这种情况下可以分辨树突棘。在第 5 层副金属神经元的顶端树突上，树突棘是亚微米结构，在图像中使用黄色箭头识别了几个。人们还可以用荧光染料标记皮质血管，例如使用已建立的尾静脉注射技术进行荧光素葡聚糖。

使用这种技术，人们可以看到较大口径的血管从深层向 PIA 延伸并分支形成微毛细血管网络。新皮层中这种微妙的微毛细管网络最好使用高数值孔径物镜来欣赏。此外，可以通过线扫描测量来自深部新皮层毛细血管的红细胞速度和通量。

红线表示通过微棱镜在毛细管图像上的线扫描模式。由于红细胞不吸收荧光染料，因此它们会出现深色条纹。底部的图像是线扫描的结果，其中一个 AE 中具有空间维度，另一个 AE 中具有时间维度。

来自这个的 AE 可以计算红细胞通过毛细血管的通量和速度。微棱镜在动物身上使用后，可以多次重复使用。但是，它确实需要适当清洁以去除任何残留的生物材料。

这可以通过将棱镜浸入少量盐酸中，然后浸入甲醇中来实现。然后可以用透镜纸包裹干净的微棱镜，直到功能使用。我们关于使用微棱镜进行小鼠体内皮层成像的协议到此结束。

在成像实验中使用微棱镜相对简单，并且在新皮层的体内研究方面具有许多优势。我们希望您发现这是一项有趣的技术，将来可以在您的实验室中使用。感谢您的观看，祝您好运。