Name: 在使用微深皮质层的活体成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-27T16:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: 学习使用直角微棱镜对小鼠新皮层深层进行活体成像的技术。该方法可同时观察全部六层皮层结构，分辨率达树突棘水平，为神经科学研究提供全新视角。

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我们感谢 Anthony J. Koleske 博士提供了 YFP 小鼠。

第一部分：微棱镜光学与显微镜设置
<ol>
<li>我们使用的微棱镜是来自 Optosigma Corporation 的 BK7 玻璃制成的 1 毫米直角棱镜（图 1）。尽可能使用镊子操作微棱镜。</li>
<li>微棱镜的斜边镀有增强银膜，可在 400 – 2000 nm 范围内提供超过 97% 的反射率。这可实现激光激发光和发射荧光的内部全反射。</li>
<li>尽可能始终使用镊子操作微棱镜。操作时需全程佩戴手套，以保持棱镜清洁。</li>
<li>我们使用自行搭建的双光子显微镜，可用于小型动物成像。将固定在立体定位装置上的动物置于三轴电动载物台上。</li>
<li>显微镜连接至运行 ScanImage 软件的 Windows 电脑。ScanImage 是由 Pologruto 等人1基于 Matlab 开发的图像采集软件。</li>
<li>在微棱镜成像过程中，我们通常以 1024 × 1024 或 512 × 512 像素的分辨率采集图像。此外，扫描速度通常为每行 2 毫秒或 4 毫秒。</li>
<li>实验中使用两种类型的物镜：
<ul>
<li>低数值孔径（NA）的干式物镜，用于大视野成像（见试剂与设备表）。</li>
<li>带有玻璃校正环的高数值孔径（NA）干式物镜，可最小化由 0 – 2 毫米厚玻璃引入的球面像差（见试剂与设备表）。</li>
</ul>
</li>
<li>当动物准备在低倍物镜下进行成像时，需将激光的方形光栅扫描模式与微棱镜的顶部对齐。这有助于确定图像方向，并更高效地利用激光功率。</li>
<li>使用带有玻璃校正环的高数值孔径（NA）物镜时，先将校正环设置为校正约 1 毫米厚的玻璃。一旦实验中出现荧光图像，可小心地伸入显微镜内部微调校正环，以最大化成像分辨率。</li>
</ol>
第二部分：非存活动物手术与微型棱镜植入
<ol>
<li>整个操作过程的时长，从初始切口到成像完成，取决于实验的具体目标。然而，非存活状态下的手术操作及微棱镜植入通常需要约 30 – 40 分钟完成。</li>
<li>小鼠（P30-P60）称重后，通过腹腔注射氯胺酮（100 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）进行适当麻醉，使其达到适合手术操作的麻醉深度。</li>
<li>在整个实验过程中，应每 15–20 分钟检查一次动物的麻醉水平。若动物对强力脚趾夹捏产生反应，则需追加氯胺酮/赛拉嗪剂量。通常追加剂量为初始剂量的三分之一，可预先配制于注射器中，以便必要时立即进行腹腔注射。</li>
<li>当小鼠达到适当麻醉状态后，使用装有 #40 刀头的剃毛器将其头部大部分毛发剃除。</li>
<li>在头部残留的毛发上涂抹 Nair®，以帮助清除可能在成像过程中干扰微棱镜的毛发。5 分钟后，使用棉签将 Nair® 擦拭干净。</li>
<li>将麻醉后的动物正确固定于小鼠立体定位仪中。在手术操作和成像过程中，动物应置于设定为 36 摄氏度的水循环加热垫上以维持体温。</li>
<li>待动物头部被牢固固定后，使用手术刀沿颅骨中线做一条整齐的切口，以分离皮肤。</li>
<li>将少量 3% 过氧化氢滴于棉签上，并涂抹于颅骨表面，以清除颅骨与皮肤之间的膜状组织。</li>
<li>过氧化氢还有助于显露前囟点（bregma），这是确定开颅位置和微棱镜植入位置的重要解剖标志。</li>
<li>在开始开颅前，应正确调整耳杆和咬合杆，使暴露的颅骨倾斜至基本与操作台面水平。这为开颅提供了更稳定的平台，同时使棱镜的顶面与入射激发光垂直，有助于在成像过程中最小化光学像差。</li>
<li>使用柔性延长臂将小型牙科钻头（约 0.8 mm 钻头尺寸）连接至 Dremel® 工具。进行开颅时，我们将转速设定在约 7,000 至 10,000 转/分钟。</li>
<li>将牙科钻头轻划颅骨表面，直至在骨头上刻出方形凹槽。方形每边长约 2–3 mm，中心位于前囟点后方 1.5 mm、侧方 1 mm 处。</li>
<li>继续磨薄骨片，直至在颅骨上形成一个小孔。随后可用镊子将骨瓣从颅骨上抬起并移除。</li>
<li>在插入微棱镜前必须去除硬脑膜。出血最好通过让血液在表面凝固数分钟来自行控制。之后，在插入微棱镜前，使用外科海绵清除凝固的血液。</li>
<li>为辅助棱镜与皮层的对齐，可将微棱镜的垂直面与镊子的手柄保持平行。</li>
<li>在正确持握棱镜的情况下，将整个微棱镜插入，直至其顶部与新皮层表面齐平。</li>
<li>若插入位置正确，微棱镜应能稳定保持在原位。产生的任何出血量均较小，可用小型外科海绵吸收。一旦棱镜就位，动物即可进行成像。</li>
<li>微棱镜在动物体内使用后可重复使用多次，但必须进行适当清洁以去除残留的生物材料。可通过将棱镜浸入少量盐酸中，随后再浸入甲醇中完成清洁。清洁后的微棱镜可用镜头纸包裹，保存至下次使用。</li>
</ol>
第3部分：代表性结果
<img src="/files/ftp_upload/1509/1509fig1.jpg" alt="显微镜；纳米结构与标尺的尺寸比较；材料科学研究；精密制造。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 图1： 直角微棱镜的图像。本实验所用的棱镜为一毫米大小的BK7玻璃棱镜，其斜边镀有增强银膜，以实现激发光和发射光的内反射。
<img src="/files/ftp_upload/1509/1509fig2.jpg" alt="神经网络可视化，荧光显微镜图像显示脑神经元，科学研究。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 图 2： 第V层YFP标记的锥体神经元图像。通过微棱镜进行的宽视野成像揭示了大量位于皮层表面下约800–900 μm深度的锥体细胞胞体。此外，还可分辨出向上延伸至第I层的顶树突。比例尺 = 200 μm。
<img src="/files/ftp_upload/1509/1509fig3.jpg" alt="显示蛋白质丝状结构及标注感兴趣点的显微图像。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 图3： 采用较高数值孔径的物镜与微棱镜结合，可实现足够的空间分辨率，以分辨第V层锥体神经元顶树突上的树突棘。比例尺 = 10 μm。
<img src="/files/ftp_upload/1509/1509fig4.jpg" alt="显示神经网络结构的显微图像，荧光方法，神经科学研究。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图4"> 图4： 使用微棱镜并通过尾静脉注射荧光染料获得的图像。该图像显示了从深部脑区延伸出的垂直走向的大口径血管，以及在皮层容积中分支出的较细毛细血管。比例尺 = 200 μm。
<img src="/files/ftp_upload/1509/1509fig5.jpg" alt="荧光显微镜图像，神经元网络可视化，光学研究，发射分析。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图5"> 图5： 使用更高数值孔径的物镜，可更清晰地成像新皮层中的毛细血管网络。比例尺 = 50 μm。
<img src="/files/ftp_upload/1509/1509fig6.jpg" alt="剪切流动力学、速度矢量场与时空分析的实验示意图。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图6"> 图6： 微棱镜技术还可用于成像流经血管的红细胞（RBCs）。红细胞不吸收荧光染料，因此在血管中呈现为暗色条带。通过在血管横截面上进行线扫描，可获得红细胞通量和流速的测量结果。比例尺 = 10 μm（上、下图中的水平条）和 250 ms（下图中的垂直条）。

<ol><li>Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ScanImage%3A+flexible+software+for+operating+laser+scanning+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Eng+Online%22%5BJournal%5D)">ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes.</a> Biomed Eng Online. 2, 13-13 (2003).</li>
<li>Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-41 (2000).</li>
<li>Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluctuations+and+stimulus-induced+changes+in+blood+flow+observed+in+individual+capillaries+in+layers+2+through+4+of+rat+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (26), 15741-15741 (1998).</li>
</ol>

动物实验严格按照耶鲁大学动物护理和使用委员会（IACUC）制定的指南和规定进行。

在成像实验中使用微棱镜相对简单，并为新皮层的活体研究提供了诸多优势。采用该技术的代表性示例包括从转基因小鼠中获取的图像，这些小鼠的第V层皮层神经元表达黄色荧光蛋白。利用微棱镜，可以观察到位于皮层表面下近1 mm深处的第V层大量锥体细胞胞体。同时可见的是顶端树突，它们穿过所有浅层后分支形成束状结构（图2）。本实验所用小鼠为转基因动物，其设计仅在第V层神经元中表达YFP（YFP-H2）。结合这些YFP-H小鼠以及带有玻璃校正环的高数值孔径物镜，还可更详细地成像树突结构，并分辨出树突棘（图3）。
也可以采用已建立的尾静脉注射技术，使用荧光素-葡聚糖等荧光染料对皮层血管进行标记。通常情况下，对成年小鼠注射100 µl浓度为20 mg/ml的荧光素-葡聚糖生理盐水溶液较为合适。在将微棱镜插入新皮层后（步骤2.16之后）注射染料可获得最佳效果。利用该技术，可观察到深部皮层中较大管径的血管向软脑膜延伸，并分支形成微毛细血管网络（图4）。使用高数值孔径物镜可更清晰地观察新皮层中这一复杂的微毛细血管网络（图5）。
此外，可...

<table><tbody><tr><td>增强型银反射涂层-(R77)</td><td>OptoSigma Corp. (Santa Ana, CA)</td><td>055-0010</td><td>增强型银反射涂层-(R77)</td></tr><tr><td>荧光素-葡聚糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD70</td><td>70 kDa </td></tr><tr><td>0.28 数值孔径，4x 空气物镜</td><td>Olympus Corporation</td><td>XLFLUOR 4x/340</td><td></td></tr><tr><td>0.60 数值孔径，40x 空气物镜</td><td>Olympus Corporation</td><td>LUCPLFLN</td><td>带 0–2 mm 盖玻片校正</td></tr></tbody></table>

体内成像微棱镜用于深层皮层的成像

In vivo Imaging of Deep Cortical Layers using a Microprism

我们介绍一种使用微棱镜形状的深部脑成像探针进行活体皮层组织成像的实验方案。微棱镜尺寸为1毫米，其斜边具有反射涂层，可实现激发光和发射光的内反射。该微棱镜探针能够同时对多个皮层层次进行成像，其视角通常仅在脑片制备中可见。图像采集具有较大的视场（约900 μm）。此外，我们提供了非存活手术操作及显微镜设置的详细步骤。代表性结果包括来自Thy-1 YFP-H小鼠的第五层锥体神经元图像，显示其顶端树突穿过浅层皮层并延伸至树突簇。分辨率足以对第五层神经元胞体附近的树突棘进行成像。经尾静脉注射荧光染料可揭示皮层中复杂的血管网络。对毛细血管中流动的红细胞（RBCs）进行线扫描，可获得红细胞的速度和通量速率。这种新型微棱镜探针是一种优雅而强大的新方法，可用于活体可视化深层细胞结构及皮层功能。

关键词：活体成像，微棱镜，皮层，深部脑成像，双光子显微镜，神经元，树突棘，血管网络，红细胞流速，Thy-1 YFP-H小鼠

将直角微棱镜插入小鼠新皮层，可实现对多个皮层的深层成像，其视野通常仅在脑片中可见。一毫米微棱镜提供宽广的视野（约900 μm）和足够的空间分辨率，足以分辨树突棘。我们展示了利用微棱镜进行第V层神经元成像和新皮层血管成像的方法。

我们提出了一种利用微棱镜形状的深部脑成像探针对皮层组织进行活体成像的实验方案。微棱镜尺寸为1 mm……

荧光显微技术在成像组织深部结构时能力有限，尤其是在脑组织等强光散射材料中。即使使用双光子显微镜，也很难对距离新皮层表面超过500微米的深层神经结构获得高质量的活体图像。此处绿色线条指示500微米的深度。通常情况下，新皮层的第四、第五和第六层距离表面超过 500 微米。我们将展示如何将一个一毫米的玻璃微棱镜插入新皮层，以实现光信号在浅层和深层皮层之间的传入和传出。利用该技术在小鼠中进行成像，可以获得一毫米的视野范围，并同时观察全部六层皮层结构，这种成像视角通常仅能在脑组织切片中实现。微型棱镜可提供广阔的视野，能够同时观察到新皮层中第五层的旁髓细胞胞体及其长的顶端树突，以及复杂的血管网络，同时保持足够的空间分辨率，以分辨树突棘和红细胞在微毛细血管中的流动情况。我叫Thomas Chia，是耶鲁大学生物医学工程系Michael Levine教授实验室的一名研究生。本视频中我们将讨论的实验方案，是关于如何使用一毫米直角玻璃微型棱镜，对小鼠新皮层深达一毫米处的结构进行荧光成像。我们使用的微棱镜是直径为一毫米的直角棱镜，由Opto Sigma Corporation公司提供的BK7玻璃制成。微棱镜应尽可能使用镊子进行操作。微棱镜的斜边镀有增强银膜，可在400至2000纳米波长范围内提供超过97%的反射率。这可实现激光激发光和进入的荧光的内部反射。我们使用自行构建的双光子显微镜，能够进行小型动物成像。将固定在立体定位装置上的动物置于三轴电动载物台上。显微镜连接至一台运行 ScanImage 软件的 Windows 电脑。ScanImage 软件是由 Polo Gudo 等人使用 MATLAB 编写的图像采集软件。对于微棱镜成像，我们以 1024 × 1024 或 512 × 512 像素的分辨率采集图像。此外，我们通常以每行2毫秒或每行4毫秒的速度进行扫描。本方案的一个重要方面是与微棱镜配合使用的显微镜物镜类型。实验中使用了两种类型的物镜。左侧的物镜是低数值孔径的干式物镜，适用于宽视野成像，此处为一个4倍、0.28 NA的奥林巴斯物镜。右侧的物镜是一个40倍、0.60高数值孔径的干式物镜，带有玻璃校正环，可最大程度减少由0至2毫米厚玻璃引起的球面像差。为了准备小鼠进行手术并植入微棱镜，第一步是将动物适当麻醉至适合外科手术的深度。首先，根据既定剂量记录动物的体重。将适量的氯胺酮和赛拉嗪混合药物吸入注射器中。使用28号针头通过腹腔注射给予麻醉药物。当小鼠达到适合手术操作的麻醉平面时，使用装有40号刀头的剃毛器剃除动物头部大部分毛发。随后，将脱毛剂涂抹于头部残留的毛发处，以清除可能妨碍微棱镜成像的毛发，获得无毛的清洁表面。成像开始5分钟后，用棉签将脱毛剂擦拭干净，然后将麻醉状态下的动物正确固定于小鼠立体定位仪中。在手术过程和成像过程中，动物被放置在设定为36摄氏度的注水加热垫上。将动物头部妥善固定后，沿颅骨正中线做一次干净的切口。为分离皮肤，取少量3%过氧化氢涂抹于棉签上，然后涂于颅骨，以清除颅骨与皮肤之间的膜状物。过氧化氢还有助于揭示BMA，这是确定开颅位置和植入微棱镜的关键解剖标志。在开始开颅之前，应适当调整耳杆和咬合杆，使暴露的颅骨倾斜至基本与实验台水平。这为开颅手术提供了更稳定的操作平台。将一个小型牙科钻头连接到Dremel工具上，用于开颅手术。我们将转速设置为大约7,000至10,000 RPM。将牙科钻头轻轻沿颅骨表面移动，直至在骨头上形成一个方形凹槽。方块的边长约两到三毫米，居中。从1.5毫米处开始，向侧方1毫米处继续减薄骨质，直至在颅骨上形成一个小开口。可用一对镊子抬起骨瓣。在将微棱镜插入皮层之前，需要先去除硬脑膜。止血的最佳方法是让血液在表面凝固数分钟。随后使用外科海绵清除凝固的血液，以帮助微棱镜与皮层的对齐。将微棱镜的垂直面与镊子的手柄对齐至平行。正确持握棱镜后，将整个微棱镜插入，直至其顶端与新皮层表面齐平。此处可见棱镜已安放在新皮层中。正确插入后，微棱镜应保持在适当位置。产生的任何出血量均较少，可用小型外科海绵吸收。棱镜就位后，动物即可进行成像。在低倍物镜下，可以观察到激光在脑表面的微棱镜上进行光栅扫描。以下是一些来自表达黄色荧光蛋白的转基因小鼠的代表性图像。利用微棱镜观察大脑皮层第五层的神经元时，可以在皮层表面下方近一毫米处的第五层看到一群较大的锥体细胞胞体。还可以观察到顶树突，它们穿过所有浅层后分出树突簇。使用高数值孔径物镜并配合玻璃校正环，可在此情况下分辨出树突棘。在第五层锥体神经元的顶树突上，树突棘为亚微米级结构，图中用黄色箭头标出了多个树突棘。此外，还可使用已建立的尾静脉注射技术，通过荧光染料（如荧光素葡聚糖）对皮层血管进行标记。利用该技术，可以观察到深部层次中较粗的血管延伸至软脑膜，并分支形成微毛细血管网络。使用高数值孔径物镜可最清晰地观察新皮层中这一精细的微毛细血管网络。此外，通过线扫描可测量新皮层深部毛细血管中红细胞的流速和通量。红线表示微棱镜对毛细血管图像进行线扫描的路径模式。由于红细胞不摄取荧光染料，因此在图像中呈现为暗色条纹。下方图像为线扫描结果，其中一个轴为空间维度，另一个轴为时间维度。通过此方法，可计算红细胞在毛细血管中的通量和流速。动物实验中使用过的微型棱镜可重复使用多次，但需进行适当清洗，以去除残留的生物材料。可通过将棱镜浸入少量盐酸中，随后再浸入甲醇中来完成清洗。清洁后的微型棱镜可用镜头纸包裹，直至后续使用。至此，我们完成了关于在小鼠活体皮层成像中使用微型棱镜的实验方案。在成像实验中使用微棱镜相对简单，在进行新皮层的活体研究时具有诸多优势。希望您认为这项技术有趣，并能在未来的实验室工作中加以应用。感谢观看，祝您实验顺利。

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