外周血和淋巴组织来源的人原代T细胞突触界面评估

我们今天将要讨论的方法旨在比较组织来源和外周血T细胞的特性及功能活性。该主题的重要性体现在外周血T细胞仅占人体总T细胞的20%。能够研究数量较少的组织来源T细胞至关重要，而这正是我们已实现的目标。

该技术的主要优势在于，与传统方法相比，它所需的细胞数量更少，试剂用量也更小。首先使用聚丙烯材质的剪刀形镊子将玻璃盖玻片浸入新配制的酸性piranha溶液中，处理25至30分钟。洗涤结束后，每次用新鲜的超纯水冲洗盖玻片，共冲洗七次，每次均使用新鲜体积的超纯水。

然后将湿润的盖玻片放置一旁，使残留的水从洁净的玻璃表面流下。当盖玻片干燥后，在无菌通风橱中，将两微升终末脂质体混合物精确地加入自粘载玻片通道的中央。随后立即小心地将一片洁净且干燥的盖玻片与载玻片对齐，使其轻轻覆盖在载玻片的粘性面上。

使用聚丙烯剪式镊子的外环对盖玻片与载玻片边缘接触处施加轻柔压力，确保盖玻片紧密贴附于载玻片上，以防止液体泄漏。然后将载玻片翻转，在玻片组件外侧围绕双层膜结构用永久性记号笔标记四个点。在首次注射前，指定通道的一个端口为进样口，另一个端口为出样口，并在整个实验过程中保持该设定不变。

为避免气泡产生，将移液器吸头末端直接插入进样口，直至感觉到吸头刺穿载玻片通道的橡胶密封。缓慢向通道中加入50 µL预热的检测缓冲液。向进样口注入200 µL卡塞因封闭液中的氯化镍(II)溶液。

从出口端去除 50 微升缓冲液。孵育 45 分钟后，从出口端去除多余的酪蛋白溶液。将 100 微升含 ICAM-1 的链霉亲和素溶液注入入口端，在室温下孵育 45 分钟。

孵育结束后，从出口端去除多余的蛋白溶液。用100 µL检测缓冲液清洗双层膜两次。然后在室温下用100 µL fluoro-4标记的抗CD3抗体孵育双层膜45分钟。

随后用100微升检测缓冲液洗涤两次，每次洗涤操作如图所示。为观察T细胞与双层膜的相互作用，将载玻片置于全内反射荧光（TIRF）显微镜的37摄氏度加热载物台上，并利用墨水标记调整载物台位置，使双层膜位于100倍物镜的中心。

进行颗粒释放成像时，将荧光标记的抗CD107A抗体FAB片段加入CD4 T细胞悬液中，并将标记后的细胞重悬于50 µL检测缓冲液中，用于注入载玻片通道的进样口。然后选择适当数量的实验视野，自注入后每分钟记录每个视野的图像，持续30分钟。

在此代表性实验中，未观察到在流动池或多功能通道流动载片上构建的脂质双层中形成经典免疫突触的CD8 T细胞之间存在差异。CD4 T细胞在与脂质双层相互作用后可形成成熟的免疫突触，但其行为表现多样：有的形成成熟突触并释放颗粒，有的则不形成突触但仍释放颗粒，有的既不形成突触也不释放颗粒。值得注意的是，外周血单个核细胞来源的CD4 T细胞开始释放颗粒的速度几乎是淋巴结来源CD4 T细胞的两倍。

在进行该操作时，必须保持恒定的温度，并缓慢移液，以避免产生气泡。除了能够研究T细胞与双层膜之间的界面外，该方法还可实现对接触双层膜的T细胞进行细胞间染色，从而显著增加可用于描述来自淋巴组织或其他组织的特定T细胞的信息量。

请务必注意，使用piranha溶液具有极高的危险性，在进行此操作时，必须穿戴适当的个人防护装备（PPE）。