人外周血和淋巴组织中原发性 T 细胞突触界面的评价
July 30th, 2018
该协议描述了一种研究原发性多克隆人 T 细胞通过平面脂质双层形成突触界面的能力的技术。利用该技术显示了从淋巴结和外周血中提取的人原发性 T 细胞的差异突触形成能力。
我们今天要讨论的方法是为了比较组织来源的 T 细胞和外周血 T 细胞的特性和功能活性。外周血 T 细胞仅占体内总 T 细胞的 20% 这一事实说明了这个话题的重要性。能够研究少量组织来源的 T 细胞非常重要，而这正是我们所取得的成就。
该技术的主要优点是比传统技术需要的细胞数量和试剂体积更小。首先使用聚丙烯剪刀式镊子将玻璃盖玻片浸入新鲜制备的酸性食人鱼溶液中 25 至 30 分钟。洗涤结束时，每次洗涤用新鲜体积的超纯水冲洗盖玻片七次。
然后将湿的盖玻片放在一边，让剩余的水从干净的玻璃杯上滚落。当盖玻片干燥时，将两微升最终脂质体混合物精确地分装在无菌流动罩内的自粘滑道中心。并立即但小心地将一个干净干燥的盖玻片与载玻片对齐，以便将盖玻片轻轻降低到载玻片的粘性面上。
并使用聚丙烯剪刀式镊子的外圈对盖玻片与载玻片的外围接触处施加轻微的压力，确保载玻片与载玻片紧密相连，以防止泄漏。然后将载玻片翻转过来，并使用永久性记号笔在载玻片组件外侧的双层周围画四个点。在第一次进样之前，将通道的一个端口指定为入口端口，将另一个端口指定为出口，并在整个实验过程中保持此名称。
为避免形成气泡，请将移液管吸头的末端直接插入进样口，直到您感觉到吸头穿透了滑道的橡胶密封件。用 50 μL 温热的检测缓冲液缓慢填充通道。将 200 μL 酪蛋白封闭液中的氯化镍 （II） 注入入口。
并从出口取出 50 微升缓冲液。孵育 45 分钟后，从出口处去除多余的酪蛋白溶液。将 100 μL 链霉亲和素溶液中的 ICAM-1 注入入口，在室温下孵育 45 分钟。
孵育结束时，从出口去除多余的蛋白质溶液。并用每次洗涤 100 微升测定缓冲液洗涤双层两次。然后在室温下用 100 μL 氟 4 偶联的抗 CD3 抗体标记双层 45 分钟。
然后在每次洗涤中加入 100 μL 测定缓冲液进行两次洗涤，如图所示。要对 T 细胞双层相互作用进行成像，请将载玻片放在全内反射荧光或 TIRF 显微镜的 37 摄氏度加热载物台上。并使用墨水标记调整载物台，使双层物镜居中。
对于颗粒释放成像，将荧光偶联的抗 CD107A 抗体 FAB 片段添加到 CD4 T 细胞悬液中。并将标记的细胞重悬于 50 μL 测定缓冲液中，以注射到载玻片通道的入口处。然后选择适当数量的实验区域，并在注射后 30 分钟内每分钟记录一次每个区域的图像。
在这个代表性实验中，未观察到在流动池或多通道流玻片中内置的脂质双层上形成经典免疫突触的 CD8 T 细胞之间的差异。在脂质双层相互作用时，CD4 T 细胞建立了成熟的免疫突触，但要么释放或不释放颗粒，要么释放颗粒而不形成成熟突触，要么既不形成突触也不释放颗粒。值得注意的是，外周血单核细胞来源的 CD4 T 细胞能够开始释放颗粒的速度几乎是淋巴结来源的 CD4 细胞的两倍。
在尝试此过程时，重要的是要保持恒定温度并缓慢移液，以免形成气泡。除了我们研究 T 细胞双层界面的能力外，这种方法还允许我们对接触双层的 T 细胞进行细胞间染色。这将大大促进可用于描述源自淋巴组织或其他组织的特定 T 细胞的信息量。
不要忘记，使用食人鱼溶液是极其危险的，在尝试此程序时佩戴适当的个人防护装备至关重要。
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概述
本协议概述了一种技术，用于研究原代多克隆人类T细胞使用平面脂质双层的突触界面形成能力。该研究突出了淋巴结和外周血来源的T细胞之间的突触形成差异。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 免疫学
- 细胞生物学
背景
- 外周血T细胞仅占体内总T细胞的20%。
- 研究组织来源的T细胞对于理解免疫反应至关重要。
- 该技术允许与传统方法相比使用更少的细胞和试剂进行分析。
- 平面脂质双层为研究细胞相互作用提供了模型。
研究目的
- 比较组织来源和外周血T细胞的突触形成能力。
- 开发一种需要更少细胞进行分析的方法。
- 增强对不同环境中T细胞功能的理解。
使用的方法
- 使用酸性鱼鲨溶液准备玻璃载玻片。
- 用超纯水冲洗载玻片。
- 利用平面脂质双层进行T细胞相互作用研究。
- 评估T细胞和脂质双层之间的突触界面形成。
主要结果
- 展示了来源不同的T细胞的突触形成能力差异。
- 证实了该技术在研究小细胞群体方面的有效性。
- 提供了对各种组织中T细胞功能活动的洞察。
- 强调了在实验设置中使用更少试剂的优势。
结论
- 该协议成功地允许研究T细胞突触形成。
- 它为研究T细胞功能的研究人员提供了一个有价值的工具。
- 研究结果可能对理解健康和疾病中的免疫反应有影响。
常见问题
Executive Industry Relevance
Direct assessment of synaptic interfaces in primary human T cells from both peripheral blood and lymphoid tissue addresses a critical gap in translational immunology and cell therapy R&D. This technique enables mechanistic de-risking and predictive confidence by allowing functional interrogation of rare tissue-derived T cell populations using minimal sample input. The approach supports portfolio decisions by providing quantitative, reproducible data on T cell activation and granule release kinetics relevant to immune modulation strategies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct functional comparison of tissue- and blood-derived T cells for target validation.
- Supports mechanistic de-risking by revealing differences in synapse formation and granule release kinetics.
- Facilitates hypothesis testing on immune cell activation pathways using primary human samples.
- Provides quantitative outputs for portfolio triage and early-stage decision making.
Screening & Assay Development
- Establishes a reproducible, low-input assay platform for evaluating T cell activation and effector function.
- Supports assay standardization and scalability by minimizing cell and reagent requirements.
- Enables screening of functional responses in rare or limited primary cell populations.
- Delivers quantitative, time-resolved readouts suitable for compound or biologic evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro findings with disease-relevant tissue T cell phenotypes for translational continuity.
- Enables risk-adjusted advancement by comparing functional outputs across health and disease contexts.
- Supports biomarker discovery by correlating synaptic interface dynamics with functional granule release.
- Provides mechanistic insights to inform preclinical model selection and validation.
Pipeline & Workflow Integration
This method bridges early discovery and translational research by enabling direct, quantitative analysis of primary T cell function from both blood and tissue sources.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven interrogation of T cell activation and synapse formation mechanisms.
- Screening: Provides a standardized, scalable assay for functional screening of T cell responses.
- Analytics: Delivers quantitative, time-resolved measurements of granule release and synaptic interface formation.
- Translational Research: Facilitates alignment of in vitro findings with disease-relevant tissue phenotypes.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for diverse immune cell functional studies across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in T cell functional studies.
- Operational Value: Minimizes sample and reagent requirements, enabling studies with rare or limited primary cells.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing robust, quantitative data early in the pipeline.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of immune modulation programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary cell isolation and advanced fluorescence microscopy.
- Demands access to TIRF microscopy and precise fluid handling instrumentation.
- Standardization of assay conditions is critical for reproducibility across teams.
- Adaptation may be needed for different tissue sources or T cell subsets.
- Careful handling of hazardous reagents and strict adherence to safety protocols are essential.
