植物细胞悬浮液中咖啡因的提取、酶活性及咖啡因合成酶基因的表达
2018年10月2日
本协议描述了一种高效的方法, 用于提取和定量的咖啡因在细胞悬浮液中的表达水平和评价咖啡因合酶酶活性的实验过程。编码这种酶的基因。
该方法有助于回答分析化学、生物化学和生物技术领域的关键问题。例如，咖啡因生物合成中发生了什么变化。这项技术的主要优点是，它可以应用于产生咖啡因的植物内模型。
首先，在冻干细胞中加入10毫升丙酮，并在与涡流混合器混合30秒之前密封烧瓶。然后，在 100 rpm 时将样品与旋转器在室温下混合 5 小时。在此之后，用25微升丙酮重新悬浮样品。
首先，将先前准备的咖啡因提取物的微升剂涂抹到硅胶板中。然后，在色谱室中开发TLC，其移动相为10毫升，即环丙烷丙酮。使用紧凑型紫外线灯在短波长紫外线中可视化咖啡因波段。
在此之后，通过密度测定在273纳米量化咖啡因水平。使用滤纸，真空过滤以前准备的电池悬浮液。然后，使用瓷砂浆用液氮和RNA分离试剂对细胞样品进行检测，直到其均质化。
接下来，将样品的500微升转移到无菌微离心管中。然后，加入300微升氯仿异丙胺醇和300微升平衡酚。将样品与涡流混合器混合，在20，000G下离心，在4摄氏度下15分钟。
在此之后，将上相的300微升转移到一个干净的微型离心管中。然后，加入200微升异丙醇，在负20摄氏度下孵育管子一小时。在颗粒中加入一毫升乙醇。
然后，在12，000G下将管离心10分钟，然后将液相 dec。接下来，在室温下干燥样品1.5小时。然后，用25微升DEPC处理水重新悬浮RNA提取物。
首先，在无菌微离心管中加入两微克总RNA提取物。然后，添加一个10X反应缓冲液的微升和一个DNase微升。使用 DEPC 处理的水将最终反应量带到 10 微升。
然后，将样品混合在2000G下，并离心机一分钟。接下来，在37摄氏度下孵育样品30分钟。在此之后，加入一微升50微摩尔二甲胺二胺四乙酸酯，以停止反应。
在65摄氏度下孵育样品10分钟。然后，将100纳米的RNA涂抹在一个阿加罗斯凝胶上，然后运行凝胶。使用凝胶照片文档系统可视化 RNA 的完整性。
首先，在微型离心管中加入2.5微克总RNA。然后，加入一个微升的寡氧脱氧米丁底剂，并将管子填充到13微升的最终体积中，用无核酸酶水。混合样品，以2000G离心1分钟。
在65摄氏度下孵育样品5分钟。然后在四摄氏度的两分钟。接下来，在样品中加入4个5X反应缓冲液微升、2个dNTP混合物微升和1微升逆转录酶。
然后，轻轻混合样品，在2000G下离心一分钟。在此之后，在45摄氏度下孵育样品50分钟，然后在70摄氏度下孵育10分钟。将 7.5 微升 2X Taq DNA 聚合酶和 0.1 微摩尔 RAX 添加到 PCR 微离心管中。
然后，添加0.75微升每个前进和反向底因为:放大CCS1基因。在此之后，添加 600 纳米的 CDNA 模板。如文本协议所述，实时PCR预造放大反应。
然后，使用 PCR 软件分析数据。称出一克蜂窝材料，用铝箔包装。将样品抽取后，将其转移到玻璃瓶中，并加入2.5毫升的萃取缓冲液。
接下来，在20，000G下将样品离心20分钟，温度为4摄氏度。将 500 微升等分转化为低温小瓶。使用分光光度计，使用双辛辛酸测定，以牛血清白蛋白为标准，测量样品在562纳米的蛋白质浓度。
首先，根据文本协议，在微型离心管中准备反应混合物。然后，将总体积增加至200微升，带100毫摩尔三升HCL。请记住，在制备与放射性物质进行反应混合物时，为了自己的安全，必须遵循适当的预防措施。
将微型离心管放在冰上，加入一个可溶性分数的体积，含有7至9毫克蛋白质。然后，在30摄氏度下旋转混合物，孵育30分钟。之后，将样品在11，000G下离心5分钟。
然后，小心地回收900微升的体积，将样品转移到闪烁的小瓶中。接下来，蒸发氯仿，在室温下完全干燥。在小瓶中加入五毫升的闪烁液。
最后，使用闪烁计数器分析咖啡因中的放射性。在该协议中，通过TLC密度测定法，通过可见光谱，在273纳米的最大吸收量下，对咖啡因的吸收模式进行了分析。TLC板上咖啡因的分离曲线显示RF介于0.34和0.39之间。
从悬浮细胞中提取的RNA表现出28、18和5s RRNA亚基的清晰分离，表明样品质量高。最后，从QPCR分析中获得熔融曲线，显示咖啡因合成酶基因的单一扩增产品。该技术开发后，为生物技术和生物化学领域的研究人员探索咖啡、茶和可可的二次代谢组织培养铺平了道路。
不要忘记，使用放射性和分子病理学可能是极其危险的，在执行本程序时，应始终采取预防措施，如使用手套、护目镜和放射性物质专用设备。
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概述
该协议描述了一种从阿拉比卡咖啡细胞悬浮液中提取和定量咖啡因的高效方法，并评估咖啡因合酶的酶活性。该方法有助于理解植物模型中的咖啡因生物合成。
关键研究组成部分
科学领域
- 分析化学
- 生物化学
- 生物技术
背景
- 咖啡因是各种植物中的重要代谢产物。
- 了解其生物合成可以提供对植物代谢的洞察。
- 评估酶活性对代谢研究至关重要。
- 该方法可以应用于产生咖啡因的体外模型。
研究目的
- 从阿拉比卡咖啡细胞悬浮液中提取和定量咖啡因。
- 评估咖啡因合酶的酶活性。
- 调查咖啡因生物合成的变化。
使用的方法
- 向冻干细胞中加入10毫升丙酮。
- 密封烧瓶并用涡流混合器混合30秒。
- 在室温下以100 rpm的速度混合样品五小时。
- 用25微升丙酮重新悬浮样品。
主要结果
- 该方法可以有效地从细胞悬浮液中提取咖啡因。
- 可以评估咖啡因合酶的酶活性。
- 通过这种方法获得了对咖啡因生物合成的洞察。
- 这种技术适用于各种体外植物模型。
结论
- 该协议提供了一种可靠的咖啡因提取方法。
- 它有助于研究植物中的咖啡因生物合成。
- 未来的研究可以在这些发现的基础上探索代谢途径。
常见问题
Executive Industry Relevance
This protocol enables quantitative assessment of caffeine biosynthesis in plant cell suspensions, supporting target validation in alkaloid pathway engineering. By linking enzymatic activity, transcript levels, and metabolite output, it provides mechanistic de-risking for metabolic engineering projects. The approach offers predictive confidence for prioritizing caffeine-related targets in natural product discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypothesis by quantifying caffeine synthase activity and gene expression in a disease-relevant system.
- Operational Value: Enables biological de-risking through direct measurement of enzyme function and transcript levels in caffeine-producing cells.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by correlating CCS1 expression with caffeine yield, informing target confidence.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by standardizing caffeine extraction and quantification via TLC densitometry at 273 nm.
- Operational Value: Ensures assay reproducibility through normalized protein quantification using BCA assay and radioactive tracer incorporation.
- Scalability Value: Facilitates platform reuse across in vitro plant models producing caffeine, enabling cross-species comparative analysis.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Connects discovery to preclinical continuity by measuring caffeine synthase activity as a functional biomarker of pathway engagement.
- Operational Value: Supports risk-adjusted advancement decisions through quantitative dependent variable measurements of enzyme activity and transcript levels.
- Translational Biomarker: Uses caffeine synthase gene expression (CCS1) as a mechanistic readout for pathway modulation in disease-relevant systems.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification by providing quantitative outputs on enzyme activity and gene expression in caffeine biosynthesis.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by measuring changes in caffeine biosynthesis through enzymatic activity and transcript analysis.
- Screening: Delivers assay readiness and quantitative outputs via densitometry-based caffeine quantification and scintillation counting of radioactive incorporation.
- Analytics: Enables comparative condition analysis through RF value separation (0.34–0.39) on TLC plates and melt curve validation of QPCR specificity.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by establishing caffeine synthase activity as a functional readout for metabolic pathway validation.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability for alkaloid pathway engineering across multiple in vitro plant models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in alkaloid biosynthesis.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of caffeine extraction and enzyme activity assays.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in metabolic engineering.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on quantitative enzyme activity and transcript data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in radiolabel handling, RNA isolation, and enzymatic assay protocols.
- Needs access to TLC plates, scintillation counter, UV visualization, and qPCR instrumentation.
- Demands cross-team standardization for radioactive sample handling and data normalization.
- Involves adaptation considerations for different plant cell suspension models and extraction efficiencies.
- Includes practical limitations related to radioactivity safety protocols and RNA integrity requirements.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:28
Caffeine Extraction in Cell Suspension of C. arabica L.
0:55
Conditions for the Assessment of Caffeine by Thin Layer Chromatography (TLC) Denistometry
1:29
Ribonucleic Acid (RNA) Isolation
2:55
Incubation of RNA Transcript with Deoxyribonuclease (DNase)
3:59
Complementary Deoxyribonucleic Acid (cDNA) Synthesis
5:03
Real-Time Quantitative PCR (qPCR) to Amplify the Gene CCS1
5:43
Total Protein of Cell Suspensions of C. arabica L.
6:26
Enzymatic Assay for Caffeine Synthase
7:39
Results: Enzymatic Activity of Caffeine Synthase Gene Evaluated via qPCR
8:30
Conclusion
