从小鼠的补丁中提取体液免疫的关键参与者: 先进和优化的淋巴细胞分离协议

该方法可以回答有关小鼠Peyer的补丁分离T和B细胞子集的表型关键问题。特别是卵泡T辅助和生殖中心B细胞群。这项技术的主要优点是，它免除了几个人工制备步骤，如基于胶原酶的消化，损害了分离淋巴细胞的质量和特性。

首先将鼠标置于上部位置，用70%乙醇对腹部进行消毒。使中线腹部切口通过皮肤和腹膜从阴极到肋骨笼打开腹腔，并找到腹腔和腹腔结。在交界处尽可能远切，将小肠与切库姆分离。

用剪刀切开肠子，小心地将整个小肠切到皮洛里括约肌。将子宫与十二指肠之间的结点截断，将小肠从腹腔中完全分离，将分离的小肠放入含有冷RPMI介质的6孔板中，并在冰上补充10%的胎儿牛血清或FBS。然后，轻轻搅拌组织，直到所有部分浸入冷介质中。

当所有肠子都收获后，用钳子抓住肠一边的肠子脂肪，将样品、肠侧向下放在纸巾上。使用 RPMI 10%FBS 滋润整个肠道部分，以避免组织脱水和粘性，并定位 Peyer 的斑块，这些斑块显示为白色多叶结聚合体，在肠道壁的抗脑侧有花椰菜状形状。要收获Peyer的贴片，请使用弯曲的手术剪刀，曲线朝上，轻轻地从其远端和近端边界切除每个贴片，注意排除周围的肠道组织，并在收集时将Peyer的贴片放入含有冰冷RPMI 10%FBS的12孔板的单个孔中。

当所有补丁都获得时，使用剪刀切割1毫米微移液器尖端，使直径足够大，足以吸气单个Peyer的补丁，并转移Peyer的补丁到150毫米锥形管每只鼠标包含25毫升37摄氏度RPMI 10%FBS。然后将管在37摄氏度的轨道摇床中，在125-150 RPM下连续搅拌10分钟。在搅拌结束时，将 Peyer 的贴片转移到每只小鼠 140 微米细胞过滤器上，并使用每个动物一个 10 毫升注射器柱塞的橡胶端，通过网格轻轻地将 Peyer 的贴片转移到单个 50 毫升锥形管中。

用 15-20 毫升冷 RPMI 10%FBS 冲洗过滤器，通过离心收集细胞。在仔细丢弃上清液后，以每毫升RPMI 10%FBS浓度约1倍10的7个细胞重新暂停细胞进行计数。然后将每200微升中第6个细胞转移到96井圆底板的每个井中，通过离心将细胞颗粒入室。

在用轻柔轻拂液丢弃上清液后，离心机用200微升的站立缓冲液清洗细胞。将细胞贴上100微升可修复的可行染料的标签，在4摄氏度下在无蛋白质缓冲液中稀释30分钟，不受光线影响，然后进行2次洗涤和新鲜染色缓冲。丢弃上清液后，在FC块的20微升中重新暂停颗粒，在4摄氏度下孵育15分钟，然后加入80微升的原表面抗体鸡尾酒，在冰上30分钟，免受光。

在表面抗体孵育结束时，离心机在过量的染色缓冲液中清洗细胞两次，并在100微升的二次表面染色溶液中重新填充颗粒，并辅以链球菌素。在防光的冰上15分钟后，离心机在新鲜的染色缓冲液中清洗细胞2次，并在200微升固定剂中重新填充颗粒，渗透工作溶液在冰上孵育不超过20分钟，不受光。在孵化结束时，立即将板离心，随后离心机在200微升的渗透缓冲液中每井。

接下来，将细胞重新在FC块的20微升中重新填充，如证明的渗透缓冲液中稀释，然后加入80微升的细胞内抗体鸡尾酒，在室温下30分钟，免受光线影响。用100微升的渗透缓冲液清洗细胞，然后用200微升的渗透缓冲液进行第二次清洗。然后，将颗粒重新在200微升染色缓冲液中，将细胞转移到相应的5毫升流量细胞计量分析管中，最终每管400微升染色缓冲液。

Peyer 的斑块在整个小肠中分布不均匀，而是更密集地分布在组织的端端和近端。该协议有助于分离Peyer的斑块淋巴细胞群体，该群体表现出一个前向侧分散分布，类似于观察到的飞毛细胞，其细胞生存能力大于95%。CD4 CD19双阳性细胞约占Peyer的斑块淋巴细胞总数的1%。

这些表示CXCR5和GL7的高水平，如果不排除，可能导致假阳性结果在T帮助器卵泡和细菌中心B细胞的浇注，分别。与其他继发淋巴器官相比，Peyer的斑块在稳定状态条件下的细菌中心B细胞比例显著提高，占B细胞总数的2-10%。与生殖中心B细胞一样，卵泡T-帮助细胞的分量在个别未免疫小鼠中也各不相同，其范围为总数的10-20%，CD4正Peyer的贴片T淋巴细胞群体。

基于胶原蛋白酶的酶消化导致CXCR5 T-帮助器卵泡细胞表达的大量减少，同时使其他表面分子的表达不受影响。经过这一开发，这项技术为识别Peyer的斑块中涉及粘膜和腐殖质免疫的关键细胞因子铺平了道路。