轮状病毒的特定生长速率及细胞结合能力的测定

使用此处介绍的测定方法，可以评估轮状病毒菌株之间的表型差异，其中独特的菌株被分离。具体到轮状病毒耐消毒剂菌株的表型变化。为了使用斑块测定实现清晰的定量输出，选择轮状病毒株和血清的适当组合至关重要，其中轮状病毒很好地适应了血清。

演示这个程序的将是来自我实验室的博士生Syun-sukeKadoya。从液氮容器中去除含有MA104细胞系的冷冻管。将 CryoTube 放在 37 摄氏度的水浴中，以解冻细胞。

在T75烧瓶中加入一毫升的细胞悬浮液至20毫升含血清介质。在37摄氏度和5%CO2的孵化器中孵育烧瓶两到三天。一旦细胞单层达到80%的汇合，取出上能，用5毫升1XDulbecco的PBS洗涤细胞两次。

在烧瓶中加入四毫升0.05%的三辛-EDTA，并在37摄氏度下孵育5分钟，将细胞从烧瓶中分离出来。将电池悬浮液转移到15毫升管中，并在190克下离心5分钟。丢弃上一级物质，将颗粒细胞重新在一毫升含血清介质中。

然后用介质稀释重新稀释的细胞100倍。将稀释的细胞悬浮液加入六井板的每个井中，进行斑块测定。将稀释的细胞悬浮液加入24井板的每个井中，进行细胞结合测定。

在37摄氏度的培养箱中孵育板和5%CO2不饱和蒸汽两三天。将一根含有1毫升病毒悬浮液的管子从零下80摄氏度的储存转移到37摄氏度的水浴中解冻。从猪胰腺中加入每微升一微克的胰腺，加入一毫升的病毒悬浮液，然后加入漩涡。

在37摄氏度和5%CO2不饱和蒸汽下孵育病毒悬浮液30分钟。使用无血清介质稀释激活的病毒悬浮液，将感染的多重性（MOI）调整为每细胞0.1 pfu。在细胞电镀后三天，在T75烧瓶中加入一毫升稀释的病毒悬浮液到MA104细胞中。

在37摄氏度下用病毒孵育细胞一小时，每15分钟轻轻摇动一次烧瓶。然后加入30毫升的无血清介质，每毫升胰蛋白酸含有4微克，从猪胰腺到烧瓶。在37摄氏度和5%CO2下饱和蒸汽下孵育烧瓶。

在感染后零、六、十二、十八、二十四和三十六小时在烧瓶中收集一毫升的上流液，并使用移液器更换 1.5 毫升类型的上流液。在零下80摄氏度的15分钟内进行冷冻循环，随后在37摄氏度的水浴中融化15分钟。然后在12，600g下离心管，在4摄氏度下10分钟。

收集上一点。使用蒸馏 0.2 微米过滤器过滤上清液，以去除细胞分数。将上一液储存在零下80摄氏度，直到将其应用于斑块检测，以测量病毒滴度。

当准备进行斑块检测时，将含有收集的上流水液的管子放在37摄氏度的水浴中。将 trypsin 加入 10 倍稀释样品的 1 毫升，在 37 摄氏度下孵育 30 分钟。在这30分钟的孵育过程中，在取出含有血清的介质后，用两毫升1X PBS在六井板中小心清洗MA104细胞。

使用无血清介质连续稀释孵育样品，将稀释样品的一毫升接种到每个井中。在37摄氏度和5%CO2不饱和蒸汽下孵育板90分钟，每15分钟轻轻摇动一次板。孵育后，从六井板取出孵化。

每毫升尝试素添加四微克到准备的介质中。轻轻地，但立即添加三毫升的介质混合与阿加罗斯凝胶到每个井。让加糖凝胶在室温下凝固超过10分钟。

然后在37摄氏度和5%CO2不饱和蒸汽下孵育板两天。接下来，将一毫升0.015%中性红溶液用1X PBS稀释到每一个井中，并在相同的条件下孵育。三小时后取出染料，继续孵育一天。

第二天，计算每个井中的斑块数，并计算每毫升的pfu。在斑块检测前仔细检查细胞汇合，以确保斑块编号。对于细胞结合测定，从猪胰腺中每微升一微克的胰蛋白石加入一毫升病毒悬浮液，然后加入漩涡。

使用无血清介质稀释病毒悬浮液，将 MOI 调整为每个细胞一个 pfu。用一毫升三缓冲盐水在24孔板中清洗MA104细胞两次。现在，用100微升稀释病毒悬浮液将细胞接种到24井板的每个井中。

在4摄氏度下孵育板90分钟，每15分钟轻轻摇晃一次。去除病毒，用一毫升三缓冲盐水清洗细胞两次。要提取轮状病毒的双链RNA，请在每个井中加入140个1X PBS微升和RNA萃取缓冲液560微升。

与移液器充分混合，直到未看到缓冲液中细胞的雾霾。根据制造商的协议，在回收双链RNA后，将含有双链RNA提取物的1.5毫升管放在95摄氏度的热块上5分钟，使RNA变性。然后立即将管子放在冰上，孵育超过两分钟。

使用逆转录试剂盒合成cDNA。将四微升变性病毒RNA溶液加入含有16微升反应混合物的PCR管中，并小心地将其与移液器混合，以便不产生气泡。旋转管后，使用热循环器执行逆转录。

对于定量 PCR，请使用针对轮状病毒 NSP3 基因组段 963 至 1，049 区域的淬火器插入探针。用PCR级水连续稀释标准质粒，并着手进行定量PCR的主混合。在 96 孔 PCR 板的井中加入 20 微升的主混合物。

然后通过移液10次混合5微升cDNA样品或标准质粒的5微升。根据文本协议中的条件执行定量 PCR。最后，计算与MA104细胞表面绑定的轮状病毒基因组，如文本协议所述。

这里显示的是轮状病毒的生长曲线。通过将最方形的方法应用于修改后的 Gompertz 模型，特定增长率估计为 0.197，滞后期估计为 6.61 小时。固定阶段到初始滴度的相对病毒滴度为 3.15。

在6个经检测的轮状病毒克隆中，特定增长率的估计值在0.19到0.27之间。这些估计值是可靠的，因为模型拟合中的确定值系数超过 0.98。细胞结合测定的结果显示为结合效率，即结合病毒颗粒与幼崽中存在的粒子的比率。

我们的RV病毒与细胞表面结合，每毫升约10，000份，使用24井板进行细胞结合测定时，其结合效率约为1%。由于培养的细胞对物理应力敏感，请小心轻轻但快速地倒缓冲液和搅拌。从本质上讲，一个新的病毒系统已经推出。

利用该系统，我们可以用仪器评估真正的细胞结合能力和特定增长率。我们的协议有利于测量表型特征。通过检查不同的新出现菌株，你可以帮助评估其病毒的新疫苗。

病毒被指定为BSL-2病原体，因此您需要准备BSL-2实验室来执行这个程序。