轮状病毒特异性生长速率和细胞结合能力的检测方法

利用本文所述的检测方法，可评估不同轮状病毒株之间的表型差异，其中分离出独特的病毒株。具体而言，本研究探讨了对消毒剂具有抗性的轮状病毒株的表型变化。为了在空斑实验中获得清晰的定量结果，关键在于选择合适的轮状病毒株与血清组合，使轮状病毒能够良好地适应该血清环境。

演示该实验步骤的是我实验室的博士生 Syun-suke Kadoya。从液氮容器中取出一支含有 MA104 细胞系的冻存管，将其放入 37 摄氏度的水浴中，以解冻细胞。

将1毫升细胞悬液加入含有血清的培养基中，总体积为20毫升，置于T75培养瓶中。将培养瓶放入37摄氏度、5%CO2的培养箱中培养2至3天。当细胞单层达到80%融合度时，移除上清液，并用5毫升1×Dulbecco磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞两次。

向培养瓶中加入 4 毫升 0.05% 胰蛋白酶-EDTA，于 37 摄氏度孵育 5 分钟，使细胞从培养瓶壁脱落。将细胞悬液转移至 15 毫升离心管中，在 190 ×g 离心 5 分钟。弃去上清液，并将沉淀的细胞重悬于 1 毫升含血清培养基中。

然后用培养基将重悬的细胞稀释100倍。取3毫升稀释后的细胞悬液加入至6孔板的每个孔中，用于噬斑实验；取1毫升稀释后的细胞悬液加入至24孔板的每个孔中，用于细胞结合实验。

将培养板置于37摄氏度、5% CO2、未饱和蒸汽的培养箱中孵育两至三天。将一支含有1毫升无血清培养基中病毒悬液的试管从-80摄氏度保存条件下取出，转移至37摄氏度水浴中解冻。向1毫升病毒悬液中加入来自猪胰腺的胰蛋白酶至终浓度为1微克/微升，随后涡旋混匀。

在37摄氏度、5% CO2及未饱和蒸汽条件下孵育病毒悬液30分钟。用无血清培养基稀释活化的病毒悬液，将感染复数（MOI）调整至每细胞0.1 pfu。在细胞接种后第三天，向T75培养瓶中的MA104细胞加入1毫升稀释后的病毒悬液。

将细胞与病毒在37摄氏度下孵育1小时，每15分钟轻轻摇动培养瓶一次。然后向培养瓶中加入30毫升含4微克/毫升猪胰蛋白酶的无血清培养基。将培养瓶置于37摄氏度、5% CO2的不饱和蒸汽环境中孵育。

在感染后 0、6、12、18、24 和 36 小时，分别从烧瓶中收集 1 毫升上清液，并用移液器将 1.5 毫升离心管中的上清液更换。在 −80 °C 条件下进行 15 分钟的冻融循环，随后在 37 °C 水浴中融化 15 分钟。然后在 4 °C 条件下以 12,600 ×g 离心 10 分钟。

收集上清液。使用蒸馏的0.2微米滤器过滤上清液，以去除细胞组分。将上清液储存在-80摄氏度，直至用于空斑实验以测定病毒滴度。

准备进行蚀斑试验时，将装有收集上清液的试管置于37摄氏度水浴中。向1毫升10倍稀释的样品中加入胰蛋白酶，并在37摄氏度孵育30分钟。在此30分钟孵育期间，移除含血清培养基后，用2毫升1×PBS小心清洗六孔板中的MA104细胞。

用无血清培养基对孵育后的样品进行系列稀释，并将1毫升稀释后的样品接种至每个孔中。将培养板在37摄氏度、5%CO2的不饱和蒸汽条件下孵育90分钟，每15分钟轻轻摇动培养板一次。孵育结束后，从六孔板中移除接种物。

向准备好的培养基中加入每毫升4微克的胰蛋白酶。立即将3毫升与琼脂糖凝胶混合的培养基轻柔地加入每个孔中。在室温下静置10分钟以上，使琼脂糖凝胶充分凝固。

然后将培养板置于37摄氏度、5% CO2、未饱和蒸汽条件下孵育两天。接着向每孔加入1毫升用1×PBS稀释的0.015%中性红溶液，在相同条件下孵育。三小时后移除染料，并继续孵育一天。

第二天，计数每个孔中的噬斑数量，并计算每毫升的噬斑形成单位（pfu）。在进行噬斑测定前，仔细检查细胞的汇合度，以确保噬斑数量的准确性。对于细胞结合实验，向1毫升病毒悬液中加入来自猪胰腺的胰蛋白酶，浓度为每微升1微克，然后涡旋振荡。

用无血清培养基稀释病毒悬液，使感染复数（MOI）调整为每细胞1个空斑形成单位（pfu）。在24孔板中用1毫升三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水（TBS）洗涤MA104细胞两次。随后，将100微升稀释后的病毒悬液接种至24孔板的每个孔中。

将培养板在4 °C孵育90分钟，每15分钟轻轻振荡一次。弃去病毒接种液，用1毫升Tris缓冲盐水洗涤细胞两次。为提取轮状病毒的双链RNA，向每孔中加入140 µL 1× PBS和560 µL RNA提取缓冲液。

用移液器充分混匀，直至缓冲液中细胞的浑浊现象消失。根据生产商说明书回收双链RNA后，将含有双链RNA提取物的1.5毫升离心管置于95摄氏度的加热块中加热5分钟，以使RNA变性。随后立即置于冰上，孵育超过2分钟。

使用反转录试剂盒合成 cDNA。将 4 µL 变性病毒 RNA 溶液加入含有 16 µL 反应混合液的 PCR 管中，用移液器轻轻混匀，避免产生气泡。离心收集管壁液体后，使用热循环仪进行反转录反应。

进行定量 PCR 时，使用针对轮状病毒 NSP3 基因组片段第 963 至 1,049 区域的带淬灭基团的探针。用 PCR 级水对标准质粒进行连续稀释，然后配制定量 PCR 的预混液。向 96 孔 PCR 板的各孔中加入 20 微升预混液。

然后用移液器吹打10次，混合5 µL cDNA样品或5 µL标准质粒。按照文本方案中的条件进行定量PCR。最后，根据文本方案中所述方法计算与MA104细胞表面结合的轮状病毒基因组。

图中显示了轮状病毒的生长曲线。通过将最小二乘法应用于修正的Gompertz模型，估计其特异性生长速率为0.197，滞后期为6.61小时。在稳定期，病毒相对滴度与初始滴度的比值为3.15。

在测试的六种轮状病毒克隆中，比生长速率的估计值介于 0.19 至 0.27 之间。这些估计值是可靠的，因为模型拟合的决定系数大于 0.98。细胞结合实验的结果以结合效率表示，即结合的病毒颗粒数与接种物中病毒颗粒总数的比值。

在使用24孔板进行细胞结合实验时，我们的RV病毒颗粒与细胞表面的结合量约为每毫升10,000个拷贝，结合效率约为1%。由于培养的细胞对物理应力敏感，因此在加入缓冲液和琼脂时需轻柔且迅速。本质上，已为这些病毒引入了一种新的系统。

利用该系统，我们可以通过仪器评估细胞的实际结合能力及特异性生长速率。本方案在测量表型特征方面具有优势。通过检测新出现毒株的不同特性，可协助评估针对这些病毒的新疫苗。

这些病毒被归类为BSL-2级病原体，因此您需要准备BSL-2级实验室内进行本操作。