Name: 斑马鱼癫痫模型中的行为和生理分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 s
Description: 了解斑马鱼癫痫模型的行为与生理分析方法。本研究通过DEPDC5基因瞬时敲低建立局灶性癫痫模型，结合行为学检测与膜片钳电生理技术，为神经发育及癫痫机制研究提供可靠平台。

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我们感谢在ICM电生理平台进行神经生理学实验期间提供帮助的工作人员。同时感谢Anca Marian提供的技术支持。SC的研究得到了Trampoline基金（项目编号#21488）的资助。EK的研究得到了法国肌肉萎缩症协会基金（AFM，项目编号#18469）以及欧洲研究委员会整合基金（ERC Consolidator Grant，ALS-Networks）的资助。HC获得了法国医学研究基金会（Fondation pour la Recherche Médicale，项目编号PLP20141031462）和ARSLA提供的博士生奖学金支持。AD和RM的研究工作获得了罗马尼亚国家科学研究院（CNCS-UEFISCDI）三项基金的资助（项目编号分别为PN-III-P4-ID-PCE-2016-0010、PN-III-P2-2.1-PED-2016-0007和COFUND-NEURON-NMDAR-PSY），以及欧盟“地平线2020”研究与创新计划（资助协议编号668863-SyBil-AA）和美国政府资助的美国国家科学基金会（NSF-IOS-1656830）的资助。&#160;

实验程序已获得国家和机构伦理委员会的批准。
1. 斑马鱼胚胎中DEPDC5基因的瞬时敲低&#160;
<ol>
	<li>工具准备：
	<ol>
		<li>准备硅胶弹性体涂层注射培养皿：按照试剂盒（见材料表）中的基础剂与固化剂以10:1的比例混合。将混合物填充至35 mm培养皿一半高度。待硅胶完全硬化后方可使用（可能需要数天时间）。&#160;</li>
		<li>制备1.2 mmol/L的反义吗啉代寡核苷酸（AMO；见材料表）储备液。向300 nmole冻干AMO中加入250 µL无菌水，得到1.2 mmol/L的储备液。为确保完全溶解，将管子在65 °C加热5分钟，短暂涡旋。用塑料封口膜密封管盖（见材料表）。&#160;</li>
		<li>对于对照性挽救实验，制备含有克隆于pCS2骨架或类似斑马鱼兼容表达载体中的人源DEPDC5 cDNA的表达质粒（见材料表）。作为阴性对照，在cDNA中引入导致提前终止密码子的突变（p.Arg487*）。</li>
		<li>制备胚胎用水：在反渗透水中加入0.06 g/L水族盐（见材料表）和0.5 mg/L亚甲蓝。</li>
		<li>注射当天，使用拉针仪（见材料表）制备显微注射用硼硅酸盐玻璃毛细针。在拉针仪上设定合适的温度参数。使用长度为10 cm、外径/内径为1/0.5 mm的硼硅酸盐玻璃毛细管，拉制成两根长约5 cm、尖端细长（约1 cm）的毛细针。&#160;</li>
		<li>若针尖过于纤细导致溶液无法排出，可在显微镜下用镊子轻轻折断锥形尖端的最末端。</li>
		<li>注射前立即配制AMO的工作液。为确保实验结果的可重复性，务必每次新鲜配制。将AMO储备液在65 °C加热5分钟。配制5 µL注射样品，其中含终浓度为0.02%的快绿染料（见材料表）以及以工作浓度溶于水的AMO。&#160;</li>
		<li>通过剂量-反应曲线为每个基因经验性确定AMO的工作浓度。工作浓度应能有效敲低目标基因，同时不引起一般性毒性（如明显的形态学缺陷）。通常AMO工作浓度范围为0.2 mmol/L至1 mmol/L（本研究中确定0.4 mmol/L为有效浓度18）。对照用错配吗啉代寡核苷酸（Mismatch morpholino）应以与有效AMO相同的浓度注射。&#160;</li>
		<li>涡旋混匀各管后短暂离心，使液滴沉至管底。</li>
		<li>对于挽救实验，配制5 µL注射样品，其中AMO稀释至工作浓度，cDNA表达质粒溶于水中，终浓度需经验性确定。对于DEPDC5表达及阴性对照质粒，100 ng/µL浓度可有效实现表型挽救。&#160;</li>
	</ol>
	</li>
	<li>胚胎准备：
	<ol>
		<li>显微注射前一天设置斑马鱼交配缸。注射当天早晨移除隔板以促进产卵。使用细筛在盛有胚胎用水的100 mm培养皿中收集卵子。在收集后20–30分钟内完成注射，此时卵子应处于单细胞阶段。&#160;</li>
		<li>用塑料巴斯德移液管挑选60–80枚卵子，将其排列于硅胶涂层的培养皿中用于注射。硅胶表面可防止卵子在注射过程中滑动。移除大部分胚胎用水，仅保留足以覆盖卵子一半体积的液体。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>显微注射：
	<ol>
		<li>将注射液吸入玻璃针中。将玻璃针垂直插入含有注射液的管中，确保针的底端接触液体。静置数分钟，直至带颜色的注射液通过毛细作用上升并在针尖处可见。</li>
		<li>将装有液体的针固定在显微注射仪的注射手柄上（见材料表）。</li>
		<li>打开空气压缩机，调节压力设定，使每次注射体积约为2 nL。&#160;</li>
		<li>为计算注射液体积，将一滴矿物油置于切片载玻片上。使用设定的压力和时间参数注射含染料的溶液。测量注射液滴的直径，并使用公式体积=4/3×π×(d/2)3计算总体积，其中d为所测注射液滴的直径。</li>
		<li>在4倍放大倍率的解剖双目显微镜下，对处于单细胞阶段的卵子进行注射，针头需穿透卵膜和卵黄，将溶液直接注入细胞内。</li>
		<li>将注射后的胚胎收集至含胚胎用水的100 mm培养皿中，标记培养皿并置于28 °C培养箱中孵育。&#160;</li>
		<li>确保培养箱温度长期稳定，因为胚胎发育速率对温度敏感。例如，较高温度会加速生长，而发育阶段对于准确评估表型至关重要24。</li>
		<li>注射后6–8小时检查卵子质量，使用塑料巴斯德移液管移除死亡和未受精的胚胎。</li>
		<li>次日早晨，使用塑料巴斯德移液管统计并移除各培养皿中的死亡胚胎。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 行为分析&#160;
<ol>
	<li>28 hpf 时的全局活动分析：
	<ol>
		<li>在显微注射后第二天下午（28 hpf）进行测试，确保每次实验的测试时间保持一致，以便进行有效的统计分析，因为胚胎发育速度非常快。</li>
		<li>用胚胎用水填充一个 35 mm 的培养皿（测试皿），并在开始测试前将其置于培养箱（28 °C）中至少预热 15 分钟。</li>
		<li>将裁剪至合适尺寸的塑料网格（1.2×1.2 mm）放置在测试皿底部。</li>
		<li>由另一位实验人员随机化胚胎测试顺序，并对被测条件的名称进行盲法编码。&#160;</li>
		<li>确保各实验组之间的死亡率无显著差异，且与未注射胚胎相比无明显变化，以保证表型的特异性。所有实验组中死亡胚胎的比例不应超过 10–13%18。</li>
		<li>使用塑料巴斯德移液管将 10–12 个仍处于卵膜内的胚胎放置在塑料网格上。向测试皿中加入足够的胚胎用水，使胚胎完全浸没但不漂浮。如有需要，可小心使用塑料吸头轻柔移动胚胎，使其位于网格上。</li>
		<li>使用连接在解剖显微镜上的视频摄像机（见材料表），记录一段固定时长的自发性卷曲活动（通常录制 10–20 分钟的视频即可获得用于定量分析的代表性活动爆发样本）&#160;</li>
		<li>将胚胎放回各自的培养皿中，并重新放回培养箱。根据每组所需样本量（由 90% 功效分析确定），重复实验。</li>
		<li>为分析总体自发运动，使用 ZebraLab 系统（见材料表）。利用其活动量化模块，上传录制的视频，并根据每个胚胎的位置适当设定追踪区域。将冻结阈值和爆发阈值分别设为 10 和 50。&#160;</li>
		<li>运行自动视频分析程序，该程序将量化每个定义区域内的总活动量，随后将数据集导出为电子表格，并使用数据分析软件进行进一步分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>48 hpf 时的触诱发逃逸反应（TEER）：
	<ol>
		<li>在注射后两天的早晨（受精后 48 小时）进行测试。</li>
		<li>测试前至少 2 小时，使用精细镊子去除胚胎的卵膜。确保每次实验中去膜和行为测试的时间保持一致。&#160;</li>
		<li>用胚胎用水填充一个 130 mm 的培养皿（测试皿），并在开始测试前将其置于培养箱（28 °C）中至少预热 15 分钟。</li>
		<li>计数并移除死亡和形态异常的幼鱼。记录每组的数目。</li>
		<li>由另一位实验人员随机化测试顺序，并对被测条件的名称进行编码。</li>
		<li>将摄像机（见材料表）架设在测试皿上方，确保整个测试皿处于视野范围内。在视野中放置一把刻度尺，可用于距离的内部校准。</li>
		<li>使用塑料巴斯德移液管将一个胚胎置于测试皿中央，并以 30 fps 的采集速率开始录像。</li>
		<li>使用精细塑料吸头轻轻 flick 动作触碰胚胎尾部。</li>
		<li>当幼鱼完成运动后停止录像。</li>
		<li>将胚胎从测试皿中移出，放入盛有胚胎用水的新培养皿中。根据每组所需样本量（由 90% 功效分析确定），重复测试。</li>
		<li>将胚胎放回原始培养皿中，并重新放回培养箱。</li>
		<li>为分析游泳行为参数，将录制的视频导入 ImageJ 分析软件。下载并安装 ImageJ 的 Manual Tracking 插件（见材料表）。在菜单中选择工具 | 插件 | 手动追踪以启动插件。&#160;</li>
		<li>在对话框中输入图像的校准比例尺。在摄像视野中包含刻度尺有助于将厘米转换为像素。&#160;</li>
		<li>选择添加轨迹，并在第一帧中点击斑马鱼幼鱼的图像开始轨迹追踪。每添加一个点，帧会自动前进。&#160;</li>
		<li>持续追踪运动轨迹，直至游泳阶段结束。&#160;</li>
		<li>在追踪窗口中选择结束轨迹，提取 X-Y 坐标，并计算总距离、速度和转向角。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 电生理学分析
<ol>
	<li>试剂和工具准备：
	<ol>
		<li>在胚胎水中配制1%琼脂糖（见第1.1.4节）。将液态琼脂糖分装至微量离心管中，并置于42 °C加热块上保温，防止琼脂糖凝固。</li>
		<li>配制记录液（单位：mmol/L）：NaCl 134，KCl 2.9，CaCl2 2.1，MgCl2 1.2，葡萄糖 10，HEPES 10，pH 7.8。</li>
		<li>使用拉制仪拉制硼硅酸盐玻璃微电极，使其尖端开口为1.5–2 µm（5–6 MΩ）2·kg·s−3·A−2&#160;电阻）未抛光。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>斑马鱼幼虫电生理实验前准备&#160;
	<ol>
		<li>将鱼置于玻璃底培养皿中（参见 材料表并去除多余的细胞外培养基，以确保将鱼体尽可能贴近盖玻片。&#160;</li>
		<li>使用塑料巴氏吸管，在幼鱼上方及周围加入温热的液体琼脂糖，用量以恰好覆盖鱼体为宜。在琼脂糖凝固过程中，用精细镊子将鱼体调整至培养皿中央，腹侧朝下，呈直线排列。&#160;</li>
		<li>加入含有10 µM潘库溴铵的2 mL记录液（参见 材料表) 以阻断神经肌肉传导。添加麻痹剂对于消除记录过程中因微小运动引起的伪迹是必要的。&#160;</li>
	</ol>
	</li>
	<li>电生理记录
	<ol>
		<li>用记录液填充微量移液管。</li>
		<li>使用膜片钳放大器（参见 材料表在电压钳制配置下，将电极浸入浴液中测量电极电阻，以确认其数值正确。</li>
		<li>使用20倍物镜，将幼虫头部置于视野中央，降低微电极至脑内视顶盖区域的记录位置。</li>
		<li>将膜片钳放大器切换至电流钳模式，并将钳制电流固定为 0 mA。</li>
		<li>使用1 kHz低通滤波器、1 kHz采样频率和10倍数字增益，记录60分钟的自发活动以确定基线活动水平。</li>
		<li>在持续1小时的基线记录后，加入200 µL戊四氮（pentylenetetrazol，PTZ，参见 材料表) 将300 mmol/L的溶液加入浴液中，使PTZ的终浓度为20 mmol/L。</li>
		<li>在PTZ中记录神经元活动，持续120分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>去极化事件判定
	<ol>
		<li>野外记录事件的动力学过程非常缓慢（感兴趣频率范围为 0.005–0.2 s）-1）。因此，使用低通滤波器（五阶巴特沃斯低通滤波器，截止时间为100秒）对信号进行滤波-1) 以避免混叠。从采样帧率（此处为 1 ks-1) 下降至 250 秒-1 （原始信号）</li>
		<li>为了识别每次去极化事件的时间戳，使用检测信号（DETECTION SIGNAL），该信号是记录信号的高通滤波版本（Butterworth 一阶高通滤波器，截止时间为 0.01 s）-1).&#160;</li>
		<li>通过消除低频成分，可使用简单的阈值法检测去极化事件。采用固定阈值进行噪声消除和事件检测（本研究中使用0.3 mV）。</li>
		<li>通过一系列时间间隔小于4秒的阈值跨越事件来表征去极化事件。根据连续的阈值跨越序列确定去极化事件的起始和结束时间。持续时间短于40毫秒的事件可作为噪声予以剔除。</li>
		<li>计算未滤波信号（RAW SIGNAL）中事件的幅度，以消除低通滤波对事件峰值影响所导致的误差。根据滤波信号中确定的时间戳，从原始信号中选取去极化波形片段。将所选原始信号波形片段的最大值与最小值之差作为其幅度进行测量。 
		注意： 执行步骤 3.4 — 去极化事件确定 — 以及获取 图1 作为提供 补充文件 附在本文中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

癫痫是一种复杂的神经系统疾病，其病因多种多样，随着基因测序技术的发展，这些病因正逐步被阐明25,26,27。为了有效推进转化研究，需要灵活多样的动物模型，以深入理解遗传性癫痫的病理机制，并为该疾病的各类亚型开发靶向治疗策略。斑马鱼模型在重现癫痫的主要特征以及提供可靠的抗癫痫药物筛选读数方面已表现出显著效果5,28。在基因修饰的斑马鱼中可观察到自发性癫痫发作15,29,30,31，并对这些模型进行的神经生理学分析28已证实癫痫样行为具有神经元活动基础32,33。体型微小的斑马鱼幼体适用于在96孔板中进行化合物筛选，通过自动化检测简单行为（如自发游泳）即可快速识别潜在的治疗药物。
本文所介绍的DEPDC5基因敲低模型，是通过将反义吗啉环寡核苷酸（AMO）注射到斑马鱼胚胎中，以阻断发育过程中的基因表达而获得的。该模型在幼虫发育的不同时间点表现出若干关键的表型特征，这些特征可作为化学或遗传筛选实验中评估治疗效果的指标。AMO介导的基因敲低是一种强大的技术，相较于化学诱导的癫痫模型具有优势，因为它能够特异性靶向目标基因的表达，从而有助于揭示由特定基因突变所触发的潜在致病机制。尽管化学诱导剂在药物筛选中仍是有力工具，但其可能通过多种细胞通路发挥作用，而这些通路并不总是与所研究的基因突变相关。虽然AMO注射技术在操作者熟练掌握后相对简单，但也存在一些局限性。注射必须在受精卵单细胞阶段进行；根据我们的经验，若在较晚阶段注射会显著增加表型的变异性。这限制了可用于注射的时间窗口，因此建议采用分时段连续产卵的策略进行实验安排。我们通常进行4-5次交配，每隔15-20分钟取卵一次，以便在获取下一批卵之前完成上一批的注射。此外，不同实验之间必须注意在相同的时间点评估表型，因为刻板行为在发育初期的前几天内变化迅速。AMO的注射体积和浓度也必须严格控制，因为过量注射可能导致非特异性毒性，从而掩盖特异性表型。引言中提到的各类对照实验对于确定合适的注射剂量及其对应的表型至关重要。
斑马鱼幼体脑部的现场记录是研究不同脑部疾病相关基因突变对全脑神经元活动产生有害影响的有效工具34。在这些实验条件下观察到的去极化事件，是评估药物在不同癫痫状态下电生理效应的既定方法15,35。然而，对这些效应的评估大多停留在定性层面，而非定量分析，且分析过程中依赖主观观察者作为判断主体。本文中，我们开发了一种自动检测策略，可客观地量化去极化事件的发生频率、幅度和持续时间，并能够评估这些参数随时间的变化，或在不同遗传或药理干预下的演变情况。&#160;
此处展示的代表性结果表明，在4-6天龄斑马鱼中，DEPDC5基因敲低遗传模型与错配对照组相比，在应用PTZ诱导类似癫痫样电活动前后所表现出的预期场电位活动。此前，我们已证明DEPDC5基因敲低条件下基础电活动显著升高18。本文结果显示，这两种条件下对PTZ（一种化学性癫痫样活动诱导剂）的反应在时间进程上具有相似的趋势，初期表现为频率相对较低、幅度较高的去极化事件，随后转为频率较高、幅度较低的去极化事件。场电位记录事件具有较慢的动力学特征（关注频率范围为0.005-0.2 s-1），因此本方案中同时使用低通和高通滤波器来分离目标事件。在去除低频噪声后，采用固定阈值法检测去极化事件。由于去极化事件的存在显著影响信号的统计特性，因此无法利用整个信号的标准差来确定该阈值。不同数据集间标准差的取值变异程度大于实际记录中的噪声水平。因此，在对记录轨迹进行目视检查后，我们采用0.3 mV的固定阈值，以避免因去极化活动水平不同而引入的偏差。
本方案提供了一种标准化且简便的方法，通过细胞外电流钳电压记录结合去极化事件的自动检测，评估斑马鱼模型中视顶盖的运动行为和神经元场活动，以表征类似癫痫的表型。

由于体型小、卵生发育以及在早期发育阶段具有透明性，斑马鱼已成为研究多种人类疾病的宝贵脊椎动物模型，这些疾病包括心血管疾病、癌症和神经系统疾病1,2。斑马鱼兼具脊椎动物的优势（如器官结构和遗传密码的高度保守性）以及较简单模式生物所具有的体型小和易于进行遗传操作的特点，因而有利于开展基础研究和转化应用。特别是，斑马鱼适用于对行为学和细胞过程的荧光标记物进行高通量自动化筛选，这使其成为癫痫研究中尤为理想的模型。过去十年中，采用化学诱导和/或遗传方法建立癫痫模型的研究论文数量显著增加3,4,5，而近年来更有研究报道，通过在这些模型中开展化合物筛选，已获得具有前景的治疗候选药物6,7,8。&#160;
DEPDC5 是GATOR1复合物的成员，该复合物为mTOR信号通路的负调控因子9。GATOR1复合物中的突变可导致 DEPDC5 基因于2013年首次在患有常染色体显性遗传局灶性癫痫的先证者中被发现10,11，并且此后已在多种与局灶性癫痫发作和局灶性皮质发育不良相关的临床疾病中被报道12绝大多数已报道的突变预计会导致该基因功能丧失12，并且这一点已在多种情况下得到正式验证 DEPDC5 被无义介导的mRNA降解所靶向的突变转录本12,13. 与此一致，在斑马鱼中使用反义吗啉代寡核苷酸（AMOs）敲低该基因的直系同源物，会导致一系列在此类生物体的癫痫模型中常见的表型，包括活动过度、车轮样旋转游泳、自发性癫痫发作以及神经元活动增强14,15,16,17,18有趣的是，使用雷帕霉素（mTOR 信号通路抑制剂）处理可逆转该模型的行为学特征18，支持该假设 DEPDC5 功能丧失可能因mTOR通路的失调而引发癫痫9,19.&#160;
利用携带吗啉代修饰的反义寡核苷酸在体内瞬时敲低基因表达，已成为研究特定基因功能的宝贵工具，其应用价值与基于si/shRNA的技术相当。近年来，基于AMO的策略也进入了临床应用领域，首个用于治疗杜氏肌营养不良症的AMO疗法已于2016年获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准20。尽管已有报道指出，在斑马鱼中，基于AMO的急性基因敲低表型并不总是与组成型基因敲除模型一致21，但这至少在某些情况下可能是由于组成型遗传修饰引发的代偿机制所致22。然而，AMO诱导表型的特异性问题无疑是一个必须在使用该技术的研究中认真对待的重要关切23。为确保基于AMO的基因敲低表型具有特异性，必须进行多项关键对照实验。这些对照包括建立剂量-反应曲线，以确定能够有效实现基因敲低的最低AMO剂量，从而避免因引入过量遗传物质而导致的整体毒性。还需使用一种Mismatch AMO（即不靶向基因组中任何特定区域的错配对照AMO），以帮助确定合适的实验剂量并识别特异性表型。此外，必须使用第二种靶向同一基因不同区域（例如剪接阻断型AMO）的AMO，以确认所观察到的表型确实源于目标基因的敲低。通过导入该基因的cDNA（可以是人源直系同源基因，或经过密码子改造而无法被AMO靶向的斑马鱼基因版本）来挽救敲低表型，可为表型特异性提供强有力的证据。若使用含有功能丧失突变（例如引入提前终止密码子）的相同cDNA则无法实现表型挽救，这进一步支持了表型的特异性。&#160;
本文介绍了一种建立斑马鱼DEPDC5基因功能缺失模型的方法，以及在受精后28小时（hpf）和48小时（hpf）进行行为表型分析的实验方案。在28 hpf时，DEPDC5基因功能缺失会导致胚胎整体活动增强，表现为在卵膜内出现更频繁的卷曲和抽搐运动。在此阶段，可使用自动运动检测系统对每个胚胎的总体活动量进行定量分析。在48 hpf时，斑马鱼在受到触觉刺激后会表现出典型的逃避游泳行为。在DEPDC5基因表达下调的斑马鱼中，其游泳轨迹显著比对照组更为曲折，呈现出“螺旋状”或“车轮翻转样”运动模式，这与其他已报道的该生物体癫痫模型相似3,4。在受精后4至6天（dpf）的斑马鱼幼鱼中，对视顶盖进行的电生理记录显示，DEPDC5基因敲低动物的神经元基础活动水平升高。该模型的优势在于其在不同发育时间点表现出多种表型特征，可用于监测和评估药物治疗在发育过程中的疗效。&#160;

<table><tbody><tr><td>琼脂糖</td><td>Sigma-Aldrich, 法国</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>水族盐&amp;nbsp;</td><td>Instant Ocean, 布莱克斯堡, 弗吉尼亚州</td><td>SS15-10</td><td></td></tr><tr><td>含丝硼硅酸盐玻璃</td><td>Sutter Instruments</td><td>BF100-50-10</td><td>外径：1.5 mm，内径：0.5 mm</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich, 法国</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>Depdc5-atg 反义吗啉代寡核苷酸</td><td>GeneTools, 俄勒冈州, 美国</td><td>N/A</td><td>序列 5&amp;rsquo;- TGCCTTCATGGTGACCGTCATTTTA -3&amp;rsquo;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Depdc5-mis 反义吗啉代寡核苷酸</td><td>GeneTools, 俄勒冈州, 美国</td><td>N/A</td><td>序列 5&amp;rsquo;- TGCgTTgATcGTGACCcTgATTTTA -3&amp;rsquo;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Depdc5-剪接反义吗啉代寡核苷酸</td><td>GeneTools, 俄勒冈州, 美国</td><td>N/A</td><td>序列 5&amp;rsquo;- ACATTCCTGTTTCACCATAGATGAT -3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>数字化仪</td><td>Molecular Devices, 加利福尼亚州, 美国</td><td>Digidata 1550</td><td></td></tr><tr><td>快绿染料</td><td>Sigma-Aldrich, 法国</td><td>F7258</td><td>0.2% 储存液</td></tr><tr><td>玻璃底培养皿</td><td>Ibidi, 德国</td><td>81218</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich, 法国</td><td>68270</td><td></td></tr><tr><td>Grasshopper 2 相机</td><td>FLIR, 不列颠哥伦比亚省, 加拿大</td><td>GRAS-03K2M-C</td><td>原 Point Grey Research</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich, 法国</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>人源野生型 DEPDC5 cDNA</td><td>Dharmacon, 法国</td><td>NM_001242897.1</td><td>&amp;nbsp;登录号：BC144291，克隆编号：905</td></tr><tr><td>ImageJ 软件</td><td>NIH, 美国</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich, 法国</td><td>P9333&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Matlab 软件</td><td>MathWorks, 马萨诸塞州, 美国</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich, 法国</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich, 法国</td><td>S7653&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich, 法国</td><td>71687</td><td></td></tr><tr><td>泮库溴铵&amp;nbsp;</td><td>Alomone Labs</td><td>P-130</td><td>60 mM 水溶液储存液</td></tr><tr><td>Parafilm 封口膜</td><td>Sigma-Aldrich, 法国</td><td>P7793</td><td></td></tr><tr><td>膜片钳放大器</td><td>Molecular Devices, 加利福尼亚州, 美国</td><td>MultiClamp 700B</td><td>计算机控制的膜片钳放大器</td></tr><tr><td>pClamp10 数据采集软件</td><td>Molecular Devices</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>戊四氮 (PTZ)</td><td>Sigma-Aldrich, 法国</td><td>P6500</td><td>300 mM 储存液（溶于记录液）</td></tr><tr><td>玻璃微电极拉制仪</td><td>Narishige, 日本</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>气动 PicoPump&amp;nbsp;</td><td>WPI, 法国</td><td>PV 820</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 试剂盒</td><td>Sigma-Aldrich Intl.</td><td>761036</td><td></td></tr><tr><td>塑料移液管</td><td>Sigma-Aldrich, 法国</td><td>Z350605</td><td></td></tr><tr><td>Zebralab</td><td>Viewpoint, 法国</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

癫痫斑马鱼模型中的行为与生理学分析

Behavioral And Physiological Analysis In A Zebrafish Model Of Epilepsy

癫痫是最常见的神经系统疾病之一，全球约有5000万人受其影响。近年来遗传学研究的进展揭示了大量与各种类型癫痫相关的基因，凸显了该疾病的异质性。合适的动物模型对于研究与癫痫相关的基因突变所引发的病理机制，以及开发特异性的靶向治疗手段至关重要。近年来，斑马鱼作为一种有价值的脊椎动物模型被广泛应用于癫痫研究，通过基因操作或暴露于已知的致痫药物（如戊四氮，pentylenetetrazole, PTZ），可用于发现新的抗癫痫治疗药物。mTOR通路调控基因DEPDC5的功能丧失性突变已被证实与多种局灶性癫痫相关；在斑马鱼中敲低其同源基因会导致活动过度，伴随自发性类似癫痫发作的行为、增强的电生理活动以及特征性的“车轮旋转”式游泳行为。本文描述了构建DEPDC5功能缺失模型的方法，并展示了在受精后28小时和48小时（hpf）评估运动活性的实验方案，以及记录斑马鱼视顶盖区场电位活动的方法。此外，还提供了致痫药物PTZ随时间推移对神经元活动影响的示例图示。

图1展示了在两种遗传条件下（错配对照和DEPDC5基因敲低）4-6天龄斑马鱼幼鱼细胞外场电位记录的代表性电压轨迹。在记录的基线期，DEPDC5基因敲低组表现出更高频率的自发性放电事件，而错配对照组仅显示极少的波动。这些活动模式代表了由于DEPDC5功能缺失所导致的神经元活动显著增强，这一点我们此前已有报道18。在给予戊四氮（PTZ）后，错配对照组和DEPDC5基因敲低组均出现去极化事件数量的增加。在PTZ给药后的初期（10–60分钟），错配对照组和DEPDC5基因敲低组的事件发生率均为每分钟0.8次，且大多数事件具有高振幅（&gt;1 mV）。在后续反应期（PTZ给药后60–120分钟），去极化事件的发生率上升至约每分钟1次，且大多数事件为低振幅（≤1 mV）。
<img alt="电生理学结果；电压迹线和直方图；错配对照组与 Depdc5 敲低组；细胞活动。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58837/58837fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 1"> 
图1：斑马鱼幼体脑部场记录的示例迹线。（A）错配对照组幼体和 DEPDC5 敲低组幼体180分钟记录的总体概览。首先记录自发的基础活动，随后在浴液中加入PTZ（红色条表示）。（B）错配对照组和 DEPDC5 敲低组去极化事件的刺激相关时间直方图。事件被分为高幅度（&gt;1 mV — 蓝色）和低幅度（≤1 mV — 黑色）两类。（C-E）记录不同阶段的迹线示例：（C）自发活动阶段，（D）PTZ 加入后初期的高幅度事件，（E）PTZ 加入后后期的低幅度事件。请注意，生成这些图的脚本文件已作为补充文件提供。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58837/58837fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
补充文件：步骤 3.4 的脚本文件。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58837/Supplementary_File.zip" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

本文介绍了一种斑马鱼癫痫模型的建立与表征方案，该模型源于对DEPDC5基因的瞬时抑制。

癫痫是最常见的神经系统疾病之一，影响着全球约5000万人。近年来，遗传学研究的进展……

本方案提供了一种快速评估WC5基因敲降效应的方法，该基因是局灶性癫痫最常见的致病原因。此技术的主要优势在于，我们可利用行为学和生理学特征，在发育的各个阶段评估类似癫痫的表型。显微注射前一日，设置斑马鱼交配用鱼缸。注射当天早晨，移除隔离板以促进产卵。使用细筛将卵转移到装有胚胎用水的100毫米培养皿中。用塑料巴斯德吸管挑选60至80枚卵，并将其排列在硅胶涂层的培养皿中，用于注射。将大部分水移除，仅保留足以使卵半浸入的水量。将一根玻璃针垂直插入含有注射溶液的管中，让有色溶液通过毛细作用在数分钟内逐渐充满管内。当在针尖处观察到注射液时，将针头安装到显微注射仪的注射手柄上，并打开空气压缩机。调节压力设置，以产生两纳升的注射体积。并将卵置于解剖双目显微镜下，使用四倍放大倍率进行观察。将针尖插入单细胞期胚胎的绒毛膜和卵黄中，直接向每个细胞内注射溶液。然后将注射后的胚胎转移至含有胚胎培养液的、已标记的100毫米培养皿中，并将培养皿置于28°C培养箱内。受精后28小时，在实验培养皿底部放置一个1.2 × 1.2毫米的塑料网格。使用塑料巴斯德吸管将10至12个包在绒毛膜内的胚胎置于塑料网格上。向培养皿中加入足够的胚胎用水，使胚胎保持浸没但不漂浮的状态，并在需要时用塑料吸头小心移动胚胎，使其位于网格的适当位置。然后，使用连接在解剖显微镜上的视频摄像机，记录10至20分钟的自发卷曲活动。为了分析总体自发运动，使用Zebra lab系统中的活动量化模块上传录制的视频，并根据需要在每个胚胎周围设计追踪区域。将冻结和爆发阈值分别设置为10和50。当进行自动视频分析时，将量化每个定义区域内总的活动水平。然后将数据集导出为电子表格，使用适当的数据分析软件进行分析。受精后46小时，用精细镊子去除胚胎的卵膜，并用胚胎用水填充一个130毫米的实验培养皿。在开始实验前至少15分钟，将培养皿置于28°C培养箱中预热。进行触觉诱发逃逸反应测试时，使用塑料巴斯德移液管将胚胎置于检测培养皿中央，在摄像头下方。以每秒30帧的采集速率开始录像。使用细塑料尖端，以轻弹动作轻微触碰胚胎的尾部。当幼虫停止运动后，停止记录。然后将胚胎转移至装有新鲜胚胎水的新培养皿中，并根据每种实验条件的需要，对尽可能多的胚胎重复该测试。为进行电生理分析，将一条受精后4至6天的斑马鱼置于玻璃底培养皿中。除去多余的海水培养基，确保鱼尽可能靠近培养皿底部。使用塑料巴斯德吸管加入足量的温热液体琼脂以覆盖幼虫。在琼脂凝固过程中，用精细镊子将鱼腹侧朝下置于培养皿中央。然后向培养皿中加入2毫升记录液，其中含有10微摩尔浓度的泮库溴铵，以阻断神经肌肉传递。接着，用记录液填充玻璃微电极，使用电压钳模式的膜片钳放大器测量电极在浴液中的电阻，以确认其阻值正确。使用20倍物镜，将幼虫头部置于视野中央，并降低微电极，使其到达视顶盖内的记录位置。将膜片钳放大器切换至电流钳模式，并将保持电流固定为零毫安。使用1 kHz的低通滤波器、1 kHz的采样频率以及10倍的数字增益，记录斑马鱼60分钟的自发活动，以确定其基础活动水平。在基础记录结束时，向浴液中加入143微升浓度为300毫摩尔/升的戊四氮溶液，使终浓度达到20毫摩尔/升。将动物置于戊四氮溶液中继续记录神经元活动120分钟。在记录的基线期，受精后四至六天的癫痫模型斑马鱼表现出更高频率的自发性事件，而错配对照组斑马鱼仅显示极少的波动。应用戊四氮后，错配对照组和癫痫模型斑马鱼均出现深度去极化事件数量的增加。在给予戊四氮后的第一阶段，错配对照组和基因敲低动物的去极化事件发生率均为每分钟0.8次，其中大多数事件具有高振幅。在后续反应阶段，去极化事件的发生率增加至每分钟约一次。且大多数事件的振幅较低。在进行基因敲低时，利用剂量-反应曲线确定吗啉代寡核苷酸（morpholinos）的正确剂量，并进行对照实验以避免非特异性毒性，这一点至关重要。这一方法可为进一步的下游研究提供支持，包括检测遗传或化学修饰因子的作用效果。以及斑马鱼的行为和神经活动，以了解DC5突变的发育效应。

behavioral-and-physiological-analysis-in-a-zebrafish-model-of-epilepsy

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