Name: 在生物安全2级环境中制备假型颗粒研究高致病性冠状病毒 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: 学习在生物安全2级环境中制备假型颗粒，用于研究MERS和SARS冠状病毒的病毒进入机制。该方法使用HEK293T细胞进行转染，并通过荧光素酶报告基因检测感染性，为研究高致病性病毒提供安全可靠的替代方案。

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我们感谢Whittaker实验室和Daniel实验室所有成员提供的有益建议。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目R21 AI111085和R01 AI135270提供经费支持。T.T. 感谢康奈尔大学总统生命科学奖学金以及美国国家科学基金会研究生研究奖学金项目（资助号：DGE-1650441）的支持。L.N. 感谢Samuel C. Fleming家族研究生奖学金以及美国国家科学基金会研究生研究奖学金项目（资助号：DGE-1650441）的支持。本工作还得到了美国国家科学基金会1504846项目（授予S.D.和G.R.W.）的支持。

1. 用于假型颗粒生产的细胞接种
注意： 此步骤需在生物安全柜中进行。
<ol>
	<li>采用标准的细胞培养技术，获得一个汇合度为80–90%的75 cm2培养瓶，其中培养的是在完全杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM-C）中传代的HEK-293T/17细胞，该培养基含有10%（体积比）胎牛血清（FBS）、10 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）、100 IU/mL青霉素和100 µg/mL链霉素。另配制用于转染的DMEM-T培养基（其成分与DMEM-C相同，但不含抗生素）。</li>
	<li>用10 mL预热至37 °C的杜尔贝科磷酸盐缓冲液（DPBS）洗涤细胞两次。 
	注意：操作HEK293T/17细胞时需小心，因其容易脱落。</li>
	<li>吸除上清液，加入1 mL预热至37 °C的0.25%胰蛋白酶溶液使细胞脱落。将培养瓶置于37 °C、5% CO2的培养箱中孵育3–5分钟，或直至细胞开始脱落。 
	注意：避免胰蛋白酶处理细胞超过5分钟，否则通常会导致细胞成团。</li>
	<li>加入4 mL DMEM-C培养基以终止胰蛋白酶反应，并使用细胞计数板和光学显微镜进行细胞计数。 
	注意：为避免计数过多细胞，可在计数前增加稀释步骤。计算胰酶消化后细胞的实际密度时，需计入该稀释倍数。</li>
	<li>用DMEM-C培养基将细胞稀释至5 × 105 个细胞/mL。</li>
	<li>在6孔组织培养板中每孔接种2 mL细胞悬液，并轻轻前后、左右晃动培养板以使细胞均匀分布，避免画圈式晃动。 
	注意：此为关键步骤。细胞均匀分布可防止其在孔中央聚集，从而确保较高的转染效率和假型病毒颗粒的高效生成。</li>
	<li>将培养板置于37 °C、5% CO2的细胞培养箱中孵育过夜（16–18小时）。</li>
</ol>
2. 三质粒共转染
注意： 此步骤需在生物安全柜中进行。
<ol>
	<li>在倒置光学显微镜下观察细胞，检查细胞形态和密度。 
	注意：理想情况下，细胞密度应处于40–60%融合度范围内。每个孔中的细胞既不能过于融合（80−90%融合），也不能过于稀疏（20−30%融合）。40−60%融合度的细胞密度可确保假病毒颗粒的良好产生。</li>
	<li>质粒混合物
	<ol>
		<li>根据表1中所示的6孔板每孔用量，计算每种包膜糖蛋白对应的质粒混合物用量。若需转染多个孔，则按比例增加用量，并额外增加一孔的量以避免混合物不足。 
		注意：除SARS-CoV S和MERS-CoV S编码质粒外，还应包括空载体对照，用于生成缺乏病毒包膜糖蛋白的阴性对照颗粒（Δenv颗粒），以及如水疱性口炎病毒（VSV）G糖蛋白等已知可高效感染多种细胞的阳性对照糖蛋白（VSV-Gpp）。质粒可应要求提供。</li>
		<li>将计算好的质粒体积与低血清细胞培养基（见材料表）在微量离心管中混合。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>脂质转染试剂混合物（见材料表）
	<ol>
		<li>根据表2中每孔的用量（1:3转染比例，按需放大体积）计算转染试剂混合物的体积。建议额外准备若干孔的量，以避免转染试剂混合物不足。</li>
		<li>在微量离心管中混合计算好的脂质转染试剂体积（每孔3 µL）和低血清细胞培养基体积（每孔47 µL），注意必须将转染试剂加入低血清细胞培养基中，而不是相反。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将两种混合物（每孔：50 µL质粒混合物和50 µL脂质转染试剂混合物）分别在室温下孵育5分钟。</li>
	<li>以1:1比例将转染试剂混合物加入质粒混合物中（每孔各50 µL）。</li>
	<li>对所得混合物进行充分的上下吹打混匀。</li>
	<li>将混合物在室温下孵育至少20分钟。</li>
	<li>吸除细胞的旧培养基。</li>
	<li>每孔轻柔加入1 mL预热至37 °C的低血清细胞培养基。</li>
	<li>每孔逐滴加入100 µL转染混合物。 
	注意：向HEK-293T细胞孔中添加转染混合物时需格外小心，因其容易脱落。</li>
	<li>将细胞置于37 °C、5% CO2的细胞培养箱中孵育4–6小时。</li>
	<li>每孔加入1 mL预热至37 °C的不含抗生素的DMEM-T培养基。 
	注意：此步骤至关重要。转染试剂会增加细胞通透性，使细胞对抗生素更为敏感。为确保良好的转染效率和假病毒颗粒的产生，必须避免使用含抗生素的细胞培养基。</li>
	<li>将细胞置于37 °C、5% CO2的细胞培养箱中孵育48小时。</li>
</ol>
3. 假病毒颗粒的收集
注意：此步骤需在生物安全柜中进行。
<ol>
	<li>在倒置显微镜下观察细胞，检查细胞形态和总体状态。同时检查培养基颜色，应为浅粉色/微橙色。 
	注意： 这是一个关键步骤。如果转染过程中出现过多的细胞死亡，或培养基颜色变为橙色/黄色（酸性pH），通常会导致感染性假型病毒颗粒的产量降低。</li>
	<li>将转染细胞的上清液转移至50 mL锥形离心管中。</li>
	<li>离心管，290 × g g 7分钟以去除细胞碎片。</li>
	<li>将澄清的上清液通过无菌的0.45 µm孔径滤膜过滤。</li>
	<li>制备小体积分装样品（例如., 500 µL 或 1 mL 拟病毒溶液于冻存管中。</li>
	<li>-80 °C 保存。 
	注意： 此处可暂停实验流程。假型病毒颗粒在 -80 °C 下可稳定保存数月，但一旦解冻后应避免再次冻存，否则将导致感染性下降。</li>
</ol>
4. 易感细胞的假型病毒颗粒感染
注意： 此步骤需在生物安全柜中进行。
<ol>
	<li>在24孔板中接种易感细胞
	<ol>
		<li>通过标准细胞培养技术获得80−90%汇合度的75 cm2 培养瓶中的易感细胞：SARS-CoV假病毒颗粒（SARS-Spp）使用Vero-E6细胞，MERS-CoV刺突蛋白假病毒颗粒（MERS-Spp）使用Huh-7细胞。 
		注意：为确认所制备的假病毒颗粒是否具有感染性，必须谨慎选择适用于假病毒颗粒感染性检测的易感细胞系。使用通透性差的细胞将导致感染效率低下。</li>
		<li>用10 mL预热（37 °C）的DPBS洗涤细胞两次。</li>
		<li>吸除上清液，并加入1 mL预热至37 °C的0.25%胰蛋白酶溶液使细胞脱落。将细胞培养瓶置于37 °C、5% CO2 培养箱中孵育3−5分钟，或直至细胞开始脱落。 
		注意：避免胰蛋白酶处理细胞超过5分钟，否则通常会导致细胞成团。Huh-7细胞对此效应尤为敏感。</li>
		<li>加入DMEM-C培养基以终止胰蛋白酶作用，并使用细胞计数板和光学显微镜进行细胞计数。</li>
		<li>用DMEM-C将细胞稀释至5 × 105 个细胞/mL。</li>
		<li>每孔加入0.5 mL细胞悬液接种至24孔板中，轻轻前后、左右晃动培养板以使细胞均匀分布，避免画圈式晃动。 
		注意：此为关键步骤。均匀分布的细胞可防止细胞在孔中央聚集，从而确保获得良好的感染性检测结果。针对每种假病毒颗粒（SARS-Spp、MERS-Spp）及每种实验条件，应设置三个复孔。同时应包括未感染（N.I.）组、空载体Δenv颗粒组以及阳性对照颗粒（如VSV-Gpp）组。</li>
		<li>将培养板置于37 °C、5% CO2 细胞培养箱中过夜孵育（16−18 h）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>假病毒颗粒感染
	<ol>
		<li>在光学显微镜下观察细胞，肉眼确认细胞已形成完整单层。</li>
		<li>将保存假病毒的冻存管置于冰上解冻。</li>
		<li>用0.5 mL预热（37 °C）的DPBS洗涤细胞三次。 
		注意：此为关键步骤。感染前若未充分清洗细胞，通常会导致感染效率显著降低。</li>
		<li>吸除细胞上清液。</li>
		<li>每孔加入200 µL解冻后的假病毒颗粒溶液进行接种。</li>
		<li>将细胞置于37 °C、5% CO2 细胞培养箱中孵育1−2小时。</li>
		<li>加入300 µL预热（37 °C）的DMEM-C培养基。</li>
		<li>将细胞置于37 °C、5% CO2 细胞培养箱中继续孵育72小时。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 通过荧光素酶检测法读数进行感染性定量
注意：初始步骤需在生物安全柜中进行。
<ol>
	<li>将储存于 -80 °C 的荧光素底物和储存于 -20 °C 的 5 倍浓度荧光素酶检测裂解缓冲液解冻至室温。</li>
	<li>用无菌水将荧光素酶检测试剂盒裂解缓冲液稀释至1倍浓度。</li>
	<li>吸弃感染假型病毒颗粒的细胞的上清液。</li>
	<li>每孔加入 100 µL 1x 荧光素酶检测裂解缓冲液。</li>
	<li>将培养板置于摇床上，室温下振荡孵育15分钟（从此步骤开始，培养板可在生物安全柜外操作）。</li>
	<li>为每个孔准备微量离心管，每管加入 20 µL 荧光素底物。</li>
	<li>打开化学发光仪。</li>
	<li>每次测量一个孔的荧光素酶活性，将10 µL裂解液转移至含有20 µL荧光素底物的试管中。</li>
	<li>轻轻振荡试管以混匀内容物，但避免使管壁上的液体发生移位。</li>
	<li>将试管放入仪器中并盖上盖子。</li>
	<li>使用发光仪测量试管的发光值。</li>
	<li>记录相对光单位的测量值。</li>
	<li>重复步骤 5.8–5.12，直至分析完所有孔。 
	注意： 使用适当的设备（如平板读数化学发光仪），该过程可实现自动化。检测方法需根据平板格式进行相应调整（例如, 96孔板格式</li>
</ol>
6. 数据分析
<ol>
	<li>相对荧光素酶单位平均值与标准差的计算与绘图
	<ol>
		<li>使用绘图软件计算实验重复和生物学重复的荧光素酶检测测量值的平均值和标准差。</li>
		<li>以带有标准差的柱状图形式绘制数据。 
		注意：对数据进行统计分析时，务必在数据集中包含至少三个生物学重复。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案描述了一种在生物安全二级（BSL-2）条件下高效制备携带风险等级3级冠状病毒（SARS-CoV和MERS-CoV）S蛋白的假型病毒颗粒的方法。这些颗粒包含一个荧光素酶报告基因，使我们能够通过相对简单的荧光素酶检测法轻松定量冠状病毒S蛋白介导的入侵事件48,49,50,51。在使用许可性细胞进行的感染性检测中，我们证实所测得的荧光素酶活性依赖于病毒颗粒的浓度。此外，在许可性较差的细胞系（如HEK-293T细胞）中转染ACE2和DPP4受体可显著提高入侵效率。该方法具有高度可适性，可广泛应用于其他病毒包膜糖蛋白的研究，并已被大量使用48,49,50,51,52,53,55,56,57,58,59，常用于补充生化分析或野生型病毒感染等其他检测方法。
本文所述方案基于携带荧光素酶报告基因的逆转录病毒MLV。然而，需要强调的是，目前已成功开发出多种其他假型系统，可用于包装冠状病毒S12,13,25,26,30,31,32及其他病毒包膜糖蛋白10,11,14,16,17,23,24,29,33,38,40,42,44,46。其中一些系统基于常用的MLV逆转录病毒核心7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20，或基于广泛使用的慢病毒HIV-1假型系统，采用不同策略进行包装23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35，或以弹状病毒水疱性口炎病毒（VSV）为核心，可容纳多种包膜糖蛋白，并采用多种不同策略实现假型化37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47。此外，其他报告基因如荧光蛋白GFP11,13和RFP36，或非荧光素酶类酶如β-半乳糖苷酶16,17和分泌型碱性磷酸酶（SEAP）42，也已成功用于检测。此外，在本方案所描述的实验中，采用瞬时转染方式表达MLV及CoV S基因和蛋白。然而，也存在其他表达策略，例如构建稳定表达细胞系以生产假型病毒7,14。由于每种系统均有其优缺点，在选择最适合研究者需求的假型系统时，需综合考虑以下关键参数：假病毒核心（MLV、HIV-1、VSV或其他）、特定假型核心对特定病毒包膜糖蛋白的包装选择性、检测读数所用的报告基因（GFP、荧光素酶、SEAP或其他），以及转染策略（共转染质粒数量、瞬时转染或构建稳定细胞系）。
该方法中有若干关键步骤需要特别强调。细胞密度，尤其是HEK-293T/17生产细胞系的密度，是确保转染成功的关键因素。研究发现，细胞密度在40–60%融合度范围内最为理想。密度过高通常会导致转染效率低下和病毒颗粒产量减少。此外，需要注意的是，HEK-293T/17细胞的贴壁性较其他细胞系更弱，在操作过程中应小心处理，避免不必要的细胞脱落。一种可行的方法是使用多聚-D-赖氨酸处理细胞培养塑料表面，以增强细胞贴附性。此外，细胞传代次数过高通常会导致转染效率下降。在向HEK-293T/17细胞添加转染试剂后，还需注意细胞通透性会增加，因此在此阶段应避免使用含抗生素的培养基，以免增加细胞毒性。在收集假型病毒颗粒前，应检查转染后HEK-293T/17细胞上清液的颜色。通常在转染48小时后，细胞培养基颜色会呈现橙粉色。若培养基呈黄色，通常意味着假型病毒颗粒产量较低，这往往是由于细胞接种密度不当或细胞传代次数过高所致。
在此方案中，假病毒颗粒的制备采用6孔板体系进行。为增加所产颗粒的体积，可使用相同的质粒混合物转染6孔板中的多个孔，并将收集的上清液合并。合并后的上清液可进行澄清、过滤和分装。或者，为扩大生产规模，也可使用其他类型的培养容器（例如25 cm²或75 cm²培养瓶）进行转染。2 可使用不同规格的培养瓶。在此情况下，转染条件应相应放大。本实验方案采用24孔板进行感染性检测，并使用仅能逐管检测的 luminometer。对于高通量筛选，也可采用其他格式，例如96孔板配合酶标仪型 luminometer。荧光素酶检测中的体积和试剂需相应调整。将假病毒颗粒以0.5–1 mL等小份分装于冻存管中，于-80 °C保存，可在数月内维持其稳定性，且感染性无明显下降。不建议反复冻融，因其会随时间推移降低病毒颗粒的感染性。因此，最佳做法是小体积分装保存，使用前再行解冻。
本文所述方法存在若干局限性。其中一个重要的局限性在于，假病毒颗粒仅能模拟病毒感染的进入过程。若要分析感染生命周期中的其他步骤，则需要采用其他检测方法。此外，由于MLV颗粒在细胞质膜上出芽，因此必须注意所研究的包膜糖蛋白在病毒颗粒生产过程中也需要转运至细胞质膜，以便被整合进假病毒颗粒中。因此，了解特定病毒包膜糖蛋白在转染条件下于细胞内的表达位置至关重要，例如可通过免疫荧光检测观察其亚细胞定位，和/或检查蛋白内部是否存在滞留信号。同时，尽管本方案描述了假病毒颗粒的制备及感染性检测步骤，但并未详细说明如何测定病毒包膜糖蛋白在假病毒颗粒中的整合情况。一种可行的方法是对浓缩后的病毒颗粒溶液进行Western印迹分析，如先前报道的针对MERS-CoV S蛋白整合的检测方法50,51。在这些实验中，同时检测MERS-CoV的S包膜糖蛋白和MLV的衣壳蛋白（p30），从而可将S蛋白的整合水平归一化。其他类似的分析病毒包膜糖蛋白整合入假病毒颗粒的研究还包括：在HIV-1慢病毒假病毒系统中检测SARS-CoV S蛋白的整合32，在另一MLV假病毒系统中检测埃博拉病毒糖蛋白（GP）的整合17，以及在VSV假病毒颗粒中检测流感病毒血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）的整合38。近年来，在表征假病毒颗粒生产方面的新进展是采用Nanosight等创新成像设备，该技术可实现对病毒颗粒的直接可视化、定量及粒径测定50。该设备可提供有关病毒颗粒总体产量的详细信息；然而需要注意的是，它无法提供有关包膜糖蛋白是否整合的信息。未来这些多功能假病毒颗粒的一个发展方向是利用单颗粒追踪、微流控技术和全内反射荧光显微镜来分析单个病毒融合事件60,61,62。此类方法已成功应用于流感病毒和猫冠状病毒颗粒，以及基于VSV、携带流感病毒HA和NA的假病毒颗粒63。目前，将这些技术应用于冠状病毒S蛋白假病毒化的MLV颗粒的研究正在开发中。

宿主细胞入侵构成了病毒感染生命周期的初始步骤。对于包膜病毒而言，这一过程包括与单个或多个宿主细胞受体结合，随后发生病毒膜与细胞膜的融合。这些关键功能由病毒包膜糖蛋白介导1,2。冠状病毒的包膜糖蛋白被称为刺突（S）蛋白，属于I类病毒融合蛋白家族2,3,4,5,6。研究病毒包膜糖蛋白对于理解特定病毒的多种重要特性至关重要，例如：生命周期的启动、宿主和细胞嗜性、跨物种传播、病毒致病机制以及宿主细胞入侵途径。病毒假型颗粒（也称为假病毒）是研究病毒融合蛋白功能的有力工具。假型颗粒或假病毒是一类嵌合型病毒颗粒，其核心为替代性病毒基因组，表面则表达异源病毒的包膜蛋白。本实验方案的主要目的是展示如何制备基于小鼠白血病病毒（MLV）核心并携带荧光素酶报告基因的冠状病毒刺突蛋白假型颗粒。作为示例，文中介绍了利用高致病性严重急性呼吸综合征（SARS）和中东呼吸综合征（MERS）冠状病毒刺突蛋白制备假型颗粒的方法。该方案详细描述了转染操作流程、如何感染易感靶细胞，以及通过荧光素酶检测定量感染活性的方法。
由于假病毒的入侵过程由其表面的冠状病毒S蛋白介导，因此它们进入细胞的方式与天然病毒类似。因此，假病毒是功能性感染实验的优良替代工具。假病毒颗粒通常来源于亲本模式病毒，例如逆转录病毒（MLV7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22）和慢病毒人类免疫缺陷病毒（HIV23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35），或弹状病毒（水疱性口炎病毒——VSV36,39,40,41,42,43,44,45,46,47）。在假病毒包装过程中，亲本病毒的基因组经过改造以去除关键基因，使其无法完成完整的复制周期，因而成为缺陷型病毒。这一特性使得假病毒可在生物安全二级（BSL-2）实验室中使用，相较于需要在更高级别生物安全设施（如BSL-3或BSL-4，这些设施不易获得）中操作的高致病性天然病毒，具有显著优势。本文以生物安全等级3类病原体SARS-CoV和MERS-CoV的S蛋白为例，说明病毒包膜蛋白如何被整合到MLV假病毒颗粒中，从而生成SARS-CoV S和MERS-CoV S假病毒颗粒（分别记为SARS-Spp和MERS-Spp）。这些假病毒已成功应用于针对上述病毒入侵过程的研究48,49,50,51。另一个优势是，本文所述技术不仅限于冠状病毒S蛋白的假病毒包装：该方法具有高度灵活性，可用于整合三类病毒融合蛋白的代表性成员。例如流感病毒血凝素（HA，I类）52、埃博拉病毒糖蛋白（GP，I类）、甲病毒Semliki Forest病毒的E1蛋白（SFV，II类）以及VSV糖蛋白（G，III类）53。此外，多种病毒糖蛋白可同时共整合入同一假病毒颗粒中，例如流感病毒HA和NA共包装的假病毒颗粒51。
根据 Bartosch 等人20的研究，本实验方案描述了一种利用广泛可得且转染效率高的 HEK-293T 细胞系，通过三质粒共转染策略生成 MLV 假型病毒颗粒的方法54。第一个质粒编码 MLV 的核心基因 gag 和 pol，但缺失 MLV 包膜基因 env。第二个质粒为转移载体，编码萤火虫荧光素酶报告基因、MLV Ψ-RNA 包装信号以及位于两侧的 5' 和 3' 长末端重复序列（LTR）区域。第三个质粒编码目标融合蛋白，在本实验中为 SARS-CoV 的 S 蛋白或 MERS-CoV 的 S 蛋白。使用转染试剂共转染这三个质粒后，转染细胞内将表达病毒 RNA 和蛋白质，从而生成假型病毒颗粒。由于采用 MLV 作为假病毒骨架，该过程发生在细胞质膜上：含有荧光素酶报告基因和包装信号的 RNA 被包裹进新生的病毒颗粒中，同时质膜上表达的冠状病毒刺突蛋白也被整合入颗粒。从细胞表面出芽释放的病毒颗粒在其表面携带冠状病毒 S 蛋白，可被收集用于感染性检测。由于这些假型病毒颗粒表面携带的是冠状病毒 S 蛋白而非 MLV 包膜蛋白，因此在感染细胞时，其进入过程的行为与天然冠状病毒一致。含有荧光素酶报告基因及侧翼 LTR 的病毒 RNA 随后被释放至细胞内，逆转录病毒的聚合酶活性可将其逆转录为 DNA 并整合至宿主细胞基因组中。通过简单的荧光素酶活性检测即可定量测定感染细胞中假型病毒颗粒的感染能力。由于整合到宿主细胞基因组中的 DNA 序列仅包含荧光素酶基因，而不包含任何 MLV 或冠状病毒的蛋白编码基因，因此这类假型病毒本质上比具有复制能力的天然病毒更安全。
除了作为更安全的替代物并具有高度适应性以容纳各种包膜糖蛋白外，本文所述的假病毒颗粒还具有高度多功能性，可用于研究病毒进入的多个方面。包括但不限于：检测宿主细胞对病毒感染的易感性、分析包膜病毒所利用的细胞进入途径、研究药理学抑制剂的作用及药物筛选、进行中和抗体检测、表征无法培养的包膜病毒在宿主细胞中的进入过程，以及构建用于基因递送、目的基因的稳定细胞表达或基因沉默的病毒载体。

<table><tbody><tr><td>人胚胎肾（HEK）HEK-293T/17细胞&amp;nbsp;</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td>17号克隆细胞具有很高的转染效率。</td></tr><tr><td>非洲绿猴肾上皮Vero-E6细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-1586</td><td></td></tr><tr><td>人肝癌Huh-7细胞&amp;nbsp;</td><td>日本国立生物医药创新、健康与营养研究所</td><td>JCRB0403</td><td></td></tr><tr><td>倒置光学显微镜，配备10倍物镜 &amp;times; 目的&amp;nbsp;</td><td>尼康</td><td>TS100</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科&amp;rsquo;含4.5 g/L葡萄糖、L-谷氨酰胺、不含丙酮酸钠的达尔伯克改良伊格尔培养基（DMEM）</td><td>康宁美迪泰克</td><td>10-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>热灭活胎牛血清（FBS）</td><td>赛默飞世尔科技，Gibco</td><td>1614071</td><td></td></tr><tr><td>1 M N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸（HEPES）&amp;nbsp;</td><td>康宁Mediatech</td><td>25-060-Cl</td><td></td></tr><tr><td>100 &amp;times; 青霉素-链霉素（PS）溶液</td><td>康宁Mediatech</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科&amp;rsquo;含钙的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 和 Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;&amp;nbsp;</td><td>康宁美达泰克</td><td>21-030-CV</td><td></td></tr><tr><td>0.25% 胰蛋白酶，2.21 mM 乙二胺四乙酸（EDTA） &amp;times; 溶液&amp;nbsp;</td><td>康宁Mediatech</td><td>25-053-Cl</td><td></td></tr><tr><td>带网格的细胞计数板&amp;nbsp;</td><td>Kova</td><td>87144</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM培养基</td><td>赛默飞世尔科技，Gibco</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 转染试剂</td><td>赛默飞世尔科技，英坦奇</td><td>11668-027</td><td></td></tr><tr><td>0.45 &amp;micro;m孔径无菌滤器&amp;nbsp;</td><td>帕尔</td><td>4184</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 注射器&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>5 &amp;times; 荧光素酶检测裂解缓冲液&amp;nbsp;</td><td>Promega</td><td>E1531</td><td></td></tr><tr><td>荧光素，荧光素酶检测的底物</td><td>Promega</td><td>E1501</td><td></td></tr><tr><td>无菌水&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>E476-1L</td><td></td></tr><tr><td>GloMax 20/20 发光仪&amp;nbsp;</td><td>Promega</td><td>2030-100</td><td></td></tr></tbody></table>

在生物安全二级条件下制备假病毒颗粒以研究高致病性冠状病毒

Production of Pseudotyped Particles to Study Highly Pathogenic Coronaviruses in a Biosafety Level 2 Setting

本实验方案旨在利用广泛可得的 HEK-293T 细胞系，通过简单的转染程序，生成携带鼠白血病病毒（MLV）核心和荧光素酶报告基因的冠状病毒（CoV）刺突（S）融合蛋白假病毒颗粒。一旦假病毒颗粒在生产细胞中形成并释放，便会整合荧光素酶报告基因。由于这些颗粒仅在其表面表达异源冠状病毒刺突蛋白，因此在病毒进入宿主细胞的过程中，其行为与天然冠状病毒高度相似。因此，它们是研究病毒进入宿主细胞过程的理想替代模型。当假病毒成功进入并感染靶细胞后，荧光素酶报告基因将整合至宿主细胞基因组并得以表达。通过简单的荧光素酶检测方法，即可对转导的细胞进行定量分析。该方法的一个重要优势在于，其可在生物安全二级（BSL-2）实验室中操作，而无需针对高致病性冠状病毒（如中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）和严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV））所必需的三级生物安全（BSL-3）设施。另一优势在于其广泛的适用性，该系统可应用于所有三类病毒融合蛋白的包膜蛋白，例如Ⅰ类的流感病毒血凝素（HA）和埃博拉病毒糖蛋白（GP）、Ⅱ类的塞姆利基森林病毒 E1 蛋白，以及Ⅲ类的水疱性口炎病毒 G 糖蛋白。该方法的局限性在于仅能模拟由所研究包膜蛋白介导的病毒进入过程；对于病毒生命周期的其他阶段，则需采用其他研究手段。此类假病毒颗粒具有多种应用前景，例如可用于研究宿主细胞的易感性与嗜性，以及检测病毒进入抑制剂的作用，从而解析病毒进入的分子通路。

SARS-CoV S 和 MERS-CoV S 假病毒颗粒感染性实验的代表性结果如图1所示。正如预期，在图1A 和 1B中，VSV G 假病毒阳性对照颗粒（VSV-Gpp）在相对荧光素酶单位（RLU）分别为 106 至 107 范围内表现出非常高的平均感染性。对于 SARS-CoV S 假病毒颗粒（图1A）感染易感的 Vero-E6 细胞，测得的平均感染性较强，约为 9.8 × 104 RLU。该数值比未感染对照组（1.1 × 102 RLU）或 Δenv 颗粒（1.5 × 102 RLU）高出近 3 个数量级，后者表面不含任何病毒包膜糖蛋白。类似地，对于 MERS-CoV S 假病毒颗粒（图1B）感染 Huh-7 细胞，测得的平均感染性较高，约为 1.0 × 106 RLU，比未感染对照组（0.8 × 102 RLU）或 Δenv 颗粒（2.0 × 102 RLU）高出近 4 个数量级。另进行了一项感染性实验，将 SARS-Spp 和 MERS-Spp 进行连续稀释后用于感染 Vero-E6 细胞（图2A）。该实验确认所测得的荧光素酶活性依赖于用于感染细胞的颗粒浓度。为验证血管紧张素转换酶 2（ACE2）和二肽基肽酶 4（DPP4）——分别为 SARS-CoV 和 MERS-CoV 的受体——在介导假病毒颗粒附着与入侵中的作用，我们使用了低易感性的 HEK-293T 细胞，并转染使其表达 ACE2 或 DPP4（图2B）。随后将转染后的细胞用于感染性实验。该分析表明，在 ACE2 和 DPP4 过表达后，SARS-Spp 和 MERS-Spp 的感染性分别增加了约 4 个对数级和约 2 个对数级，证实假病毒颗粒的受体使用方式与天然病毒相似。
此处展示的示例说明了在制备假型病毒颗粒时，同时设置阴性对照（未感染组、Δenv 颗粒）和阳性对照（VSV-Gpp）条件的重要性。事实上，阳性对照 VSV-Gpp 颗粒可使我们评估特定批次的假型病毒颗粒是否成功产生了具有功能性和感染性的假病毒颗粒。在大多数哺乳动物细胞系中，VSV-Gpp 颗粒感染的预期结果通常在 106−107 RLU 范围。HEK-293T/17 包装细胞的问题（高传代次数、细胞密度异常）或转染效率低下，可能影响假病毒颗粒的整体产量和感染活性。此外，阴性对照条件也至关重要，因其可帮助我们评估特定细胞系中 RLU 测量的基线水平（未感染状态）以及非特异性颗粒内化（Δenv 感染），后者不依赖于病毒包膜蛋白介导。理想情况下，对于某种特定病毒包膜蛋白假型化的颗粒，其检测值应显著高于阴性对照值数个数量级，如此处所示。 图1A，B然而，如果对于某种特定细胞类型，假型病毒感染的感染性极低（即, 接近阴性对照，例如在 图2B 在未转染的 N.T. 条件下，若未检测到信号，并不一定意味着假型病毒颗粒的生产存在问题。很可能所使用的特定细胞系对感染不敏感或敏感性极低。建议验证目标细胞类型是否预期可被所研究的病毒易感。如文献所示，通过转染表达病毒受体的质粒至低易感性细胞中，可实现更高效的病毒进入与感染。 图2B在将ACE2和DPP4受体转染至靶向的HEK-293T细胞后，其感染性分别增加约4个和约2个数量级。
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>质粒/试剂</td>
			<td>用量</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCMV-MLVgagpol MLV gag 和 pol 编码质粒</td>
			<td>300 ng</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTG-Luc 含荧光素酶报告基因的转移载体</td>
			<td>400 ng</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA-SARS-S、pcDNA-MERS-S 或空载体</td>
			<td>300 ng</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>低血清细胞培养基</td>
			<td>加至 50 µL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：为在6孔板中转染一孔HEK-293T/17细胞以生产假病毒颗粒所需的质粒和低血清细胞培养基的用量。根据质粒制备物的浓度，计算达到所需质粒DNA量所需的体积。若多个孔使用相同质粒进行转染，需将体积乘以待转染孔的数量，并在计算时额外增加一孔，以避免后续步骤中混合液不足。每孔转染的总DNA量为1 µg/孔。质粒可向作者索取。
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>试剂</td>
			<td>用量</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>转染试剂</td>
			<td>3 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>低血清细胞培养基</td>
			<td>47 µL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：使用HEK-293T/17细胞在6孔板中每孔转染制备假病毒颗粒所需的转染试剂和低血清细胞培养基的用量。根据需转染的孔数乘以相应体积，并在计算时额外增加若干孔的用量，以避免后续步骤中混合液不足。所用的转染试剂与质粒DNA比例为3:1。
<img alt="比较Vero-E6、Huh-7细胞中VSV-Gpp、SARS-Spp、MERS-Spp蛋白的荧光素酶活性。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59010/59010fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 1"> 
图 1：利用小鼠白血病病毒（MLV）骨架和荧光素酶报告基因在易感宿主细胞中进行冠状病毒S蛋白假型粒子感染性检测。（A）SARS-CoV S假型粒子在Vero-E6细胞中的感染性检测。（B）MERS-CoV S假型粒子在Huh-7细胞中的感染性检测。图（A）和（B）中的数据均为三次独立实验的平均相对荧光素酶单位，误差线表示标准差（s.d.）。纵轴数据以log10对数刻度绘制。N.I.：未感染对照；Δenv：感染缺失病毒包膜糖蛋白的假型粒子；VSV-Gpp：感染携带阳性对照VSV G包膜糖蛋白的假型粒子。其他缩写：SARS-Spp：感染SARS-CoV S假型粒子；MERS-Spp：感染MERS-CoV S假型粒子。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59010/59010fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看本图的放大版本。</a>
<img alt="Vero-E6 和 HEK-293T 细胞中 SARS/MERS-Spp 感染研究的荧光素酶活性比较柱状图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59010/59010fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2冠状病毒S蛋白假病毒颗粒感染性的浓度依赖性及ACE2与DPP4受体在SARS-Spp和MERS-Spp入侵中的作用 (A) 荧光素酶活性检测测定SARS-Spp和MERS-Spp感染性的浓度依赖性。将假病毒颗粒进行系列稀释后用于感染Vero-E6细胞。B) 分别转染表达ACE2和DPP4受体的非敏感性HEK-293T靶细胞，检测SARS-Spp和MERS-Spp的感染性。数据以对数形式绘制10 y轴的刻度与之前相同 图1 来自重复实验，误差线表示标准差（s.d.）。N.T.：未转染对照 HEK-293T 细胞；ACE2：血管紧张素转换酶 2（SARS-CoV 受体）；DPP4：二肽基肽酶 4（MERS-CoV 受体）。其他缩写含义同文中一致。 图1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59010/59010fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

本文介绍了一种在BSL-2条件下生成假病毒颗粒的实验方案，该假病毒颗粒携带高致病性病毒——中东呼吸综合征冠状病毒和严重急性呼吸综合征冠状病毒的刺突蛋白。这些假病毒颗粒含有荧光素酶报告基因，可用于定量检测病毒进入靶宿主细胞的过程。

该方案旨在利用小鼠白血病病毒（MLV）核心与荧光素酶，制备冠状病毒（CoV）刺突（S）融合蛋白假病毒颗粒...

本方案使研究人员能够生成假型病毒，可用于安全地研究高致病性病毒（如严重急性呼吸综合征冠状病毒和大多数冠状病毒）的病毒进入过程。这一多功能技术基于简便的瞬时转染系统构建。该系统还可用于生产携带其他病毒融合蛋白（而不仅限于冠状病毒S蛋白）的假型病毒颗粒。为获得最佳结果，必须在转染以及假型病毒感染过程中密切监测细胞状态和细胞密度。本实验操作将由本实验室的研究生Tiffany Tang和Lakshmi Nathan进行演示。首先，用10毫升37摄氏度预热的DPBS小心洗涤HEK293T细胞，重复两次。接下来，吸除上清液，并加入1 mL已在37°C预热的25%胰蛋白酶溶液以处理细胞。然后，将细胞培养瓶置于37°C、5%二氧化碳环境中孵育3至5分钟，直至细胞开始脱落。加入4 mL完全DMEM培养基以灭活胰蛋白酶溶液。然后使用细胞计数板和光学显微镜进行细胞计数。用完全DMEM将细胞稀释至每毫升500,000个细胞。接着，在6孔组织培养板中每孔接种2毫升细胞悬液。轻轻前后左右移动培养板，以均匀分散细胞。确保细胞均匀分布后，将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳环境中孵育过夜，或孵育16至18小时。进行三种质粒共转染时，首先在微量离心管中混合计算好体积的质粒与减血清细胞培养基。将混合物在室温下孵育五分钟。然后向每孔47微升的低血清细胞培养基中加入每孔3微升的脂质转染试剂。将混合物在室温下孵育五分钟。接下来，在微量离心管中，通过反复吹打数次，将转染试剂与质粒溶液等量混合。室温孵育20分钟。细胞培养板过夜孵育后，使用倒置光学显微镜观察细胞的形态和密度。然后，吸除细胞的旧培养基，每孔轻轻加入一毫升预热的低血清细胞培养基。接着，每孔逐滴加入100微升转染溶液。将细胞在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育四至六小时。孵育结束后，向每个孔中加入1毫升预热至37摄氏度的无抗生素转染DMEM培养基，并在37摄氏度、5%二氧化碳条件下继续孵育细胞48小时。开始收集假型病毒颗粒时，使用倒置光学显微镜观察细胞的形态和整体状态。培养基的颜色应为浅粉色或微橙色。然后，将转染细胞的上清液转移至50毫升锥形离心管中。以290 ×g离心7分钟，以去除细胞碎片。接下来，将澄清的上清液通过无菌的0.45微米孔径滤器过滤。将假型病毒溶液分装至冻存管中，制成小体积 aliquot，并于-80摄氏度保存。进行假病毒颗粒感染时，首先在光学显微镜下观察细胞，确认细胞已形成完全融合的单层。随后，用37摄氏度预热的DPBS溶液洗涤细胞三次，每次0.5毫升。接着，吸除细胞的上清液，并向细胞中加入200微升解冻后的假病毒颗粒溶液进行接种。将细胞在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育1至2小时。孵育结束后，加入300微升预热至37摄氏度的DMEMc。然后将感染的细胞在37摄氏度、5%二氧化碳条件下继续孵育72小时。最后吸除感染细胞的上清液，并进行荧光素酶报告基因检测。为定量假病毒颗粒的感染性，首先将保存于-80°C的荧光素底物以及保存于-20°C的5倍荧光素酶检测裂解缓冲液解冻至室温。然后，用无菌水将荧光素酶报告基因检测裂解缓冲液稀释至1倍浓度。接着，向每孔中加入100 µL稀释后的缓冲液，并在室温下于摇床上孵育15分钟。为进行荧光素酶活性检测，每次处理一个孔，首先向微量离心管中加入 20 微升荧光素底物，然后向管中加入 10 微升裂解液。通过轻轻弹击管壁混合管内物质。将试管放入化学发光检测仪中。关闭盖子，测定试管的发光值。记录相对光单位（RLU）测量结果，并进行数据分析。在易感宿主细胞中进行的SARS-Spp和MERS-Spp感染性检测显示，与预期的阳性对照颗粒相比，其平均感染性较强。阴性对照为未感染的细胞以及缺乏病毒包膜糖蛋白的对照颗粒。此外，荧光素酶活性检测也表明SARS-Spp和MERS-Spp的感染性具有浓度依赖性。在转染表达SARS-Spp的ACE2受体或MERS-Spp的DPP4受体的低易感性靶细胞中，SARS-Spp或MERS-Spp的感染性增加，表明假病毒颗粒的受体使用方式与天然病毒相似，均可介导假病毒颗粒的附着和入侵。在执行此步骤前，请再次核对计算结果，并确保在该步骤中所有溶液均充分混匀。可通过蛋白质印迹实验对浓缩的假病毒颗粒进行检测，以评估S糖蛋白是否被整合到假病毒颗粒中。尽管此处描述的假病毒颗粒比天然病毒更安全，但仍需采取生物安全二级防护措施。

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科研

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Immunology and Infection

免疫学与感染

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