在生物安全2级环境中制备假型颗粒研究高致病性冠状病毒

该协议允许研究人员生成伪病毒，这些病毒可以安全地用于研究高致病性病毒的病毒进入事件，如沙冠病毒和大多数冠状病毒。这种多功能技术基于易于设置的瞬态转染。该系统还可用于产生具有其他病毒融合蛋白的粒子，而不仅仅是冠状病毒S.为了获得最佳效果，监测细胞健康和密度以进行转染以及伪型病毒感染非常重要。

演示这个程序将是蒂芙尼唐， 和拉克什米内森。我实验室的研究生首先，用10毫升37摄氏度的10毫升洗涤 HEK293T 细胞，预热 DPBS 两次。

接下来，用一毫升25%的三辛酸酯溶液吸进上一代细胞，并在37摄氏度下预热。在5%的二氧化碳环境中，在37摄氏度下孵育细胞瓶3至5分钟，直到细胞开始分离。添加四毫升完整的 DMEM，以停用 trypsin 溶液。

然后使用细胞计数幻灯片和光学显微镜对细胞进行计数。用完整的DMEM将细胞稀释到50万个细胞。接下来，在6井组织培养板中，每井的细胞溶液中播种两毫升。

轻轻地来回移动板，并侧向两侧，以均匀分布细胞。在确保细胞均匀分布后，在37摄氏度和5%的二氧化碳环境中过夜或16至18小时孵育。要预形成三种质粒共传感染，首先在微离心管中混合计算量质粒和减少的血清细胞培养培养。

在室温下孵育混合物五分钟。然后，在减少的血清细胞培养基中，每井每井添加三微升至47微升。在室温下孵育混合物五分钟。

接下来，在微型离心管中，通过管上和向下方向混合等量的转染试剂和质粒溶液。在室温下孵育混合物20分钟。细胞板过夜孵育后，使用倒置光显微镜检查细胞的形态和密度。

然后，吸气细胞的已用培养，并轻轻地添加一毫升每井预先加热减少血清细胞培养到每个井。接下来，向每个井滴添加 100 微升的转染溶液。在37摄氏度的二氧化碳中孵育细胞4至6小时。

在孵育结束时，在每井37摄氏度的温度下加入一毫升预热抗生素无转染DMEM。在37摄氏度的二氧化碳中孵育细胞48小时。开始伪型粒子收集使用倒置光显微镜检查细胞的形态和一般情况。

介质的颜色应为浅粉色或略橙色。然后，将转染细胞的超热剂转移到50毫升锥形离心管。在重力290倍时离心管7分钟，以清除细胞碎片。

接下来，通过无菌的0.45微米孔径过滤器澄清上清液。在冷冻瓶中制作小体积伪病毒溶液。并储存在负80摄氏度。

要进行伪型粒子感染，首先在光显微镜下检查细胞，以确认细胞有汇合地毯。然后，在37摄氏度下用0.5毫升预热的DPBS洗三次细胞。接下来，吸进细胞的超盐，用200微升解冻的伪型粒子溶液为细胞接种。

在37摄氏度的二氧化碳中孵育细胞一到两个小时。孵育期后，在37摄氏度下加入300微升预热DMEMc。在37摄氏度的二氧化碳中孵育受感染的细胞72小时。

最后吸气受感染细胞的超自然。并在荧光素分析记者分析之前。为了量化伪型颗粒的感染性，首先解冻荧光素基质，储存在零下80摄氏度，在5次荧光酶测定解液缓冲液储存在零下20摄氏度至室温。

然后，用无菌水稀释荧光素酶测定解液缓冲液，浓度为1倍。接下来，向每一井添加100微升稀释缓冲液。并在室温下在摇杆上孵育15分钟。

要进行荧光素活性测量，首先在微离心管中加入20微升荧光素基板。然后，将10微升的利沙酸盐加入管子。轻轻轻拂管子，混合内容物。

将管子放在发光计装置中。合上盖子并测量管的发光值。记录相对的光单位测量，并先于数据分析。

与预期的正对照粒子相比，SARS-Spp和MERS-Spp在易感宿主细胞中的感染性测定显示出很强的平均感染率。非感染控制和阴性控制颗粒缺乏病毒包络糖蛋白。此外，荧光酶活性测定显示SARS-Spp和MERS-Spp感染性浓度依赖性。

SARS-Spp或MERS-Spp在低宽松靶细胞中的感染率增加，转染为SARS-Spp的ACE2受体，或MERS-Spp的DPP4受体，证实伪病毒的受体使用与北约病毒的受体使用相似，用于调节伪病毒的依附和进入。在执行此步骤之前仔细检查计算。并确保所有解决方案在步骤中混合良好。

可以对浓缩伪型颗粒进行西式印迹测定，以评估S糖蛋白并入伪病毒。虽然此处描述的伪类型粒子比北约病毒更安全，但它们仍然需要生物安全二级预防措施。