在生物安全二级条件下制备假病毒颗粒以研究高致病性冠状病毒

本方案使研究人员能够生成假型病毒，可用于安全地研究高致病性病毒（如严重急性呼吸综合征冠状病毒和大多数冠状病毒）的病毒进入过程。这一多功能技术基于简便的瞬时转染系统构建。该系统还可用于生产携带其他病毒融合蛋白（而不仅限于冠状病毒S蛋白）的假型病毒颗粒。为获得最佳结果，必须在转染以及假型病毒感染过程中密切监测细胞状态和细胞密度。

本实验操作将由本实验室的研究生Tiffany Tang和Lakshmi Nathan进行演示。首先，用10毫升37摄氏度预热的DPBS小心洗涤HEK293T细胞，重复两次。

接下来，吸除上清液，并加入1 mL已在37°C预热的25%胰蛋白酶溶液以处理细胞。然后，将细胞培养瓶置于37°C、5%二氧化碳环境中孵育3至5分钟，直至细胞开始脱落。加入4 mL完全DMEM培养基以灭活胰蛋白酶溶液。

然后使用细胞计数板和光学显微镜进行细胞计数。用完全DMEM将细胞稀释至每毫升500,000个细胞。接着，在6孔组织培养板中每孔接种2毫升细胞悬液。

轻轻前后左右移动培养板，以均匀分散细胞。确保细胞均匀分布后，将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳环境中孵育过夜，或孵育16至18小时。进行三种质粒共转染时，首先在微量离心管中混合计算好体积的质粒与减血清细胞培养基。

将混合物在室温下孵育五分钟。然后向每孔47微升的低血清细胞培养基中加入每孔3微升的脂质转染试剂。将混合物在室温下孵育五分钟。

接下来，在微量离心管中，通过反复吹打数次，将转染试剂与质粒溶液等量混合。室温孵育20分钟。细胞培养板过夜孵育后，使用倒置光学显微镜观察细胞的形态和密度。

然后，吸除细胞的旧培养基，每孔轻轻加入一毫升预热的低血清细胞培养基。接着，每孔逐滴加入100微升转染溶液。将细胞在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育四至六小时。

孵育结束后，向每个孔中加入1毫升预热至37摄氏度的无抗生素转染DMEM培养基，并在37摄氏度、5%二氧化碳条件下继续孵育细胞48小时。开始收集假型病毒颗粒时，使用倒置光学显微镜观察细胞的形态和整体状态。

培养基的颜色应为浅粉色或微橙色。然后，将转染细胞的上清液转移至50毫升锥形离心管中。以290 ×g离心7分钟，以去除细胞碎片。

接下来，将澄清的上清液通过无菌的0.45微米孔径滤器过滤。将假型病毒溶液分装至冻存管中，制成小体积 aliquot，并于-80摄氏度保存。

进行假病毒颗粒感染时，首先在光学显微镜下观察细胞，确认细胞已形成完全融合的单层。随后，用37摄氏度预热的DPBS溶液洗涤细胞三次，每次0.5毫升。接着，吸除细胞的上清液，并向细胞中加入200微升解冻后的假病毒颗粒溶液进行接种。

将细胞在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育1至2小时。孵育结束后，加入300微升预热至37摄氏度的DMEMc。然后将感染的细胞在37摄氏度、5%二氧化碳条件下继续孵育72小时。

最后吸除感染细胞的上清液，并进行荧光素酶报告基因检测。为定量假病毒颗粒的感染性，首先将保存于-80°C的荧光素底物以及保存于-20°C的5倍荧光素酶检测裂解缓冲液解冻至室温。

然后，用无菌水将荧光素酶报告基因检测裂解缓冲液稀释至1倍浓度。接着，向每孔中加入100 µL稀释后的缓冲液，并在室温下于摇床上孵育15分钟。

为进行荧光素酶活性检测，每次处理一个孔，首先向微量离心管中加入 20 微升荧光素底物，然后向管中加入 10 微升裂解液。通过轻轻弹击管壁混合管内物质。

将试管放入化学发光检测仪中。关闭盖子，测定试管的发光值。记录相对光单位（RLU）测量结果，并进行数据分析。

在易感宿主细胞中进行的SARS-Spp和MERS-Spp感染性检测显示，与预期的阳性对照颗粒相比，其平均感染性较强。阴性对照为未感染的细胞以及缺乏病毒包膜糖蛋白的对照颗粒。此外，荧光素酶活性检测也表明SARS-Spp和MERS-Spp的感染性具有浓度依赖性。

在转染表达SARS-Spp的ACE2受体或MERS-Spp的DPP4受体的低易感性靶细胞中，SARS-Spp或MERS-Spp的感染性增加，表明假病毒颗粒的受体使用方式与天然病毒相似，均可介导假病毒颗粒的附着和入侵。在执行此步骤前，请再次核对计算结果，并确保在该步骤中所有溶液均充分混匀。

可通过蛋白质印迹实验对浓缩的假病毒颗粒进行检测，以评估S糖蛋白是否被整合到假病毒颗粒中。尽管此处描述的假病毒颗粒比天然病毒更安全，但仍需采取生物安全二级防护措施。