热稳定，表达，纯化，和人类血清素转运蛋白结晶绑定到取值 -citalopram

该程序的总体目标是产生一个足够稳定的转运蛋白以进行结构研究，并使用这种修饰的转运蛋白产生通过 X 射线晶体学达到高分辨率的晶体。该方法可以回答结构生物学领域的关键问题，例如如何解决作为重要药物靶点的膜蛋白的结构。该技术的主要优点是它可用于使用功能测定从药物结合构象中进行选择。

虽然这种方法可以提供对神经递质转运蛋白的见解，但它也可以应用于受体、通道和可溶性蛋白质，它们以高亲和力结合小分子。在一次性移液器储液器中，将补充有 10% 胎牛血清的 DMEM 中彻底重悬胰蛋白酶化的 HEK293S GnTI 负细胞，使其密度为每毫升 50 万个细胞。使用多通道移液器，向聚-D-赖氨酸包被板的每个孔中加入 100 微升细胞。

填充每个板后，将细胞重悬于移液器储液槽中，以确保细胞分布均匀。在 37 摄氏度的培养箱中用 8% 二氧化碳孵育细胞。在横流前 1 小时更换细胞培养基。

通过将 450 ng DNA 与 45 μL 无血清 DMEM 混合，制备 DNA 转运试剂复合物，用于要筛选的 cert TC 背景中的每个构建体。然后将 1.6 μL 的对流试剂添加到 45 μL 的无血清 DMEM 中并混合。立即将稀释的 transvection 试剂溶液添加到 DNA 溶液中并混合。

不要以相反的顺序混合溶液。等待 10 到 15 分钟，然后将 20 μL 的 transvection 试剂 DNA 混合物添加到 4 个孔中。在室温下将细胞与 200 纳摩尔西酞普兰和 25 μL TBS 一起孵育 5 分钟。

为了溶解细胞，在 TBS 中加入 25 微升 8 毫摩尔 C12M、1 毫摩尔 CHS 和蛋白酶抑制剂混合物。在室温下孵育细胞 1 小时。然后将 50 微升 TBS 与 20 纳摩尔氚化西酞普兰、0.1% 牛血清白蛋白和毫克/毫升 His 标签亲和闪烁邻近测定或 SPA 珠子添加到每个构建体的三个孔中。

对于最后一个孔，加入相同的 TBS 溶液，但补充 100 微摩尔舍曲林以确定非特异性结合。将 his tag 亲和性 SPA 珠子添加到 96 孔板中时，确保将其彻底混合。在室温下使用 96 孔闪烁计数器测量氚化西酞普兰结合，每孔计数时间为 1 分钟。

继续计数板，直到总计数在大约 36 小时时趋于稳定。测量后，在带有加热盖的加热块中将板在 15 摄氏度下加热 33 分钟。加热后再次测量氚化西酞普兰的结合。

重复这些步骤并修改加热步骤。根据目标蛋白质的表观熔解温度和最稳定构建体的热稳定性调整加热温度。继续加热板，直到所有构建体的比计数都较低。

37 摄氏度、8% 二氧化碳和 85% 湿度的摇床上以 130 RPM 和 293 种补充有 2% 胎牛血清的表达培养基HEK293S悬浮液中培养 GnTI 减去细胞。用 P2 病毒感染 10 升细胞，感染倍数为 2，密度为每毫升 300 万个细胞。感染后 12 至 16 小时，从 1 磨牙原液中加入浓度为 10 毫摩尔的丁酸钠。

感染后 48 至 60 小时，以 4， 000 倍 G 离心 15 分钟收获细胞。去除上清液。用 2 微摩尔艾司西酞普兰或其他 SERT 抑制剂将细胞重悬于 150 毫升 TBS 中。

将 10 升培养物中的细胞置于约 30 摄氏度的温水中，并通过快速将细胞通过 10 毫升移液管使其重悬，直至均匀。将所有细胞加入带有搅拌棒的烧杯中，并在搅拌的同时将所有去污剂溶液加入细胞中。在 4 摄氏度下搅拌溶解细胞 1 小时。

在 4 摄氏度下以 8， 000 倍 G 离心裂解物 15 分钟。将上清液倒入干净的超速离心管中，丢弃沉淀。然后在超速离心机中以 100， 000 倍 G 离心上清液 1 小时。

超速离心后，通过 0.2 微米过滤器过滤上清液并丢弃沉淀。接下来，使用在洗涤缓冲液中平衡的盐周泵将超过 10 mL 的链球菌亲和树脂填料裂解物通入色谱柱中。然后将链球菌亲和柱连接到快速蛋白质液相色谱系统，并用 66 mL洗涤缓冲液以每分钟 2 mL 的速度洗涤柱。

使用 33 mL 缓冲液，在补充有 5 毫摩尔脱硫生物素的相同洗涤缓冲液中以每分钟 0.5 mL的速度洗脱纯化的蛋白质。收集 1 毫升馏分。峰分数约为 10 毫升。

为了形成转运蛋白抗体复合物，首先在室温下用凝血酶消化纯化的蛋白质过夜以去除标签，并使用 Endo H 进行糖基释放。使用 100 道尔顿截留分子量离心机蛋白质浓缩器将蛋白质浓缩至 10 毫克/毫升的浓度和 250 至 300 微升的体积。将浓缩的 SERT 蛋白与 8B6 Fab 以 1 至 1.2 的摩尔比混合，体积小于 500 μL。

混合物以 100， 000 倍 G 和 4 摄氏度离心 20 分钟。离心后，收集含有 SERT Fab 复合物的上清液，并丢弃沉淀。在体积排阻柱上使用快速蛋白质液相色谱分离复合物。

用补充的 TBS 以每分钟 0.5 毫升的速度平衡它。结晶前，使用 100 kdalton 截留分子量离心机蛋白质浓缩器将复合物分离的峰馏分浓缩至 2 毫克/毫升。280 纳米处 2 AU 的吸光度等于每毫升 1 毫克。

以 1 比 0.05 的比例向游离 Fab 添加额外的 Fab。还要添加 10 微摩尔游离 S 西酞普兰。离心样品后，收集含有 SERT Fab 复合物的上清液并丢弃沉淀。

根据文本方案中的表 1，在 4 摄氏度下设置一个悬滴 24 孔筛网。在低矮型 24 孔板中吸取 500 μL 每种储液槽溶液，并在每个孔上涂抹密封剂。将 1.5、1.75 和 2 微升 SERT Fab 复合物移液到 18 毫米硅化玻璃盖玻片上。

然后在蛋白质样品上吸取 1 微升储液槽溶液。单晶将在大约 3 天内出现，14 天后长到 100 至 175 微米。此处显示的是氚化西酞普兰存在下筛选热稳定性的代表性结果。

根据最大结合绘制的熔解温度值显示具有高热稳定性和表达的突变体。此处显示的是野生型 SERT TC 和前三个突变体 Y110A、I291A 和 T439S 的热稳定性曲线。该显微镜图像显示了表达 SERT CC 的 HEK293S 个 GnTI 缺失细胞，细胞膜上存在绿色荧光。

SERT CC 的荧光检测尺寸排阻色谱显示 15 mL 处的主峰。通过 SDS-PAGE 分析显示单一蛋白质种类基本无污染。显示了通过体积排阻色谱法分离转运蛋白抗体复合物的代表性结果。

11.5 mL 洗脱的主峰同时包含 SERT 和 Fab，如 SDS-PAGE 凝胶所示。生长两周后，与西酞普兰链球菌结合的 SERT 抗体复合物的光学显微镜检查显示大约 100 至 175 微米的棱柱状晶体。观看此视频后，您应该对如何在配体结合确认中识别稳定膜蛋白的突变以及如何使用蛋白质抗体复合物进行结晶筛选有很好的了解。

当尝试执行此程序时，重要的是要记住配体对于稳定 SERT TC 是必需的，并且对于 SERT CC 的结晶至关重要.该技术的含义延伸到精神疾病的治疗，因为 SERT 是许多抗抑郁药物的分子靶点。按照此程序，可以使用生化和生物物理方法表征纯化的 SERT 的功能。