Name: 热稳定，表达，纯化，和人类血清素转运蛋白结晶绑定到取值 -citalopram (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 21 s
Description: 了解人类血清素转运蛋白的热稳定、表达、纯化及与S-西酞普兰结合的结晶方法。该技术适用于研究膜蛋白结构生物学，为抗抑郁药物设计提供重要结构信息。

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感谢 D. Cawley 制备单克隆抗体。感谢 A. Penmatsa 和 K. Wang 分享他们在多巴胺转运蛋白研究中积累的思路与专业知识。感谢 L. Vaskalis 在图示绘制方面的协助，H. Owen 在稿件准备中的帮助，以及 Gouaux 实验室其他成员提供的有益讨论。J.A.C. 获得加拿大卫生研究院颁发的班廷博士后奖学金资助。E.M.G. 获得美国国家科学基金会研究生研究奖学金支持。我们特别感谢 Bernie 和 Jennifer LaCroute 的慷慨资助，同时也感谢美国国立卫生研究院（NIH，项目编号：5R37MH070039）提供的经费支持。E.G. 是霍华德·休斯医学研究所的研究员。

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作者无任何利益冲突需要披露。

通过生物物理技术确定膜蛋白结构对于许多具有重要医学意义的转运蛋白、受体和通道而言，仍是一项艰巨的任务11. 本文分享了用于解析人源五羟色胺转运蛋白与配体结合状态下结构的详细专业技术 S-西酞普兰。我们预计这些方法将有助于确定SERT在其他构象状态下的结构，以及其他难以处理的膜蛋白的结构。此外，本文所述的生化技术也可用于研究在去垢剂和接近天然脂质环境中纯化的SERT的功能。
SERT 的结晶依赖于多种工具和技术的开发。首先，转运蛋白热稳定性的提升获得了在从膜中提取后于各种去垢剂胶束中表现良好的 SERT 突变体6。其次，高亲和力配体的使用 S-西酞普兰在整个纯化和结晶过程中进一步提高了稳定性并减少了构象异质性。第三，BacMam表达系统的开发7 可在短短两周内大量生产SERT，从而促进免疫和结晶。最后，通过开发筛选高亲和力抗体的策略，这些抗体可识别三维表位，进而发现了8B6抗体，该抗体可促进SERT-抗体复合物有序堆积形成晶体。
在本实验方案的实施过程中，存在若干关键步骤、试剂以及常见问题。首先，高滴度 SERT P2 病毒的制备可能存在问题。按照本方案所述，使用低浓度的 P1 病毒来制备 P2 病毒通常可缓解该问题；若 P2 病毒滴度仍然较低，可使用 MOI 为 0.0001 的病毒制备 P3 病毒。病毒滴度低于 1 × 108 病毒颗粒/mL&#160;的样品不应使用，因其几乎总会导致蛋白产量低下。在蛋白表达方面，选择 HEK293S GnTI- 细胞的原因在于其缺乏 N-乙酰氨基葡萄糖转移酶 I 活性，因而无法合成复杂的 N-聚糖，仅能产生高甘露糖型 N-聚糖。EndoH 可在细胞外环 2（EL2）的两个位点切割高甘露糖型 N-连接聚糖，使 N-乙酰氨基葡萄糖残基仍连接在天冬酰胺上。N-连接糖链的消化可降低 EL2 表面的构象熵，这可能对结晶至关重要。在抗体生成过程中，应使用 SERTIC 进行免疫。GFP 具有强免疫原性12，不应作为融合标签用于抗体生产，因其难以通过尺寸排阻色谱（SEC）完全去除。此外，SERT 的柔性 N 端和 C 端未包含在构建体中，以避免产生针对这些区域的抗体。可使用 30 µg 重组蛋白对小鼠进行免疫，并持续免疫直至血清中检测到高浓度抗体，随后按文献所述方法制备杂交瘤细胞13。通常，热稳定化构建体是免疫的最佳选择；若转运蛋白在纯化后行为良好并保持生物学活性，则通常足以诱导产生抗体。8B6 抗体是针对野生型 SERT（WT SERT）产生的。在结晶过程中，仅应合并并浓缩 SEC 洗脱峰中经荧光尺寸排阻色谱（FSEC）判断为单一分散复合物的组分。SERT-8B6 晶体的生长条件范围较窄，针对 SERT 晶体生长相关问题需采取若干排查措施。在储液（reservoir solution）中不应使用 HCl 调节 pH 的 Tris 碱，因为该缓冲体系不支持晶体生长；因此，必须改用 NaOH 调节 pH 的 Tris 缓冲液。SERT 晶体对 PEG 400 的浓度范围要求较窄，若未观察到晶体或仅出现大量微小晶体，建议微调 PEG 400 浓度（略微升高或降低）。此外，在优化筛选中还使用了添加剂 6-氨基己酸以促进成核。蛋白溶液与孔板溶液的液滴比例也是决定晶体生长的关键因素，推荐使用 1.5–2:1 的比例，其中接近 2:1 的比例通常更有利于生长较大的三维晶体。最后，使用低剖面（low profile）24 孔板对晶体生长也至关重要，推测其原因是影响了气相扩散的速率。
已开发出一种替代SPA方法的策略，用于筛选能够稳定大鼠5-羟色胺转运体在可卡因结合构象下的突变体，该方法采用滤膜结合实验5。相比之下，基于SPA的检测方法可在一系列逐步升温步骤后，测定仍与配体结合的SERT所占比例，从而能够利用少量样品快速确定其熔解温度。SPA方法依赖于高亲和力放射性标记配体的可获得性；若尚无已知亲和力达到亚微摩尔级别的配体，则必须采用替代方法。目前常用于测量蛋白质稳定性的其他多种方法，如荧光染料结合法和量热法14，通常通量较低，且要么无法直接测量功能，要么需要大量蛋白质。如果无法使用SPA方法，一种可行的高通量替代方案是基于荧光检测尺寸排阻色谱的热稳定性分析法15（FSEC-TS），该方法先对样品加热，再分离仍保留的转运体组分。FSEC-TS是一种可用于评估色谱行为和寡聚状态的有效方法，是一种强大的互补工具，可与SPA方法联合使用。
对多种常见蛋白质表达系统的比较也发现，哺乳动物细胞更适用于SERT的表达16，这并不令人意外，对于许多来源于哺乳动物的蛋白质而言，情况可能同样如此。我们所采用的表达方法虽针对SERT进行了优化，但很可能易于调整并适用于其他蛋白。应通过改变表达时间、温度、病毒浓度以及组蛋白去乙酰化酶抑制剂（如丁酸钠）的存在与否，仔细确定有利于高水平表达的条件。
我们通常倾向于在重组之前，使用温和的长链去垢剂（如 C12M）并联合 CHS 进行亲和纯化，以保持高亲和力配体的结合能力。利用疏水吸附进行重组是一种温和的技术，我们发现其对多种其他转运蛋白和受体均有效。如果该方法不成功，只要抗原在这些去垢剂中具有足够的稳定性，即可通过透析、稀释或尺寸排阻色谱（SEC）去除具有高临界胶束浓度的去垢剂17。在未能找到合适抗体的情况下，我们几乎总是发现问题是由于抗原功能丧失或发生变性所致；对此类情况，我们通过重新免疫并特别关注蛋白质生化特性而成功获得抗体。最后，应基于高亲和力结合的配体和抗体合理设计结晶实验，并通过利用热稳定突变体，通过调节不同去垢剂的性质来筛选更广泛的结晶条件。此外，应始终将脂质介相中的结晶18或使用双亲颗粒（bicelles）的结晶19作为胶束中结晶的替代方案予以考虑。
这些原理和方法经过适当修改后，可适用于许多其他难以从其他表达宿主中表达和纯化的跨膜蛋白，对于高亲和力药物靶点的结构解析将特别有用。

5-羟色胺转运蛋白（SERT）是一种整合膜蛋白，可介导5-羟色胺跨细胞膜的转运1。SERT属于神经递质钠共转运蛋白（NSS）家族，该家族还包括多巴胺和去甲肾上腺素转运蛋白2。SERT是广泛使用的抗抑郁药和抗焦虑药物的分子靶点，这些药物通过竞争性抑制5-羟色胺的转运发挥作用3。SERT利用钠离子协同转运所提供的能量优势，将神经递质从突触间隙清除。对5-羟色胺系统的广泛研究表明，5-羟色胺代谢的改变几乎影响所有神经系统过程，包括情绪、睡眠、疼痛、认知以及攻击性行为4。SERT的功能可通过抗抑郁药和选择性5-羟色胺再摄取抑制剂（SSRIs）如S-西酞普兰进行调节，也可通过精神兴奋剂和成瘾性药物如苯丙胺以及3,4-亚甲二氧基-N-甲基苯丙胺（即&#34;摇头丸&#34;）来改变1,2。
选择性5-羟色胺再摄取抑制剂（SSRIs）在治疗情绪障碍方面具有极其重要的作用，然而其作用的精确结构基础尚不明确。野生型SERT在去垢剂胶束中不稳定，因而阻碍了SERT三维（3D）结构研究的进展5,6最近，我们开发了SERT的多种变异体，这些变异体在多种去垢剂中均表现出高度稳定性，并保持了对SSRI的结合活性。6这些耐热型SERT变体是使用基于闪烁接近法的热稳定性检测技术筛选获得的。本文描述了一种制备可结合SERT的高亲和力抗体的方法，以及耐热型SERT与抗体形成复合物后的纯化与结晶过程。 S-西酞普兰
本实验方案假设SERT和8B6基因已分别成功克隆至BacMam7和昆虫表达载体中。为制备抗体，将编码野生型SERT第73-616位氨基酸的cDNA克隆至BacMam载体，并在C末端添加Strep II标签（SERTIC）。在热稳定性筛选实验中，使用了在C末端带有GFP、Strep II和10-His标签的SERT第73-616位氨基酸（SERTTC）。所有单点突变均在SERTTC背景下引入。在结晶实验方案中，使用了SERT-GFP融合蛋白，其带有Twin-Strep标签[TrpSerHisProGlnPheGluLys(GlyGlyGlySer)2GlyGlySerAlaTrpSerHisProGlnPheGluLys]和10-His标签，并包含以下热稳定性突变：Y110A、I291A和T439S，以及表面半胱氨酸突变C554A、C580A和C622A（SERTCC）。此外，在SERTCC的Q76和T618之后插入了凝血酶切割序列（LVPRGS），以便去除N端和C端。编码8B6 Fab的质粒经改造后可在两个独立的多角体启动子控制下，分别表达抗体的重链和轻链，并带有GP67分泌信号序列。8B6抗体重链的C末端带有8-His标签，并在重链与标签之间插入了凝血酶切割位点。

<table><tbody><tr><td>DH10Bac</td><td>Invitrogen</td><td>10361-012</td><td></td></tr><tr><td>卡那霉素</td><td>Fisher</td><td>BP906-5</td><td></td></tr><tr><td>庆大霉素</td><td>Fisher</td><td>BP918-1</td><td></td></tr><tr><td>四环素</td><td>Sigma</td><td>T-7660</td><td></td></tr><tr><td>Bluo-gal</td><td>Invitrogen</td><td>15519-028</td><td>5-溴-3-吲哚基 &amp;beta;-D-半乳吡喃糖苷</td></tr><tr><td>异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷</td><td>Anatrace</td><td>I1003</td><td>IPTG</td></tr><tr><td>质粒小提试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>Cellfectin II</td><td>Invitrogen</td><td>10362-100</td><td>Sf9 转染试剂</td></tr><tr><td>Sf9</td><td>ATCC</td><td>CRL-1711</td><td></td></tr><tr><td>Sf-900 III 无血清培养基</td><td>Life Technologies</td><td>12658-027</td><td></td></tr><tr><td>HEK-293S GnTI&lt;sup&gt;-&lt;/sup&gt;</td><td>ATCC</td><td>CRL-3022</td><td></td></tr><tr><td>Freestyle 293 培养基</td><td>Life Technologies</td><td>12338-018</td><td>293 表达培养基</td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Life Technologies</td><td>0984018DJ</td><td></td></tr><tr><td>丁酸钠</td><td>Sigma</td><td>303410</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;S&lt;/em&gt;西酞普兰</td><td>Sigma</td><td>E4786</td><td>Anagrade</td></tr><tr><td>正十二烷基-β-D-麦芽糖吡喃糖苷</td><td>Anatrace</td><td>D310</td><td></td></tr><tr><td>胆固醇半琥珀酸酯</td><td>Sigma</td><td>C6013</td><td></td></tr><tr><td>1-棕榈酰-2-油酰-&lt;em&gt;sn&lt;/em&gt;-甘油-3-磷酸胆碱</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850457P</td><td></td></tr><tr><td>1-棕榈酰-2-油酰-&lt;em&gt;sn&lt;/em&gt;-甘油-3-磷酸乙醇胺</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850757P</td><td></td></tr><tr><td>1-棕榈酰-2-油酰-&lt;em&gt;sn&lt;/em&gt;甘油-3-磷酸甘油</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840457P</td><td></td></tr><tr><td>亮抑蛋白酶肽</td><td>Sigma</td><td>L2884</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatin A</td><td>Sigma</td><td>P5318</td><td></td></tr><tr><td>抑肽酶</td><td>Sigma</td><td>A1153</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>脱硫生物素</td><td>艾巴生命科学</td><td>2-1000-05</td><td></td></tr><tr><td>Asolectin</td><td>Sigma</td><td>11145</td><td></td></tr><tr><td>胆固醇</td><td>Sigma</td><td>C-8667</td><td></td></tr><tr><td>脂质A</td><td>Sigma</td><td>L5399</td><td></td></tr><tr><td>脑极性脂质</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>141101C</td><td></td></tr><tr><td>Biobeads</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>152-3920</td><td>疏水性吸附树脂</td></tr><tr><td>IRDye 680RD 标记的山羊抗小鼠抗体</td><td>奥德赛</td><td>926-68070</td><td>用作蛋白质印迹的二抗</td></tr><tr><td>月桂基麦芽糖新戊二醇</td><td>Anatrace</td><td>NG310</td><td>Anagrade</td></tr><tr><td>血清素</td><td>Sigma</td><td>H9523</td><td></td></tr><tr><td>pFastBac 8B6</td><td></td><td></td><td>作者提供</td></tr><tr><td>pEG Bacmam SERT Strep II</td><td></td><td></td><td>SERT&lt;sub&gt;IC&lt;/sub&gt;，可向作者索取</td></tr><tr><td>pEG Bacmam SERT GFP twin Strep His</td><td></td><td></td><td>SERT&lt;sub&gt;TC&lt;/sub&gt;，可向作者索取</td></tr><tr><td>pEG Bacmam SERT ts3 GFP twin Strep His</td><td></td><td></td><td>SERT&lt;sub&gt;CC&lt;/sub&gt;，可向作者索取</td></tr><tr><td>咪唑</td><td>Sigma</td><td>56749</td><td></td></tr><tr><td>正辛基 &amp;beta;-D-麦芽糖苷</td><td>Anatrace</td><td>O310</td><td>Anagrade</td></tr><tr><td>凝血酶</td><td>血液学技术</td><td>HCT-0020</td><td></td></tr><tr><td>EndoH</td><td>New England Biolabs</td><td>P0702</td><td></td></tr><tr><td>Trizma-HCl</td><td>Sigma</td><td>T5941</td><td>Tris 用于配制结晶储液</td></tr><tr><td>PEG 400</td><td>Sigma</td><td>91893</td><td></td></tr><tr><td>6-氨基己酸</td><td>Sigma</td><td>7260</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA</td><td>Fisher</td><td>MT25052CV</td><td></td></tr><tr><td>Isoplate-96 TC</td><td>PerkinElmer</td><td>6005070</td><td></td></tr><tr><td>PolyJet</td><td>SignaGen</td><td>SL100688</td><td>用于哺乳动物细胞的聚合物转染试剂</td></tr><tr><td>铜组氨酸标签YSI SPA珠</td><td>PerkinElmer</td><td>RPNQ0096</td><td>His标签亲和SPA珠</td></tr><tr><td>西酞普兰，[N-甲基-&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;H]</td><td>PerkinElmer</td><td>NET1039250UC</td><td></td></tr><tr><td>ThermoMixer C</td><td>Eppendorf</td><td>5382000023</td><td>用于热稳定性检测的加热块</td></tr><tr><td>ThermoTop</td><td>Eppendorf</td><td>5308000003</td><td></td></tr><tr><td>SmartBlock PCR 96，用于PCR板的热循环模块</td><td>Eppendorf</td><td>5306000006</td><td></td></tr><tr><td>0.2 &amp;micro;m 注射器滤器</td><td>奥林巴斯塑料公司</td><td>25-243</td><td></td></tr><tr><td>1 L 滤器系统</td><td>康宁</td><td>430517</td><td></td></tr><tr><td>2 L 平底组织培养瓶</td><td>Genemate</td><td>F-5909-2000</td><td></td></tr><tr><td>2 L 带挡板的组织培养瓶</td><td>Genemate</td><td>F-5909-2000B</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>3950</td><td></td></tr><tr><td>Forma 轨道摇床</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>416</td><td></td></tr><tr><td>Strep-Tactin 树脂</td><td>艾巴生命科学</td><td>2-1208-025</td><td>Strep亲和树脂</td></tr><tr><td>挤出机</td><td>北方脂质</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Li-Cor 成像系统</td><td>奥德赛</td><td></td><td>western blot 成像系统</td></tr><tr><td>XK16 柱</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9889-37</td><td>用于 Strep-Tactin 和 Talon 纯化的柱子</td></tr><tr><td>100 kDa 分子量截留值蛋白浓缩管</td><td>Millipore</td><td>UFC910096</td><td></td></tr><tr><td>30 kDa 分子量截留值蛋白浓缩管</td><td>Millipore</td><td>UFC903024</td><td></td></tr><tr><td>&amp;Auml;kta FPLC</td><td>GE Healthcare</td><td>UPC-900</td><td></td></tr><tr><td>高效液相色谱</td><td>岛津</td><td>51476</td><td></td></tr><tr><td>Superose 6 (10/300) 柱</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5172-01</td><td>用于FSEC</td></tr><tr><td>切向流装置</td><td>Pall Filtron</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2 &amp;micro;m滤器切向流过滤装置</td><td>Pall Filtron</td><td>PSM20C11</td><td></td></tr><tr><td>30 kDa 分子量截留值切向流浓缩器</td><td>Pall Filtron</td><td>OS030T12</td><td></td></tr><tr><td>Talon 树脂</td><td>Clonetech</td><td>635504</td><td>用于Fab纯化的His标签亲和树脂</td></tr><tr><td>1 mL HiTrap SP 柱</td><td>GE Healthcare</td><td>17115101</td><td>用于Fab纯化的阳离子交换剂</td></tr><tr><td>Superdex 200 10/300 GL 柱</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5175-01</td><td>用于SERT-8B6的SEC分离</td></tr><tr><td>24孔VDXm板</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-306</td><td></td></tr><tr><td>18 mm 盖玻片</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-239</td><td></td></tr><tr><td>Virocyt 病毒计数器</td><td>Virocyt</td><td>2100</td><td></td></tr><tr><td>MicroBeta Trilux</td><td>PerkinElmer</td><td>1450</td><td>96孔闪烁计数器</td></tr><tr><td>HiTrap SP 柱</td><td>GE Healthcare</td><td>17115101</td><td></td></tr><tr><td>舍曲林</td><td>Sigma</td><td>S6319</td><td></td></tr></tbody></table>

人5-羟色胺转运蛋白与配体结合的热稳定化、表达、纯化及结晶 s西酞普兰

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

5-羟色胺转运蛋白是一种依赖钠离子和氯离子的转运蛋白 &#34;泵&#34; 细胞外5-羟色胺进入细胞。 S西酞普兰是一种通过高亲和力结合5-羟色胺转运体并阻断5-羟色胺重摄取来治疗抑郁和焦虑的药物。本文报道了一种高效的方法及一系列工具，用于稳定、表达、纯化以及结晶与5-羟色胺转运体-抗体复合物结合的西酞普兰 S-西酞普兰及其他抗抑郁药物。通过使用一种稳定5-羟色胺转运蛋白的突变体鉴定方法，鉴定了可稳定5-羟色胺转运蛋白的突变位点 S-citalopram 结合实验。在杆状病毒转导的 HEK293S GnTI 细胞中表达的5-羟色胺转运蛋白- 细胞被重建为蛋白脂质体，并用于制备高亲和力抗体。我们已开发出一种策略，用于发现适用于结构研究的抗体。同时建立了一种在Sf9细胞中表达抗体片段的简便方法。通过该流程纯化的转运蛋白-抗体复合物性质良好，易于结晶，可形成结构明确的复合物 S-西酞普兰，其晶体可将X射线衍射至3–4 Å分辨率。本研究中开发的策略可用于解析其他难以处理的膜蛋白的结构。

在SERTTC背景下构建了单点突变体文库，用于筛选具有热稳定性的突变。各个突变体通过标准的定点突变方法获得。筛选流程采用瞬时转染的HEK293S细胞，并结合基于闪烁 proximity 的热稳定性检测方法，快速鉴定适用于晶体生长的有益突变，如图1A所示。将Tm值与室温下结合的[3H]西酞普兰量作图，可识别出具有高热稳定性且表达水平适合蛋白纯化的构建体（图1B）。将三个突变（Y110A、I291A和T439S）组合，获得一个高度稳定的构建体（图1C）。热稳定性还与在短链去垢剂中稳定性的提高相关，而短链去垢剂对于SERT-Fab复合物的结晶至关重要。
利用杆状病毒转导的HEK293S GnTI细胞大规模表达人源SERT- 细胞培养可能耗时不到两周，并可产生毫克级的产物，如图所示。 图2A. GFP 标记的 SERT 的使用CC 蛋白使得SERT在表达和纯化过程中可通过荧光方便地进行追踪图2B）。我们的纯化策略包括 1）溶解与 SERT 结合的 S-citalopram 来自 HEK293S GnTI- 在CHS作为稳定脂质存在的情况下，于C12M中制备细胞；2）SERT与Strep亲和基质结合；3）通过充分洗涤去除污染蛋白；4）用含有脱硫生物素的缓冲液洗脱具有功能活性的SERT图2C). 经考马斯亮蓝染色检测，洗脱的蛋白质几乎不含其他可检测的蛋白质，并通过FSEC判断为单分散状态图2D，E).
采用类似策略纯化带有Strep II标签的SERT，并将其用于重组及免疫（图3A，B）。将SERT整合入蛋白脂质体可延长其血清半衰期和稳定性，并提高获得高亲和力抗体的可能性。此外，加入细菌细胞壁组分脂质A可作为强效佐剂9。通过向玻璃管中干燥的脂质混合物加入缓冲液并重悬，制备多层脂质体。将脂质体经200 nm孔径滤膜挤出，得到单分散的单层脂质体悬液。随后用去垢剂饱和脂质体，再加入溶于去垢剂中的纯化SERT。最后，通过向脂质-去垢剂混合物中加入疏水性吸附树脂以去除去垢剂。应在重组样品中添加额外配体，以便筛选识别抗抑郁药结合构象的抗体。应通过SDS-PAGE上样染料或C12M溶解少量样品，并进行SDS-PAGE和FSEC分析，以确认蛋白脂质体中存在SERT（图3C，D）。
可筛选表达SERT抗体的杂交瘤细胞系，以获得能够识别三维表位的高亲和力结合抗体。这些特性对于最终成功结晶至关重要，因为抗体必须牢固结合在结构化区域，以促进均一且有序结构域的晶体堆积。第一步是鉴定识别非结构化区域的抗体。将SERT变性后转印至硝酸纤维素膜上；能够结合变性SERT的抗体在Western印迹中呈阳性，且很可能识别线性表位。在图4A中，我们展示了两种Western印迹阳性抗体示例，这类抗体可能不利于促进结晶。在图4B中，将剩余的Western印迹阴性抗体与100 nM SERT-GFP共同孵育，并通过FSEC进行分离。能够结合SERT的抗体将使GFP阳性峰向更早的洗脱位置偏移。SERT-抗体复合物可在去垢剂中进一步稀释，以确定其是否仍能以纳摩尔亲和力结合，随后通过FSEC进行分析。加入5-羟色胺后会引起转运蛋白的构象变化，因此可重新筛选抗体，以判断其是否能特异性识别SSRI结合状态下的构象。在图4C中，结果显示这些抗体在存在5-羟色胺的情况下仍能结合SERT，表明其表位在SSRI结合态与底物结合态之间未发生改变。最后，在图4D中测试抗体组合是否能够结合不同的表位，从而产生进一步的左移峰。结果显示，15B8或8A11抗体所识别的表位不同于8B6抗体所识别的表位。
根据使用木瓜蛋白酶处理的Fab片段进行的初步晶体筛选，选择8B6抗体进行进一步的结构分析。将8B6 Fab的基因克隆至昆虫细胞表达载体中。Fab可在悬浮培养的Sf9细胞中表达并分泌。通过His标签亲和层析（图5A，B）和阳离子交换层析（图5C，D）可从Sf9细胞上清液中纯化8B6 Fab，所得蛋白在SDS-PAGE凝胶上显示无污染物。在图5E中，显示重组8B6 Fab能够结合SERT，并被用于后续的生物化学与生物物理实验。
在 S-西酞普兰存在下，将亲和纯化的 SERTCC 与凝血酶和内切糖苷酶 H（EndoH）进行消化，并加入 8B6 Fab 片段以形成复合物。转运蛋白-抗体复合物随后在 C8M 条件下通过尺寸排阻色谱法（SEC）进行分离（图 6A），其洗脱峰组分中均含有 SERT 和 Fab，SDS-PAGE 结果如（图 6B）所示。使用 C8M 对晶体形成至关重要，可能是因为短链去垢剂有助于分子在晶格中更紧密地排列。采用荧光尺寸排阻色谱法（FSEC）确定可用于结晶的组分（图 6C）；不应合并那些非单分散的组分，或含有大量游离 SERT 或 Fab 的组分。
使用该方案通过悬滴气相扩散法，在存在 S-西酞普兰的条件下可生长出棱柱形的SERT-抗体晶体（图7A）。所得晶体的X射线衍射分辨率可达3.15 Å10（图7B）。
<img alt="SERT突变体的热稳定性检测；A：流程图，B：Tm与结合率关系图，C：结合率随温度变化曲线。" src="/files/ftp_upload/54792/54792fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1：基于闪烁接近法的热稳定性检测。A．在存在[3H]西酞普兰的条件下，筛选热稳定性的实验流程概述。B．最大结合的[3H]西酞普兰量与表观熔解温度（Tm）的关系。虚线表示野生型（WT）转运蛋白的数值。最稳定的3种突变体已标注。灰色区域代表相对于野生型，[3H]西酞普兰结合率低于10%的突变体，由于信噪比较低，其Tm值不准确。C．野生型SERTTC及最稳定的3种突变体的热稳定性曲线。误差棒表示标准差（S.D.）。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="杆状病毒表达系统；蛋白质表达过程示意图、荧光显微镜图像、色谱结果、SDS-PAGE、荧光光谱分析。" src="/files/ftp_upload/54792/54792fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 
图2：哺乳动物异源蛋白表达概述。A. 杆状病毒（BacMam）系统生成及SERT在HEK293S GnTI-细胞中表达的示意图。B. 表达SERTCC的HEK293S GnTI-细胞（GFP荧光）。C. SERTCC在Strep亲和树脂上的洗脱曲线。绿色曲线表示去硫生物素的浓度，0 - 100%（0 - 5 mM）。D. 亲和纯化的SERTCC在4 - 15% SDS-PAGE凝胶中的分析结果。E. 通过GFP荧光检测的亲和纯化SERTCC的FSEC分析（激发波长：480 nm；发射波长：510 nm）。在15 mL处洗脱的峰为SERT（#），18 mL处为游离GFP（*）。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="脂质体重组、SERT插入、免疫过程；色谱图、凝胶电泳、荧光图谱。" src="/files/ftp_upload/54792/54792fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3：SERTIC 的代表性亲和纯化与重组结果。A. 抗体生成的示意图。B. SERTIC 在Strep亲和树脂上进行亲和纯化时在280 nm处观察到的洗脱曲线。绿色曲线表示脱硫生物素的浓度，0 - 100%（0 - 5 mM）。C. 对亲和纯化并重组后的SERT进行4 - 15% SDS-PAGE凝胶分析。D. 重组后溶解态SERT的荧光尺寸排阻色谱（FSEC）结果。使用色氨酸残基的荧光检测SERT（激发波长：280 nm；发射波长：335 nm）。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="Western blot 和层析图谱；蛋白质分析；荧光强度与体积关系；SERT 检测。" src="/files/ftp_upload/54792/54792fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 4"> 
图 4：代表性 SERT 抗体的分析。A. 通过 Western blot 筛选抗体。将约 1 µg 带或不带 GFP 的 SERTCC 蛋白上样至 4 - 15% SDS-PAGE 凝胶，电泳后转至硝酸纤维素膜。使用与 IR Dye 偶联的山羊抗小鼠抗体检测结合信号。2G4 和 10F2 在 Western blot 中呈阳性。 B. 抗体与 100 nM GFP 标记的 SERT 结合，通过 GFP 荧光检测的 FSEC 分析结果。 C. 所选 Fab 片段在 1 mM 5-羟色胺存在下与 100 nM GFP 标记的 SERT 的结合情况。 D. 8A11 或 15B8 Fab 与 SERT-8B6 Fab 的结合。在 18 mL 处洗脱的小峰为游离的 GFP。 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="蛋白纯化结果的SDS-PAGE凝胶、层析图谱和荧光分析。" src="/files/ftp_upload/54792/54792fig5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图5"> 
图5：Sf9细胞中8B6 Fab的代表性纯化结果。A. 通过His标签亲和层析纯化8B6 Fab时在280 nm处测得的洗脱曲线。绿色曲线表示咪唑浓度，0 - 50%（0 - 250 mM）。B. His标签亲和纯化后的非还原性和还原性SDS-PAGE凝胶。在约50 kDa处迁移的蛋白为非还原型Fab（#），在25 kDa处的次要条带为还原型Fab（*）。C. 通过阳离子交换层析纯化8B6 Fab时在280 nm处测得的洗脱曲线，显示在线性氯化钠梯度下洗脱出单一的对称峰。绿色曲线表示NaCl浓度，0 - 100%（0 - 500 mM）。D. 经阳离子交换层析纯化后，8B6 Fab在12.5% SDS-PAGE凝胶中的分析结果。E. 使用GFP荧光检测8B6 Fab与10 nM GFP标记的SERT的结合情况。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="色谱结果；A：吸光度图；B：蛋白质凝胶；C：荧光图；SERT分析。" src="/files/ftp_upload/54792/54792fig6.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 6"> 
图6：在 S-西酞普兰存在下SERT-8B6复合物的代表性凝胶过滤色谱结果。A．纯化的SERT-8B6复合物的凝胶过滤洗脱曲线。在11.5 mL处洗脱的主峰为SERT-8B6复合物。15–17 mL处的峰含有GFP和Fab片段。B．在4–15% SDS-PAGE凝胶上对纯化的SERT-8B6复合物进行分析。SERT以及Fab的重链和轻链位置以短划线标示。C．尺寸分离各组分的荧光检测色谱（FSEC）。使用色氨酸荧光检测SERT-8B6复合物。第17组分中含有较多未与Fab形成复合物的SERT。 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="蛋白质结晶与X射线衍射结果；显微镜图像中的晶体，衍射图谱" src="/files/ftp_upload/54792/54792fig7.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图7"> 
图7：与SERT-8B6复合物结合的结晶 S西酞普兰 A. 生长两周后SERT-8B6复合物的平行六面体晶体的光学显微镜图像。比例尺等于 200 µm. BSERT-8B6 晶体可将X射线衍射至3.15 Å。蓝色环代表3.15 Å。 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig7large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
表1：SERT-8B6复合物与S-西酞普兰结合状态的结晶筛选条件。 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792table1.xlsx">请点击此处下载该表格。</a>

本文描述了如何筛选热稳定突变体、纯化人源5-羟色胺转运蛋白、制备高亲和力抗体，以及对结合抗抑郁药物 S-西酞普兰的5-羟色胺转运蛋白-抗体复合物进行结晶。该方案可适用于其他难以研究的膜转运蛋白、受体和通道蛋白的研究。

人5-羟色胺转运蛋白与配体结合的热稳定化、表达、纯化及结晶 S西酞普兰

5-羟色胺转运体是一种依赖钠离子和氯离子的转运蛋白，可将细胞外的5-羟色胺“泵入”细胞内。S-艾司西酞普兰是一种药物……

本实验的总体目标是获得一种具有足够稳定性的转运蛋白，以用于结构研究，并利用这种经过改造的转运蛋白生长出可用于高分辨率X射线晶体学分析的晶体。该方法可解答结构生物学领域中的关键问题，例如如何解析作为重要药物靶点的膜蛋白的结构。该技术的主要优势在于，可通过功能测定方法从药物结合构象中进行筛选。尽管该方法可用于研究神经递质转运蛋白，但也适用于具有高亲和力结合小分子的受体、通道蛋白以及可溶性蛋白。用添加了10%胎牛血清的DMEM培养基将胰蛋白酶消化后的HEK293S GnTI缺陷细胞充分重悬，调整细胞密度至每毫升50万个细胞，并置于一次性移液管储液槽中。使用多通道移液器，向每孔预先包被多聚-D-赖氨酸的培养板中加入100 µL细胞悬液。每块培养板加样后，需在移液器储液槽中重悬细胞，以确保细胞分布均匀。将细胞置于37摄氏度、含8%二氧化碳的培养箱中孵育。在进行转反式激活实验前一小时更换细胞培养基。通过将每种待筛选的构建体与450纳克DNA和45微升无血清DMEM在cert TC背景下混合，制备DNA转激活试剂复合物。然后将1.6微升转激活试剂加入45微升无血清DMEM中并混匀。立即将稀释后的转激活试剂溶液加入DNA溶液中并混匀。切勿以相反顺序混合溶液。在将 20 微升转反式作用试剂 DNA 混合物加入其中四个孔之前，等待 10 至 15 分钟。在室温下，用 200 纳摩尔的西酞普兰和 25 微升 TBS 孵育细胞 5 分钟。为了溶解细胞，向样品中加入25微升含有8毫摩尔C12M、1毫摩尔CHS和蛋白酶抑制剂混合物的TBS溶液。在室温下孵育细胞1小时。然后向每种构建物的三个孔中各加入50微升TBS溶液，其中含有20纳摩尔氚标记的西酞普兰、0.1%牛血清白蛋白以及毫克/毫升的His标签亲和闪烁接近分析（SPA）珠。对于最后一个孔，加入相同的 TBS 溶液，但需补充 100 微摩尔的舍曲林，以确定非特异性结合。在将 His 标签亲和 SPA 珠加入 96 孔板时，确保充分混匀。使用 96 孔闪烁计数器在室温下测定氚标记西酞普兰的结合，每孔计数时间为一分钟。继续计数平板，直至总菌落数在约36小时后达到平台期。测量后，将平板置于加热块中，加盖预热的盖子，在33摄氏度下加热15分钟。加热后再次测量氚标记西酞普兰的结合量。修改加热步骤后重复上述操作。根据目标蛋白的表观熔解温度以及最稳定构建体的热稳定性调整加热温度。持续加热各孔板，直至所有构建体的特异性计数均降至较低水平。将HEK293S GnTI缺陷细胞在37°C、8%二氧化碳、85%湿度及130 RPM振荡条件下，用含2%胎牛血清的293表达培养基进行悬浮培养。以感染复数为2、细胞密度为每毫升300万个细胞的条件，用P2病毒感染10升上述细胞。感染后12至16小时，从1摩尔储备液中加入丁酸钠至终浓度为10毫摩尔。感染后48至60小时，以4,000 × g离心15分钟收集细胞，弃去上清液。用含2微摩尔艾司西酞普兰或其他SERT抑制剂的150毫升TBS重悬细胞。将10升培养物的细胞置于约30摄氏度的温水中，通过快速使用10毫升移液器反复吹打细胞，直至重悬均匀。将全部细胞转移至含搅拌子的烧杯中，在搅拌条件下加入全部去垢剂溶液。于4摄氏度下搅拌溶解细胞1小时。在4°C条件下，以8,000 × g离心裂解液15分钟。将上清液倾入洁净的超速离心管中，弃去沉淀。然后在超速离心机中以100,000 × g离心一小时。超速离心后，将上清液通过0.2微米滤器过滤，并弃去沉淀。接下来，使用蠕动泵将裂解液以洗脱缓冲液平衡的柱子加载至10毫升链霉亲和素亲和树脂中。然后将链霉亲和素亲和柱连接至快速蛋白液相色谱系统，并以每分钟2毫升流速用66毫升洗脱缓冲液洗涤柱子。使用 33 毫升缓冲液，以每分钟 0.5 毫升的速度，在相同的洗涤缓冲液中添加 5 毫摩尔脱硫生物素，洗脱纯化的蛋白质。收集每管 1 毫升的组分。主峰组分体积约为 10 毫升。为了形成转运蛋白-抗体复合物，首先在室温下用凝血酶消化纯化的蛋白过夜，以去除标签，并同时使用内切糖苷酶H（Endo H）进行去糖基化。使用截留分子量为100千道尔顿的离心式蛋白浓缩器，将蛋白浓缩至浓度为10毫克/毫升，体积为250至300微升。在总体积小于500微升的条件下，按1:1.2的摩尔比将浓缩后的SERT蛋白与8B6 Fab片段混合。将混合物在 100,000 × g 和 4 °C 条件下离心 20 分钟。离心后，收集含有 SERT Fab 复合物的上清液，弃去沉淀。通过尺寸排阻柱的快速蛋白液相色谱法分离该复合物。用添加物的 TBS 以每分钟 0.5 毫升的流速进行平衡。在结晶前，使用截留分子量为 100 千道尔顿的离心式蛋白浓缩器，将复合物分离所得的峰馏分浓缩至每毫升 2 毫克。在 280 纳米处吸光度为 2 AU 相当于每毫升 1 毫克。以每0.05个复合物对应1个游离Fab的比例加入额外的Fab。同时加入10 µM的游离S-西酞普兰。离心样品后，收集含有SERT-Fab复合物的上清液，并弃去沉淀。根据文本方案中的表一，在4摄氏度下设置一个悬滴24孔筛。将每种储液溶液各500微升移液至带有密封剂的低剖面24孔板的每个孔中。将1.5、1.75和2微升的SERT Fab复合物移液至18毫米硅化玻璃盖玻片上。然后将一微升储液加到蛋白质样品上方。大约三天内会出现单晶，14天后晶体生长至100至175微米。图中显示的是在含氚标记西酞普兰的条件下进行热稳定性筛选的代表性结果。熔解温度值与最大结合量的对应关系显示了具有高热稳定性和表达水平的突变体。图中展示了野生型 SERT TC 以及三个最佳突变体 Y110A、I291A 和 T439S 的热稳定性曲线。此显微镜图像显示表达 SERT CC 的 HEK293S GnTI 缺失细胞，细胞膜上可见绿色荧光。SERT CC 的荧光检测尺寸排阻色谱显示在 15 毫升处有一个主峰。SDS-PAGE 分析显示为单一蛋白质条带，基本无污染物。图中展示了通过尺寸排阻色谱分离转运蛋白抗体复合物的代表性结果。在11.5毫升处洗脱的主要峰含有SERT和Fab，这在SDS-PAGE凝胶上有所显示。生长两周后，通过光学显微镜观察到SERT抗体复合物与S-西酞普兰结合形成的棱柱状晶体，大小约为100至175微米。观看本视频后，您应能充分理解如何鉴定能够稳定配体结合构象下膜蛋白的突变，以及如何利用蛋白质-抗体复合物进行结晶筛选实验。在进行该实验操作时，重要的是要记住，配体对于 SERT TC 的稳定是必需的，并且对 SERT CC 的结晶至关重要。该技术的应用意义涉及精神类疾病的治疗，因为 SERT 是多种抗抑郁药物的分子靶点。在完成该操作后，可利用生物化学与生物物理方法对纯化的 SERT 功能进行表征。

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