Name: remtoe 控制系统在内源基因表达调控中的应用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: 学习利用增强型lac阻遏蛋白和tet激活蛋白系统，在活体动物或细胞中条件性调控内源基因表达的方法。该技术可实现基因表达水平的可逆调控，适用于疾病相关基因的功能研究。

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我们感谢已故的Heidi Scrable博士（梅奥诊所，美国明尼苏达州罗切斯特）慷慨赠送哺乳动物lacI基因构建体，感谢Daniel Louvard博士（法国巴黎居里研究所）提供Villin启动子，以及感谢Laurie Jackson-Grusby博士（美国马萨诸塞州波士顿儿童医院）在该技术开发早期阶段所做出的贡献。我们感谢Nancy Wu博士和Robert Maxson博士在构建转基因和基因敲除小鼠过程中提供的帮助。我们感谢Laird实验室成员给予的有益讨论与支持。本研究由美国国立卫生研究院资助［R01 CA75090、R01 DA030325、R01 CA157918 和 R01 CA212374 至 P.W.L.，以及 1F31CA213897-01A1 至 N.A.V.S］。

PWL 任职于 AnchorDx 和 Progenity, Inc. 的科学咨询委员会。

REMOTE-控制系统的关键步骤及潜在局限性在于，插入阻遏蛋白和/或激活蛋白结合位点时可能会影响目标基因的表达。我们最初针对 Dnmt1 基因所采用的阻遏策略，是在启动子的转录关键区域插入 lac 阻遏蛋白结合位点。为了降低影响启动子功能的风险，从而提高 REMOTE-控制系统的一般适用性，我们开发了一种基于内含子的阻遏策略。我们改进后的 lac 系统具有很强的阻遏能力，能够在转录起始位点下游数百至数千碱基对处的操纵子位置，有效抑制所有测试强启动子的转录（图3A–C）10。重要的是，阻遏水平与启动子的转录强度无关（图3A–C）10，这表明我们基于内含子的阻遏系统的阻遏能力超过了所测试启动子的转录强度。在这种基于内含子的策略中，阻遏作用很可能是通过转录延伸机器与lac阻遏蛋白之间的物理干扰介导的57。这种简单的阻遏机制以及基于内含子方法已证实的稳健性，使其可能广泛适用于不同的基因、组织和生物体。
远程控制系统对基因的上调作用需要转录激活因子结合序列位于目标基因启动子附近，这有可能影响启动子功能。然而，我们发现结合序列的位置可位于转录关键区域之外。两者 Dnmt1 和 EF1α 启动子被显著上调 四环素 位于转录起始位点上游几百个碱基处的操纵子10这种宽松的限制条件大大降低了在缺乏转录激活因子的情况下影响目标基因启动子功能的可能性。增加&#160;结合位点的数量增加和/或使用更强的转录激活因子可能有助于进一步降低风险，从而实现对远离转录起始位点的区域进行上调。
我们的 REMOTE-控制 系统能够优雅地调控内源基因表达的水平、时间和空间位置，从而可检验表型的可逆性以及不同表达水平所导致的生物学后果，而这些目标是目前现有的体内基因表达调控技术难以实现的。需要指出的是，在包括本研究在内的大多数基因表达分析中，表达值代表的是细胞群体的平均值，而该群体内部存在显著的异质性。这种异质性可能影响细胞命运决定过程，例如分化或凋亡58。尽管通过进一步的基因线路工程设计，基因表达调控的精确性有望进一步提高59，但本系统当前所展现的强大效能已足以在多种生物学背景下有效探究基因功能。此外，由于操纵子序列的复杂性以及调控元件来源物种与哺乳动物之间较大的进化距离，预期该系统具有高度的靶向特异性60。同时，还可针对任意内源基因构建并利用表达阻遏蛋白或激活蛋白的转基因小鼠品系。例如，现有的 tet 转录激活因子小鼠模型可被改造，以实现目标基因在特定小鼠组织中的上调表达。我们近期构建了一种转基因小鼠品系，通过将 lacIGY 基因插入 Hipp11 位点，并在 Lox-STOP-Lox 元件的控制下（未发表），结合现有的 Cre 小鼠品系，可在多种组织类型中驱动增强型 lac 阻遏蛋白的强效、组织特异性表达48。该品系将极大促进 REMOTE-控制 系统在组织特异性研究中的应用。
与现有的可诱导转基因方法相比，REMOTE-控制系统在基因上调方面具有多项优势。该方法利用内源性基因座，无需构建多个转基因品系以检测插入位点的位置效应。此外，由于该方法可在原本即具有较强活性的启动子上进一步增强基因表达，因此特别适用于基础表达水平较高的基因上调；而传统的转基因模型则依赖于较弱的病毒最小启动子。最后，本方法在基因上调过程中可保留目标基因的组织特异性、细胞周期调控以及剪接变异体等特征，因为它保留了天然的调控元件，例如内源性的cis-调控元件。随着CRISPR/Cas介导的基因靶向技术的发展，该技术将在多种模式系统中得到更广泛的应用。

基因敲除或转基因方法已被用于&#160;研究基因功能的有效手段。然而，这些方法对基因表达的调控是二元的（开/关）、非时间特异性的，因此无法揭示基因的全部功能谱。条件性Cre/LoxP 技术已实现基因功能的时空特异性失活或激活，但其二元特性仍存在局限性，例如导致细胞死亡和不可逆性1,2,3为了填补这一空白，已开发出使用条件性敲低方法的策略 四环素受调控的shRNA或miRNA4然而，脱靶效应仍然是RNAi面临的一个问题5 并且在体内难以控制. 近年来，CRISPR/Cas介导的转录调控技术为实现内源性基因表达的上调和下调提供了更为通用的方法，并已证明其应用价值6,7然而，CRISPR/Cas介导的转录调控在体内的有效性尚不明确，基于KRAB的抑制作用是否可逆仍有待观察，因为已有研究表明KRAB及其相互作用蛋白KAP1的强烈抑制可导致基因的永久性沉默8,9.
为了解决这些局限性，我们开发了一种新型转录调控系统，该系统利用经过改造的原核生物双组分转录调控系统，可在小鼠中以可逆且可调节的方式条件性地控制内源基因的表达10。含有调控配体的原核双组分转录调控系统（如lac和tet系统）已实现此类可逆且可调的表达控制11,12,13,14。然而，现有双组分系统抑制效力不足，限制了其在哺乳动物内源基因表达调控中的广泛应用。我们开发了一种增强型lac抑制系统，其抑制能力足以有效抑制内源基因，并采用了一种新策略，将tet转录激活因子直接靶向内源基因的对应启动子，从而实现强效的基因上调（图1）10。利用该技术，我们已在小鼠中实现了对内源Dnmt1基因近两个数量级的可调、可诱导且可逆的表达调控10。本文将以小鼠为模式生物，提供该技术在体内应用于其他基因和其他生物的逐步操作指南。
<img alt="图1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59235/59235fig1.jpg" /> 
图1: REMOTE-control 系统概述 内源性靶基因的转录可通过人工设计的 lac 阻遏蛋白和 四环素 激活系统。目标基因的启动子或内含子被改造以包含紧密结合的LacIGY阻遏蛋白的操作子，和/或 rtTA-M2 激活剂。R 表示 Repron复制表达抑制在)，其中包含12个对称的lac操纵序列（S）以及一段部分兔β-珠蛋白内含子。T表示 四环素 操作者。阻遏蛋白和/或激活蛋白由组织特异性启动子表达。通过给予IPTG（异丙基-β-硫代半乳糖苷），可逆地将目标基因的表达调节至所需的表达水平。 &#946;-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷（LacIGY阻遏物的拮抗剂）或强力霉素（Dox）。该图已根据Lee等人的研究修改。10 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59235/59235fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
在开始本方案之前，请查阅表1，以确定实现目标基因表达调控的相关步骤。例如，若要构建一只能够可逆性下调“Gene X”表达的小鼠，需完成以下方案中的第1、3和4部分。表1还总结了REMOTE控制系统所需的各个组分。
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>期望的表达变化</td>
			<td>仅抑制</td>
			<td>仅激活</td>
			<td>同时实现抑制和激活</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>相关实验步骤部分</td>
			<td>1, 3-4</td>
			<td>2-4</td>
			<td>1-4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>靶基因中所需的REMOTE-control序列</td>
			<td>Repron（“抑制内含子”；包含12个对称的lac操纵子序列及部分兔β-珠蛋白内含子）</td>
			<td>Tet操纵子序列</td>
			<td>Repron和Tet操纵子序列</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REMOTE-control序列的位置</td>
			<td>内含子</td>
			<td>启动子</td>
			<td>内含子 &amp; 启动子</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>实现期望调控所需的激活/抑制蛋白</td>
			<td>LacIGY抑制蛋白</td>
			<td>rtTA-M2激活蛋白</td>
			<td>LacIGY抑制蛋白和rtTA-M2激活蛋白</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>调控配体</td>
			<td>IPTG</td>
			<td>强力霉素</td>
			<td>IPTG和/或强力霉素</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1： REMOTE-control 组件概述。

<table><tbody><tr><td>B6C3F1/J</td><td>杰克逊实验室</td><td>100010</td><td>https://www.jax.org/strain/100010</td></tr><tr><td>Cas9蛋白</td><td>PNA Bio</td><td>CP04</td><td>http://www.pnabio.com/products/CRISPR_Cas9.htm?gclid=EAIaIQobChMIsoG8pLL33QIVBr7ACh0naQ4dEAAYAiAAEgKyHvD_BwE</td></tr><tr><td>CRISPOR</td><td>Haeussler 等，2016</td><td></td><td>http://crispor.tefor.net/</td></tr><tr><td>含多西环素的小鼠饮食</td><td>Envigo</td><td>因浓度而异</td><td>https://www.envigo.com/products-services/teklad/laboratory-animal-diets/custom-research/doxycycline-diets/</td></tr><tr><td>ENCODE 数据库</td><td>斯坦福大学</td><td></td><td>https://www.encodeproject.org/</td></tr><tr><td>iCre mRNA合成质粒（pBBI）</td><td>Addgene</td><td>65795</td><td>https://www.addgene.org/65795/</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>GoldBio</td><td>I2481C</td><td>https://www.goldbio.com/search?isSearch=Y&amp;amp;q=IPTG</td></tr><tr><td>pGL3-Basic</td><td>Promega</td><td>E1751</td><td>https://www.promega.com/products/reporter-assays-and-transfection/reporter-vectors-and-cell-lines/pgl3-luciferase-reporter-vectors/?catNum=E1751</td></tr><tr><td>SVM-BPfinder</td><td>调控基因组学，庞培法布拉大学</td><td></td><td>http://regulatorygenomics.upf.edu/Software/SVM_BP/</td></tr><tr><td>TiProD：组织特异性启动子数据库</td><td>生物信息学系，UMG，&amp;nbsp;中国台湾大学&amp;ouml;ttingen&amp;nbsp;</td><td></td><td>http://tiprod.bioinf.med.uni-goettingen.de</td></tr><tr><td>UCSC基因组浏览器</td><td>加利福尼亚大学圣克鲁兹分校</td><td></td><td>https://genome.ucsc.edu/</td></tr></tbody></table>

体内应用remote-控制系统调控内源性基因表达

In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

本文介绍了一种实现 REMOTE-控制系统（Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci，可逆性调控内源位点转录）的实验方案，该系统可在活体模型系统中对目标内源基因实现可逆且可调节的表达控制。REMOTE-控制系统结合了增强型 lac 抑制系统和 tet 激活系统，可在同一生物体系内实现对目标基因的下调或上调。通过抑制转录延伸，即使在转录起始位点下游较远位置灵活设置阻遏蛋白结合位点，也能实现严密的基因抑制。通过将 tet 转录激活因子靶向至相应的启动子区域，可显著增强内源基因的转录水平，实现强效上调。这种可逆且可调的表达控制可在生物体内反复施加和撤除。本系统所展示的强大功能与广泛适用性（如本文中对内源性 Dnmt1 基因的应用），将有助于更精确地开展体内功能研究，使研究人员能够在不同表达水平下探究基因功能，并验证表型变化的可逆性。

迄今为止，REMOTE-控制系统在两种不同策略中均展示了其抑制能力。第一种策略是在Dnmt1基因的内源性启动子区域插入lac阻遏蛋白结合位点。本方案推荐使用第二种策略，即将阻遏蛋白结合位点插入下游内含子中，以避免插入操作可能对启动子功能造成的影响，从而简化REMOTE-控制系统的应用。两种策略均实现了有效的基因抑制（图2A,B 和 图3A-C）10。采用基于启动子的策略时，Dnmt1的表达被抑制至未调控水平的15%（图2A）。这种强效抑制可通过给予不同剂量的IPTG处理小鼠而呈剂量依赖性地逆转（图2A）。通过免疫染色实验在蛋白质水平验证了所观察到的Dnmt1表达抑制效果（图2B）。我们未观察到Dnmt1+/+与Dnmt1LO/LO小鼠之间Dnmt1表达存在明显差异，证实了我们的lac&#160;操纵子插入并未破坏启动子的正常功能10。基于内含子的策略通过削弱转录延伸，在距转录起始位点数个千碱基下游的操纵子位置实现了超过90%的抑制效率（图3A, B）10。该基于内含子的策略还在另外七个强效启动子上得到了进一步验证（图3C）。在所有测试的启动子中均实现了稳定且强效的抑制。残余表达水平与启动子强度之间未观察到相关性，表明我们基于内含子的抑制系统的抑制能力超过了所测试的所有强效启动子的转录活性（图3C）。
REMOTE-控制系统的体内上调能力也在Dnmt1基因上得到验证。我们在Dnmt1基因启动子中引入了两份tet操纵序列，并同时加入lac操纵序列，从而可根据存在的效应蛋白实现基因表达的上调或下调。在携带修饰后内源性Dnmt1等位基因（Dnmt1LGT）的胚胎干细胞（ESCs）中，实现了对Dnmt1表达的显著上调和下调，变化幅度接近两个数量级（10%至650%）（图4A）10。两种调控均可逆，并分别通过IPTG和Dox处理实现诱导（图4A）。随后，我们将Dnmt1LGT修饰引入小鼠生殖系，以检测REMOTE-控制系统在体内的上调能力。在肝脏、脾脏和肾脏中均观察到Dnmt1的强烈上调，而在心脏中未检测到明显的上调（图4B）7。这种组织差异可能与Dnmt1基因表达的细胞周期依赖性模式以及心脏中增殖细胞数量稀少有关10,56。这一局限性是否能通过提高激活蛋白的表达水平或增加其结合位点数量来克服，仍有待进一步研究。
<img alt="图 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59235/59235fig2.jpg" /> 
图 2：LacIGY 抑制因子在体内对 Dnmt1 的抑制作用。（A）将含有插入 Dnmt1 启动子区的 lac 操纵序列（LO）且表达或不表达 LacIGY 的小鼠，用不同剂量的 IPTG 进行处理。通过 qRT-PCR 分析 Dnmt1 的表达水平，结果显示 IPTG 处理可剂量依赖性地逆转体内 Dnmt1 的抑制状态。每根柱状图代表来自不同小鼠的数据。数据以均值 ± 标准误表示（n = 3）。（B）给予小鼠饮用含或不含 160 mM IPTG 的水持续 3 周后，对其结肠隐窝中 Dnmt1 蛋白进行免疫染色检测。该图经 Lee 等人10 修改。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59235/59235fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="图3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59235/59235fig3.jpg" /> 
图3: 在体 以及REMOTE-control系统对多种启动子的体外抑制作用。 (A) 一种早期版本的Repron序列（R*）被插入到外显子下游的一个内含子中 Villin 启动子在一个 Villin-mKate2 转基因小鼠VilmKate2）。qRT-PCR 分析 mKate2 小鼠小肠中基因或蛋白的表达情况，无论是否存在特定条件或基因型 LacIGY 阻遏蛋白的表达情况如图所示。每根柱状图代表来自不同小鼠的数据。B) 小肠有无 mKate2 的共聚焦图像 LacIGY 表达。C在不同启动子与荧光素酶报告基因之间插入了六个对称的lac操纵序列（S）。将报告基因质粒（每孔50 ng，96孔板）与阻遏质粒以1:1的摩尔比瞬时转染入NIH/3T3细胞。转染24小时后检测荧光素酶活性。这些 体外数据表示荧光素酶表达的百分比 LacIGY表达非功能性蛋白的细胞相比，表达目标蛋白的细胞 LacI (NFlacI). t检验 用于确定统计学显著性。数据表示为均值 &#177; 扫描电子显微镜（SEM）n = 3). *P ≤ 0.05, **P ≤ 0.01。该图改编自 Lee 等人。10 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59235/59235fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="图 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59235/59235fig4.jpg" /> 
图 4：体外和体内Dnmt1表达的下调和/或上调。(A) 通过基因靶向和电穿孔方法，在培养的胚胎干细胞（ESCs）中构建了完整的REMOTE-控制体系。在无任何处理条件下，Dnmt1表达达到最大程度的抑制；而在IPTG和Dox处理下，则实现最大程度的激活。数据表示为均值 ± 标准误（n = 3）。*P ≤ 0.05，**P ≤ 0.01（Welch’s t-检验）。(B) REMOTE-控制系统在体内对Dnmt1的激活作用，通过REMOTE-控制小鼠多种组织中Dnmt1蛋白的免疫染色得以证实。LGT等位基因代表Dnmt1启动子经修饰后含有lac操纵子序列和tet激活因子结合位点。小鼠接受正常饮食或含Dox饮食（5000 mg/kg 盐酸多西环素）处理一个月。本图经Lee等10修改<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59235/59235fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本</a>
<img alt="补充图1" src="/files/ftp_upload/59235/59235supfig1.jpg" /> 
补充图1：着陆平台插入小鼠Dnmt1第一内含子的示例。（A）用于插入着陆平台的DNA模板示意图，改编自Quadros等（2015）31。异型loxP位点JT15和Lox2272之间由一段短的间隔序列（sp）分隔，并在两侧各带有60 bp与目标基因组区域同源的DNA序列。（B）将着陆平台插入Dnmt1内含子的示例DNA模板，所用sgRNA序列为：CTAGTACCACTCCTGTACCG（靶向反义链）。所选内含子区域由步骤1.1通过生物信息学分析确定，sgRNA序列使用CRISPOR29工具筛选获得。（C）用于检测着陆平台插入的PCR引物设计示例。PCR引物设计在模板同源臂之外，以确认着陆平台已整合至内源性Dnmt1基因座。野生型PCR扩增产物为213 bp；插入成功后扩增产物变为291 bp。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59235/59235supfig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本方案概述了构建一种模型系统所需的步骤，该系统可利用增强型lac阻遏蛋白和/或tet激活蛋白系统，在活体动物或细胞中条件性地调控目的内源基因的转录。

体内应用REMOTE-控制系统调控内源性基因表达

本文介绍了一种实施REMOTE-control系统（Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci，内源位点转录的可逆调控）的实验方案，该系统能够……

本方法的重要意义在于其多功能性和高效性。该方法使研究人员能够以稳健的方式调控内源性基因表达，而这种调控在以往使用现有方法时难以实现。它使研究人员能够在不同表达水平以及时空特异性条件下研究基因的功能。因此，该方法可用于检测表型的可逆性，在研究与疾病相关基因时具有重要意义。为实现基因抑制，将目标基因的内含子进行改造，使其包含含有12个对称Lac操纵序列的repron R元件。当LacIGY抑制蛋白在特定组织启动子驱动下表达时，目标基因即被抑制。通过添加IPTG（LacIGY阻遏蛋白的拮抗剂），可逆转或调节目标基因的抑制状态，使其表达水平达到预期。为了实现上调表达，目标基因的启动子被改造为包含四个或更多个Tat操纵元件（T），作为rtTA-M2激活蛋白的结合位点。当在多西环素存在的情况下，由特定组织启动子驱动表达激活蛋白时，即可诱导目标基因的上调表达。通过撤除或调整多西环素的浓度，可逆转或调节目标基因的上调表达至期望的表达水平。为了实现基因的抑制和激活，可将Lac阻遏系统与Tat激活系统结合使用。为了改造目的基因以实现抑制，应在目的基因的5'端附近鉴定出一个转录惰性的内含子，用于插入repron序列。为了获取目的基因的基因组序列，请访问 UCSC 基因组浏览器，在“基因组”选项卡下选择最新版本的小鼠基因组草图。在搜索栏中输入目的基因的名称或符号，以查看该基因的转录本，然后点击“go”。接着，选择所需的目的基因转录本变体，并点击该转录本变体旁的基因符号。接下来，在“序列及工具与数据库链接”横幅下方，点击基因组序列链接。在序列获取区域选项中，仅选择外显子、内含子以及每个基因对应的默认一条FASTA记录。在序列格式化选项中，选择将外显子显示为大写字母，其余部分为小写字母，并将重复序列用N掩蔽。然后，点击提交。最后，将该序列保存到可进行注释的文档或程序中，并保留其大小写格式。为避免CpG岛中断，请在UCSC基因组浏览器的“表达与调控”栏下选择显示CpG岛轨迹，然后点击刷新。放大五端内含子区域后，点击每个以绿色显示的CpG岛，并选择查看此特征的DNA序列。选择掩码重复至 N 后，点击获取 DNA 以获得 CpG 岛序列。最后，将这些序列与原始序列文件进行叠加，并将其注释为需要避免的内含子区域。为避免在目标组织中具有增强子特征的内含子区域，进入 ENCODE 数据库并选择实验图标。在选择检测类型时，选择 ChiP-seq 或 DNase-seq，并根据拟进行基因工程改造的细胞类型填写其他类别。完成特征选择后，点击最左侧的蓝色图示，此时将显示“以列表形式查看结果”。随后，选择与拟改造细胞最匹配的 h3k4 单甲基化、h3k27 乙酰化、DNase 1 和 CTCF 的数据集。在每个相关数据集中，滚动至文件部分，确认已选择 mm10 和 UCSC，然后点击可视化按钮。接着，在 UCSC 基因组浏览器中放大五端内含子区域，点击注释的峰轨道中的每一个峰。通过点击每个峰的染色体坐标，获取每个峰区域的 DNA 序列。在视图下拉菜单中，选择 DNA，然后单击“将重复序列屏蔽为 N”。最后，将这些序列与原始序列文件进行叠加，并将这些区域注释为需要避开的内含子区域。为了在剩余的内含子区域中鉴定出具有高特异性和高预测效率得分的 sgRNA，请访问您选择的在线 sgRNA 设计工具（例如 CRISPOR）。输入目标内含子区域的序列，指定相关的参考基因组，并选择所需的前间隔序列邻近基序（PAM）。然后，点击提交。接下来，根据预测的sgRNA特异性评分进行排序，并选择一个或多个同时具有较高预测效率评分的sgRNA。最后，设计一个DNA模板，其中包含两侧各带有60个碱基同源臂的PITT着陆平台序列，该同源臂对应于sgRNA的切割位点。为了逆转目标基因的抑制，将适量的IPTG完全溶解于无菌蒸馏水中，配制当日即用于给携带特定修饰等位基因的纯合子小鼠提供含IPTG的饮水。用铝箔包裹水瓶，并将IPTG水溶液置于避光瓶中，给予相应基因型小鼠及对照组小鼠饮用，持续至少一周。随后进行目标组织中目的基因表达水平的分析。为了诱导基因上调，需在饮食中给予多西环素持续一周，随后分析目标组织中目的基因的表达情况。qRT-PCR 分析显示，采用基于启动子的方法可使 DNMT1 表达水平抑制至未调控水平的 15%。通过以不同剂量的 IPTG 处理小鼠，该抑制作用呈剂量依赖性地得到逆转。通过免疫染色在蛋白质水平验证了DNMT1的抑制作用以及IPTG处理对DNMT1抑制作用的逆转。对mKate2表达的qRT-PCR分析显示，基于内含子的方法通过减弱转录延伸，在转录起始位点下游数个千碱基处的操纵子位置实现了超过90%的抑制。在有或无LacIGY阻遏蛋白的小鼠小肠中mKate2表达的共聚焦图像验证了基于内含子的方法。在含有经修饰的内源性 DNMT1 等位基因（带有 Tat 和 Lac 操纵序列）的胚胎干细胞中，实现了 DNMT1 表达的稳健上调和下调。两种调控均可通过 IPTG 和 Dox 处理完全逆转并诱导。在肝脏、脾脏和肾脏中均观察到 DNMT1 的显著上调。然而，心脏中未观察到明显的上调现象，这提示DNMT1的细胞周期依赖性表达模式以及心脏中增殖细胞的稀少可能是导致该结果的原因。通过调控关键基因的表达来研究其在体内的功能，常常因致死效应而面临挑战。我们的方法使我们能够克服目标基因的致死表型，从而能够在体内研究其在肿瘤发生中的作用。同样，这项技术将有助于研究其他难以分析的重要基因。

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