CRISPR/Cas9 核糖核酸蛋白介导的精确基因编辑通过管电穿孔

安全有效地将Cas9元素传递到细胞中对于基于基因编辑的疗法至关重要。我们在这里展示的协议显示了朝这个方向提供的新方法。该协议采用一种新的电穿孔方法，称为管电穿孔。

这导致高细胞存活率以及基因编辑率。管电穿孔法是病毒、药物，记者无浓缩。这些在临床应用中是首选，因此使用基于基因编辑的疗法。

该方法普遍适用于许多细胞类型。例如，人类造血细胞、原生T细胞和其他细胞都可以使用我们的方法进行编辑。这种管电穿孔方法使用薄管。

如果您是第一次使用，您可以尝试GP表达质粒DNA。演示这个程序的将是我实验室的博士后马林元。要开始此过程，请从美国类型文化收藏获取人类 iPSC。

在37摄氏度的细胞培养箱中培养人工细胞外基质上的 iPSC，按照供应商的指示培养5%的二氧化碳。转染前两小时，用含有蛋白激酶抑制剂Y-27632的10微摩尔罗相关盘绕处理 iPSCs。转染时，将具有细胞分离溶液的 iPSC 分离到 37 摄氏度的单细胞中，使用 5 分钟。

然后计算单元格数。要建立兔子成纤维细胞培养，从兔子耳朵的尖端获得耳皮活检。用含有5%青霉素链霉素的DPBS冲洗组织两次。

将冲洗过的耳组织转移到新的六厘米组织培养盘中，将组织切成小块，每个大小各一毫米。加入几滴FBS，防止组织干燥。在此之后，将切碎的组织在10厘米的组织培养盘中，加入10毫升的培养基。

在37摄氏度下用5%的二氧化碳孵育细胞3至5天。电镀后三到五天使用 Trypsin-EDTA 在 37 摄氏度下消化细胞两分钟，然后计算细胞数量。在设计和合成gRNA和供体寡分后，准备前面描述的细胞。

在20微升电穿孔缓冲液中再填充2万至3万个细胞。小心地上下移液，产生单个细胞悬浮液。对于Cas9 RNP转染，在室温下将两微克Cas9 NLS蛋白与0.67微克的gRNA预混合10至15分钟。

将形成的 RNP 复合物与两微克的 ssODN 与细胞轻轻地混合。使用电穿孔套件中的通用移液器尖端，将细胞混合物转移到 20 微升电穿孔管中。将电穿孔管放入电穿孔器的插槽中，然后按压完成。

电穿孔器显示屏上的脉冲报告指示了成功的电穿孔循环。电穿孔后，将人类 iPS 细胞转移到一毫升预加热的 Y-27632，其中包含前面所述的培养介质。然后在12井细胞培养板的一个井中将重新暂停的细胞进行盘。

继续培养板材，确保每天改变文化媒介。Y-27632在电穿孔后24小时从人类 iPSC 培养介质中去除。电穿孔72小时后，收获细胞。

对于兔子成纤维细胞，使用 Trypsin-EDTA 消化培养板中的细胞。对于人类 iPSC 使用细胞分离解决方案来消化培养板中的细胞。以 1000 rpm 的速度短暂离心样品 5 分钟，然后用 350 毫升的解解缓冲液重新向电池重新暂停。

在55摄氏度下孵育过夜。第二天使用标准程序提取含有苯酚-氯仿的基因组DNA。使用凝胶提取试剂盒或直接使用 PCR SV 迷你试剂盒从 PCR 产品中放大 100 到 200 个 DNA 片段碱基对。

要通过细菌菌落测序确定基因编辑效率，请使用 TOPO-TA 克隆试剂盒将纯化 PCR 产品放入 PCR4-TOPO 载体中。使用 TOPO-TA 克隆试剂盒提供的通用测序底转器随机拾取细菌克隆并测序插入物。要通过深度测序确定基因编辑效率，请将以前获得的纯化 PCR 产品发送给 DNA 测序核心的 CRISPR 安培康测序。

在这项研究中，一种管电穿孔法被有效地用于向兔子和人类细胞提供CRISPR/Cas9 RNP和sSODN，从而产生健壮、精确的基因编辑。首先，在IL2RG基因中产生C231Y和Q235X突变，在兔成纤维细胞的SPR基因中产生R150G突变。此处显示了由细菌 TA 克隆确定的特定 sgRNA 设计和基因编辑速率。

IL2RG C231位点，在28个克隆中，一个携带精确的C231Y突变，四个携带插入或删除突变，其余23个是野生型的。在IL2RG Q235位点，在27个测序的克隆中，两个携带精确的Q235X突变，三个携带一个内德尔突变，其余为野生型。在SPG R150位点，在20个克隆中，有5个带有精确的R150基因突变，10个携带内德尔突变，其余为野生型。

然后，管电穿孔用于将Cas9 RNP和sSODN传递到人类 iPSC，并针对EGFR、Mybpc3和HBB基因中临床相关位点。在EGFR位点，15.68%的等位基因携带精确点突变，22.75%携带内德尔突变，其余61.57%为野生型。在 Mybpc3 位点， 37.92% 携带精确的四基对 TGAA 删除， 2.24% 携带内德尔突变， 其余 59.84% 为野生类型。

在HBB位点，11.5%携带精确的E6V突变，35.4%携带内德尔突变，其余65%为野生型。Cas9 RNP 是 Cas9 的首选形式，因为它与质粒 DNA 相比体积更小。管电穿孔是提供Cas9 RNP的有效方法。

我们特别感兴趣的是利用Cas9 RNP的管电穿孔在原发T细胞中用于汽车T应用。