Name: CRISPR/Cas9 核糖核酸蛋白介导的精确基因编辑通过管电穿孔 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: 了解CRISPR/Cas9核糖核蛋白介导的精确基因编辑技术，通过管电穿孔方法在人诱导多能干细胞和兔成纤维细胞中实现高效基因编辑。该方法无病毒、无药物，适用于临床应用。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本工作由美国国立卫生研究院（R21OD023194，授予JX）资助。本工作使用了密歇根大学医学中心转化科学与治疗学先进模型中心（CAMTraST）资助的核心服务。

所有动物的饲养、护理和使用程序均经密歇根大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）审查并批准。
1. 细胞准备
<ol>
	<li>从美国典型培养物保藏中心（ATCC）获取人诱导多能干细胞（iPSCs，ACS-1030）。按照供应商说明，将iPSCs在人工细胞外基质上，使用无饲养层细胞培养基（见材料表）于细胞培养箱中（37 °C，5% CO2）进行培养。
	<ol>
		<li>转染前2小时，用10 µM Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶（ROCK）抑制剂Y27632处理iPSCs（该抑制剂可减少解离后人hiPSCs的凋亡，提高其存活率和克隆效率，且不影响其多能性）。</li>
		<li>转染时，使用细胞解离液（见材料表）在37 °C下将iPSCs解离为单细胞，持续5分钟。计数细胞数量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>采用兔耳皮肤组织活检样本建立原代兔成纤维细胞培养体系，方法如前所述10。
	<ol>
		<li>从兔耳尖端获取一块0.5 cm × 0.5 cm的耳部皮肤活检组织。剃除耳组织表面的毛发。</li>
		<li>用含5%青霉素-链霉素的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）冲洗组织两次。将耳组织转移至新的6 cm组织培养皿中，切成小块（约1.0 mm × 1.0 mm）。滴加数滴胎牛血清以防止组织干燥。</li>
		<li>将切碎的组织铺于10 cm组织培养皿中，加入10 mL培养基。兔成纤维细胞在含10%胎牛血清的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中培养。将培养皿置于细胞培养箱中（37 °C，5% CO2）。</li>
		<li>接种后3至5天，使用胰蛋白酶-EDTA在37 °C下消化细胞2分钟。计数细胞数量。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. gRNA 和供体寡核苷酸的设计与合成
<ol>
	<li>针对每个基因，使用在线工具（例如，&#60;http://crispor.tefor.net/&#62;）根据靶位点的序列设计向导RNA（gRNA）。</li>
	<li>粘贴目标DNA序列。</li>
	<li>选择基因组和原间隔序列邻近基序（PAM）。输入的DNA序列中可能的向导序列将在输出页面中显示。建议选择预测效率较高且脱靶效应较低的gRNA。</li>
	<li>通过商业供应商合成用于转录gRNA的DNA模板，并按照gRNA合成试剂盒的制造商说明进行体外转录。</li>
	<li>使用gRNA合成试剂盒中包含的RNA纯化微柱纯化gRNA。测定浓度后，将gRNA储存于-80 °C。</li>
	<li>为每个突变位点设计单链寡脱氧核苷酸（ssODN）供体模板。ssODN可由IDT等商业供应商合成。通常，每个ssODN长度为120–160个核苷酸（nt），包含60–80 nt的左侧同源臂和60–80 nt的右侧同源臂。为防止编辑后的DNA被再次切割，应尽可能在ssODN中引入PAM区域的同义突变。CRISPR切割位点应尽可能靠近预期的基因组改变位置。</li>
</ol>
3. Cas9核糖核蛋白和ssODN的管式电穿孔
<ol>
	<li>按照第1节所述方法准备细胞。</li>
	<li>将2-3 × 105个细胞重悬于20 µL电穿孔缓冲液中。轻轻吹打混匀，制成单细胞悬液。</li>
	<li>进行Cas9 RNP转染时，室温（RT）下预先将2 µg Cas9-NLS蛋白与0.67 µg gRNA混合孵育10-15分钟。随后，将形成的RNP复合物与2 µg ssODN轻柔地与细胞混合。</li>
	<li>使用电穿孔试剂盒提供的通用适配移液器吸头，将细胞混合物转移至20 µL电穿孔管中。为获得更好的电穿孔效果，转移过程中应尽量避免产生气泡。</li>
	<li>将电穿孔管插入电穿孔仪的插槽中，按下&#34;Go&#34;键完成操作。请遵循制造商针对每种细胞类型推荐的参数设置。例如，对于人iPSCs和兔成纤维细胞，设定电压为420 V，脉冲时间为30 ms。电穿孔是否成功可通过电穿孔仪显示屏上的脉冲报告进行确认。</li>
	<li>电穿孔后，将人iPS细胞转移至1 mL含Y-27632的预温培养基中（培养基配方见细胞培养部分）。对于兔成纤维细胞，则转移至含10%胎牛血清的DMEM培养基中。</li>
	<li>将重悬的细胞接种至12孔细胞培养板的一个孔中。</li>
	<li>每天更换培养基。人iPSC培养基中的Y-27632在电穿孔后24小时移除。</li>
</ol>
4. 基因编辑事件的分析
<ol>
	<li>电穿孔后72小时收集细胞。使用胰蛋白酶-EDTA消化兔成纤维细胞，或使用细胞解离溶液消化人诱导多能干细胞。离心后，用350 mL裂解缓冲液（1 M Tris HCl、5 M NaCl、0.5 M EDTA；pH 8.0、10% SDS，每1 mL裂解缓冲液中加入20 µL的20 mg/mL蛋白酶K储备液）重悬细胞，并在55 °C下孵育过夜。</li>
	<li>采用标准操作程序，使用苯酚-氯仿提取基因组DNA。</li>
	<li>使用高保真DNA聚合酶扩增包含靶向区域的100–200 bp DNA片段，然后使用凝胶回收试剂盒从凝胶中纯化DNA片段，或使用PCR SV mini试剂盒直接从PCR产物中纯化。</li>
	<li>为通过细菌菌落测序确定基因编辑效率，使用TOPO TA克隆试剂盒将纯化的PCR产物连接至pCR4-TOPO载体中。随机挑选细菌克隆，使用TOPO TA克隆试剂盒提供的通用测序引物对插入片段进行测序。</li>
	<li>为通过深度测序确定基因编辑效率，将步骤4.3中获得的纯化PCR产物（约100–200 bp）送至DNA测序核心实验室进行CRISPR扩增子测序。</li>
</ol>

<ol><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2FCas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li>
<li>Mout, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Cytosolic+Delivery+of+CRISPR%2FCas9-Ribonucleoprotein+for+Efficient+Gene+Editing%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Direct Cytosolic Delivery of CRISPR/Cas9-Ribonucleoprotein for Efficient Gene Editing.</a> ACS Nano. 11 (3), 2452-2458 (2017).</li>
<li>Zuris, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cationic+lipid-mediated+delivery+of+proteins+enables+efficient+protein-based+genome+editing+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient protein-based genome editing in vitro and in vivo.</a> Nature Biotechnology. 33 (1), 73-80 (2015).</li>
<li>Miller, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-Viral+CRISPR%2FCas+Gene+Editing+In+Vitro+and+In+Vivo+Enabled+by+Synthetic+Nanoparticle+Co-Delivery+of+Cas9+mRNA+and+sgRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Non-Viral CRISPR/Cas Gene Editing In Vitro and In Vivo Enabled by Synthetic Nanoparticle Co-Delivery of Cas9 mRNA and sgRNA.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 56 (4), 1059-1063 (2017).</li>
<li>Finn, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Single+Administration+of+CRISPR%2FCas9+Lipid+Nanoparticles+Achieves+Robust+and+Persistent+In+Vivo+Genome+Editing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A Single Administration of CRISPR/Cas9 Lipid Nanoparticles Achieves Robust and Persistent In Vivo Genome Editing.</a> Cell Reports. 22 (9), 2227-2235 (2018).</li>
<li>Liang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+cell-targeted+delivery+of+CRISPR%2FCas9+by+aptamer-functionalized+lipopolymer+for+therapeutic+genome+editing+of+VEGFA+in+osteosarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Tumor cell-targeted delivery of CRISPR/Cas9 by aptamer-functionalized lipopolymer for therapeutic genome editing of VEGFA in osteosarcoma.</a> Biomaterials. 147, 68-85 (2017).</li>
<li>Luo, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage-Specific+in+Vivo+Gene+Editing+Using+Cationic+Lipid-Assisted+Polymeric+Nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Macrophage-Specific in Vivo Gene Editing Using Cationic Lipid-Assisted Polymeric Nanoparticles.</a> ACS Nano. 12 (2), 994-1005 (2018).</li>
<li>Wang, H. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonviral+gene+editing+via+CRISPR%2FCas9+delivery+by+membrane-disruptive+and+endosomolytic+helical+polypeptide%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Nonviral gene editing via CRISPR/Cas9 delivery by membrane-disruptive and endosomolytic helical polypeptide.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (19), 4903-4908 (2018).</li>
<li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+homology-directed+gene+editing+by+CRISPR%2FCas9+in+human+stem+and+primary+cells+using+tube+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Efficient homology-directed gene editing by CRISPR/Cas9 in human stem and primary cells using tube electroporation.</a> Scientific Reports. 8 (1), 11649(2018).</li>
<li>Du, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beneficial+effect+of+young+oocytes+for+rabbit+somatic+cell+nuclear+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Cloning+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Beneficial effect of young oocytes for rabbit somatic cell nuclear transfer.</a> Cloning Stem Cells. 11 (1), 131-140 (2009).</li>
<li>Allenspach, E., Rawlings, D. J., Scharenberg, A. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAllenspach%2C+E+%22GeneReviews%28R%29%22">GeneReviews(R)</a>. Adam, M. P., et al. , (1993).</li>
<li>Friedman, J., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFriedman%2C+J+%22GeneReviews%28R%29%22">GeneReviews(R)</a>. Adam, M. P., et al. , (1993).</li>
<li>Hidaka, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Most+T790M+mutations+are+present+on+the+same+EGFR+allele+as+activating+mutations+in+patients+with+non-small+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Lung+Cancer%22%5BJournal%5D)">Most T790M mutations are present on the same EGFR allele as activating mutations in patients with non-small cell lung cancer.</a> Lung Cancer. 108, 75-82 (2017).</li>
<li>Ma, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correction+of+a+pathogenic+gene+mutation+in+human+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Correction of a pathogenic gene mutation in human embryos.</a> Nature. 548 (7668), 413-419 (2017).</li>
<li>Vakulskas, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-fidelity+Cas9+mutant+delivered+as+a+ribonucleoprotein+complex+enables+efficient+gene+editing+in+human+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">A high-fidelity Cas9 mutant delivered as a ribonucleoprotein complex enables efficient gene editing in human hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Nature Medicine. 24 (8), 1216-1224 (2018).</li>
<li>Song, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+and+Pneumocystis+Infections+in+the+Lungs+of+Gene-Knockout+Rabbits+with+Severe+Combined+Immunodeficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Bacterial and Pneumocystis Infections in the Lungs of Gene-Knockout Rabbits with Severe Combined Immunodeficiency.</a> Frontiers in Immunology. 9, 429(2018).</li>
<li>Song, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+immunodeficient+rabbits+by+multiplex+embryo+transfer+and+multiplex+gene+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Production of immunodeficient rabbits by multiplex embryo transfer and multiplex gene targeting.</a> Scientific Reports. 7 (1), 12202(2017).</li>
</ol>

J. C. 供职于 Celetrix LLC，该公司为管式电穿孔仪的制造商。L. M.、L. J.、J. S.、D. Y.、J. Z.、Y. E. C. 和 J. X. 宣布无竞争利益冲突。

管式电穿孔法可有效将CRISPR/Cas9核糖核蛋白（RNP）和单链寡脱氧核苷酸（ssODN）递送至兔和人类细胞，实现高效且精确的基因编辑（PGE）。TE与传统电穿孔设备的主要区别在于使用了一种特殊设计的管状结构，其中两个电极分别位于管的顶部和底部，样品在完全装入后即密封并进行电穿孔（图1）。相比之下，传统比色皿的电极位于两侧，且在电穿孔过程中样品未完全密封。这种新设计减少了气泡的产生并压缩了气泡的尺寸，从而改善了电场电压的均匀分布，最终降低了细胞死亡率并提高了转染效率9。在本研究中，针对人诱导多能干细胞（iPSCs）中的EGFR、Mybpc3和HBB基因，实现了较高的精确基因编辑率（15%–37%）。这些结果与先前在人类干细胞中实现高精确基因编辑率的报道一致9。
在兔细胞中靶向了IL2RG和SPR基因的致病性突变。近期已成功构建IL2RG基因敲除兔，作为人类X连锁严重联合免疫缺陷症（SCID-X1）的模型16,17。本研究显示，可在兔细胞中高效产生患者来源的IL2RG突变（例如C231Y和Q235X），证明了构建携带患者突变的SCID-X1兔模型的可行性。同时证明，SPR基因R150G突变也可在兔细胞中高效构建。该突变可导致儿童出现运动和认知功能障碍12。一旦成功建立，这些携带IL2RG和SPR突变的兔模型可作为转化医学研究中宝贵的临床前模型，并可用于开发基于基因编辑的单基因病治疗策略。
CRISPR/Cas9介导的基因编辑应用的一个关注点是脱靶编辑事件。本研究中使用的sgRNA在预测的主要脱靶位点处的插入缺失（indel）率，采用先前描述的方法进行了分析9（见表S1）。总共分析了sg-rb-IL2RG-01的7个潜在主要脱靶位点、sg-rb-SPR的5个、sg-hEGFR的7个、sg-hMybpc3的5个以及sg-hHBB的7个脱靶位点，所用引物列于表S2中。T7E1检测未发现任何脱靶插入缺失（图S1），表明使用这些sgRNA进行CRISPR/Cas9介导的基因编辑具有极低的脱靶风险。这也说明管式电穿孔方法本身不会引起或增加脱靶编辑。然而，仍应致力于减少或消除不必要的脱靶编辑。对于拟用于临床应用的细胞，可能需要通过全基因组测序来排除此类事件。
在技术层面，以下因素被认为是通过CRISPR/Cas9 RNP电穿孔实现高效精确基因组编辑的关键。首先，建议选择具有预测低脱靶效应的高效sgRNA。在将选定的sgRNA用于精确基因编辑（PEG）应用之前，必须验证其插入缺失（indel）效率。软件预测效果良好的sgRNA在验证步骤中失败的情况并不少见。
其次，为了实现较高的同源定向修复效率（PGE），建议在可能的情况下对单链寡核苷酸（ssODN）供体引入PAM突变。其原理在于，这样做可以防止CRISPR/Cas9在供体模板整合后再次切割。在某些情况下，PGE本身即可引入PAM突变；而在其他情况下，可以在PAM序列中引入沉默突变。如果无法实现PAM突变，则建议尽量在供体中引入多个对应于sgRNA序列的沉默突变。
第三，对于转染电穿孔（TE）而言，尤其需要注意的是，在将细胞和RNP混合物转移至电穿孔管时，应避免产生气泡。尽管电穿孔管的设计本身已尽可能减少气泡的形成，但谨慎操作可进一步降低甚至完全避免气泡的产生。针对在采用电穿孔管进行CRISPR/Cas9核糖核蛋白介导的精确基因编辑过程中可能遇到的常见问题，表2提供了相应的故障排除指南。
综上所述，本文证明了管式电穿孔是一种将CRISPR/Cas9核糖核蛋白复合物（RNP）和单链寡脱氧核苷酸（ssODNs）递送至哺乳动物细胞以实现高同源定向修复（PGE）效率的有效方法。这种新型的TE转染技术及其稳定的精确基因编辑效率，可能有助于推动基因编辑技术的应用发展。

CRISPR/Cas9 是基因编辑中最常用的可编程核酸酶。其作用机制依赖于单导向RNA（sgRNA）介导的靶序列识别，同时识别基因组中的靶序列和相邻的原间隔序列邻近基序（PAM）。Cas9核酸酶在PAM序列上游三个核苷酸的位置产生双链DNA断裂（DSB）1。这些DSB可通过易错的非同源末端连接（NHEJ）或同源定向修复（HDR）途径进行修复。为了通过HDR途径实现精确的基因编辑，通常需提供供体模板，其形式为质粒DNA（pDNA）或单链寡脱氧核苷酸（ssODN）。
CRISPR/Cas9 与 sgRNA 可通过三种形式递送至细胞：Cas9 蛋白与 gRNA 组成的核糖核蛋白（RNP）复合物2,3；Cas9 mRNA 与 sgRNA4,5；或包含必要启动子、驱动表达的 sgRNA 以及 Cas9 编码区的质粒 DNA（pDNA）6,7,8。许多研究团队已证实，当以 RNP 形式递送 CRISPR/Cas9 时，基因编辑效率通常优于 pDNA 或 mRNA 形式，这归因于 RNP 的尺寸远小于核酸分子9。此外，先前研究已表明，一种新型的试管电穿孔（TE）设备在多种细胞类型的基因编辑应用中尤为高效9。
本研究展示了一种利用转座电穿孔（TE）技术将CRISPR/Cas9核糖核蛋白（RNP）递送至多种哺乳动物细胞中多个临床相关位点的逐步操作方案。这种新型的TE转染技术及其高同源定向修复（HDR）效率现象，可能在生物医学研究中具有广泛的应用前景。

<table><tbody><tr><td>Accutase</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>792</td><td>人iPSC的细胞解离溶液，首次使用于步骤1.1.2。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Cas9 Nuclease 3NLS</td><td>IDT</td><td>1074182</td><td>Cas9蛋白，首次使用于步骤3.3。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher</td><td>11965092</td><td>用于细胞培养，首次使用于步骤1.2.3。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Thermo Fisher</td><td>1708075</td><td>用于制备细胞培养液，首次使用于步骤1.2.2。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Lonza</td><td>51201</td><td>用于配制裂解缓冲液，首次使用于步骤4.1。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Electroporation buffer</td><td>Celetrix</td><td>13&amp;ndash;0104</td><td>电穿孔缓冲液，首次使用于步骤3.2。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Electroporation tubes</td><td>Celetrix</td><td>20 &amp;mu;L: 12&amp;ndash;0107; 120 &amp;mu;L: 12&amp;ndash;0104</td><td>电穿孔管，首次使用于步骤3.4。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Electroporator</td><td>Celetrix</td><td>CTX-1500A LE</td><td>管式电穿孔仪，首次使用于步骤3.5</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>12003C</td><td>用于细胞培养，首次使用于步骤1.2.2。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Forma CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Incubators</td><td>Thermo Fisher</td><td>Model 370</td><td>用于细胞培养，首次使用于步骤1.1。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td>28115</td><td>用于凝胶纯化，首次使用于步骤4.3。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Human&amp;nbsp; induced pluripotent stem cells</td><td>American Type Culture Collection</td><td>ACS-1030</td><td>人iPSC，首次使用于步骤1.1。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Matrigel&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>人工细胞外基质；用于细胞培养板的预包被，首次使用于步骤1.1。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>mTeSR 1 medium&amp;nbsp;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>85850</td><td>无饲养层人iPSC培养基，首次使用于步骤1.1。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PCR SV mini</td><td>GeneAll</td><td>103-102</td><td>用于PCR产物纯化，首次使用于步骤4.3。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140163</td><td>用于制备细胞培养液，首次使用于步骤1.2.2。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Phenol-chloroform</td><td>Thermo Fisher</td><td>15593031</td><td>用于DNA提取，首次使用于步骤4.2。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Precision gRNA Synthesis Kit</td><td>Invitrogen</td><td>A29377</td><td>用于全长gRNA（向导RNA）的合成，首次使用于步骤2.4。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Proteinase K Solution</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM2548</td><td>用于DNA提取，首次使用于步骤4.1。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Q5 high-fidelity DNA polymerase</td><td>NEB</td><td>M0491</td><td>用于PCR扩增，首次使用于步骤4.3。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulfate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3771</td><td>用于配制裂解缓冲液，首次使用于步骤4.1。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>TA Cloning Kit&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>K457502</td><td>用于TA克隆测序，首次使用于步骤4.4。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Tissue Culture Dish (10 cm)</td><td>FALCON</td><td>353003</td><td>用于细胞培养，首次使用于步骤1.2.3。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Tissue Culture Dish (12 well)</td><td>FALCON</td><td>353043</td><td>用于细胞培养，首次使用于步骤3.7。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Tissue Culture Dish (6 cm)</td><td>FALCON</td><td>353004</td><td>用于细胞培养，首次使用于步骤1.2.2。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Tris HCl</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP1757-500</td><td>用于配制裂解缓冲液，首次使用于步骤4.1。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Thermo Fisher</td><td>25200056</td><td>用于细胞消化，首次使用于步骤1.2.4。</td></tr><tr><td>Universal Fit Pipette Tips&amp;nbsp;</td><td>Celetrix</td><td>14-0101</td><td>用于电穿孔，首次使用于步骤3.4。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Y27632</td><td>LC Labs</td><td>Y-5301</td><td>凋亡抑制剂，首次使用于步骤1.1.1。&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

通过电穿孔转染crispr/cas9核糖核蛋白实现精确基因编辑

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

以CRISPR相关蛋白9（Cas9）为代表的基因编辑核酸酶正成为生物医学研究中的主流工具。通过转染将CRISPR/Cas9元件成功递送至靶细胞，是实现高效基因编辑的前提条件。本实验方案表明，采用电穿孔管（TE）设备介导CRISPR/Cas9核糖核蛋白（RNP）与单链寡脱氧核苷酸（ssODN）供体模板共同递送至多种哺乳动物细胞，可实现高效且精确的基因编辑。首先，应用TE技术将CRISPR/Cas9 RNP与ssODN递送至兔成纤维细胞，以在白细胞介素2受体γ亚基（IL2RG）基因和蝶呤还原酶（SPR）基因中诱导致病性突变。经细菌TA克隆测序分析，获得3.57%–20%的精确突变率。随后，该策略被应用于人诱导多能干细胞（iPSCs），靶向多个临床相关基因，包括表皮生长因子受体（EGFR）、心肌肌球蛋白结合蛋白C（Mybpc3）以及血红蛋白β亚基（HBB）基因。深度测序（DeepSeq）结果显示，突变精确率稳定维持在较高水平（11.65%–37.92%）。本研究证明，采用电穿孔管递送CRISPR/Cas9 RNP是一种适用于哺乳动物细胞基因编辑的高效转染方案。

将 Cas9 RNP 和 ssODN 递送至兔成纤维细胞
TE介导Cas9核糖核蛋白递送至哺乳动物细胞的整体流程如图1所示。首先，在兔成纤维细胞中对IL2RG基因引入C231Y和Q235X突变，并在SPR基因中引入R150G突变。已知IL2RG和SPR基因的功能缺失突变分别会导致原发性免疫缺陷11和运动及认知功能障碍12。
特异的sgRNA设计如图2A所示。用于扩增靶向区域的引物列于表3中。ssODN序列见表1。基因编辑效率通过细菌TA克隆法测定（图2B）。在IL2RG C231位点，共测序28个克隆，其中1个（3.57%）携带精确的C231Y突变，4个（14.28%）携带插入或缺失（indel）突变，其余23个（82%）为野生型。在IL2RG Q235位点，共测序27个克隆，其中2个（7.41%）携带精确的Q235X突变，3个（11.11%）携带indel突变，其余为野生型。在SPG R150位点，共测序20个克隆，其中5个（25%）携带精确的R150G突变，10个（50%）携带indel突变，其余为野生型。
将 Cas9 RNP 和 ssODN 递送至人 iPSC
随后采用TE技术将Cas9核糖核蛋白复合物（RNP）和单链寡脱氧核苷酸（ssODNs）递送至人诱导多能干细胞（iPSCs），以靶向EGFR、Mybpc3和HBB基因中具有临床意义的位点。EGFR基因T790位点邻近区域的点突变可导致携带EGFR激活突变的非小细胞肺癌（NSCLC）患者对EGFR酪氨酸激酶抑制剂产生耐药性13。Mybpc3基因第16外显子的移码突变与肥厚型心肌病相关14。HBB基因的E6V点突变可引发镰状细胞病15。
特异的sgRNA设计如图3A所示。用于扩增靶向区域的引物列于表3中。ssODN序列见表1。基因编辑效率通过深度测序（DeepSeq）确定（图3B）。在EGFR位点，15.68%的等位基因携带精确的点突变（6,315条读长），22.75%携带插入缺失突变（9,162条读长），其余61.57%为野生型（24,797条读长）。在Mybpc3位点，37.92%携带精确的4个碱基TGAA缺失（11,654条读长），2.24%携带插入缺失突变（410条读长），其余59.84%为野生型（18,692条读长）。在HBB位点，11.65%携带精确的E6V突变（6,565条读长），23.35%携带插入缺失突变（13,163条读长），其余65%为野生型（36,644条读长）。
<img alt="通过Cas9核糖核蛋白进行细胞培养到基因编辑，采用离心管电穿孔；流程示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59512/59512fig1.jpg" data-altupdatedat="1762258740000" data-alt="图1"> 
图1：Cas9核糖核蛋白离心管电穿孔流程图。
<img alt="CRISPR基因编辑；DNA序列比对图；HDR与Indels对比；sgRNA结合位点。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59512/59512fig2.jpg" data-altupdatedat="1762258740000" data-alt="图2"> 
图2：兔成纤维细胞的基因编辑。（A）靶序列示意图。方框表示靶向位点，带下划线的字母对应gRNA序列，红色字母表示PAM序列。（B）基因编辑事件的TA克隆结果。方框表示精确突变的位点，所示的Indel序列为一种等位基因类型的代表，其他Indel序列未显示。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59512/59512fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="CRISPR 基因编辑比较；包含 EGFR、HBB、Mybpc3 修饰的序列比对图；HDR 和插入缺失结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59512/59512fig3.jpg" data-altupdatedat="1762258740000" data-alt="图 3"> 
图 3：人类诱导多能干细胞的基因编辑。（A）靶序列示意图。方框表示靶向位点。带下划线的字母对应 gRNA 序列。红色字母表示 PAM 序列。（B）基因编辑事件的深度测序结果。方框表示精确突变的位点。红色字母表示在供体模板中引入的同义突变。所示插入缺失序列仅代表一种等位基因类型，其他插入缺失序列未显示。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59512/59512fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>位点</td>
			<td colspan="8" rowspan="2">寡核苷酸序列 
				 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>（靶向突变）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit IL2RG (C231Y)</td>
			<td colspan="8">AGCGTGGATGGGCAGAAACTCTACACGTTCCGAGTCCGGAGCCGTTTTAACCCTTTGTATGGGAGTGCTCAGCATTGGAGT 
			GAATGGAGCCACCCGATCCACTGGGGGAGCAAAACTTCAAAGGGTAAAATGGGCCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit IL2RG (Q235X)</td>
			<td colspan="8">AGCGTGGATGGGCAGAAACTCTACACGTTCCGAGTCCGGAGCCGTTTTAACCCTTTGTGTGGGAGTGCTTAGCATTGGAGT 
			GAATGGAGCCACCCGATCCACTGGGGGAGCAAAACTTCAAAGGGTAAAATGGGCCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit SPR</td>
			<td colspan="8" rowspan="2">gacctccatgctctgcctgacctcctgcatcctgaaggcgtttcctgccagtcctggCctcagcgggactgtggtgaacatctcgtcgctgtgtgccctgcagcccttcaagggctggg 
			cgctgtac</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(R150G)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human EGFR</td>
			<td colspan="8" rowspan="2">ACGTGATGGCCAGCGTGGACAACCCCCACGTGTGCCGCCTGCTGGGCATCTGCCTCACCTCTACAGTCCAACTGATTACCC 
			AGCTCATGCCCTTCGGCTGCCTCCTGGACTATGTCCGGGAACACAAAGACAATATTGGCTCCCAGTAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>（T790附近点突变）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Mybpc3</td>
			<td colspan="8" rowspan="2">GCCCCCTGTGCTCATCACGCGCCCCTTGGAGGACCAGCTGGTGATGGTGGGGCAGCGGGTGGAGTTTGCGAGGTATCGGA 
			GGAGGGGGCGCAAGTCAAATGGTGAGTTCCAGAAGCACGGGGCATGGGTGTTGGGGGCAT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>（4-bp缺失）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human HBB </td>
			<td colspan="8" rowspan="2">TCTGACACAACTGTGTTCACTAGCAACCTCAAACAGACACCATGGTGCATCTGACTCCTGTGGAGAAGTCTGCAGTTACTGCC 
			CTGTGGGGCAAGGTGAACGTGGATGAAGTTGGTGGTGAGGCCCTGGGCAG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(E6V)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：ssODN序列。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>步骤</td>
			<td>问题</td>
			<td>可能的原因</td>
			<td>溶液</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.1</td>
			<td>低插入缺失率</td>
			<td>gRNA设计不佳，gRNA储存液 &gt;6 个月，低浓度向导 RNA</td>
			<td>重新设计向导RNA，制备/订购新的向导RNA。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.3</td>
			<td>PGE 效率低</td>
			<td>供体DNA设计不佳、向导RNA效率低下、供体DNA用量不当或DNA质量差</td>
			<td>增加同源臂长度，引入PAM突变，对供体DNA引入同义突变，使用更高效的引导RNA，优化Cas9蛋白与引导RNA的比例。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.4</td>
			<td>转染失败</td>
			<td>电转过程中将细胞-缓冲液混合物转移至电转管时产生气泡，电压/时长设置错误</td>
			<td>尽量避免气泡形成，调整电压/持续时间设置。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.6</td>
			<td>电穿孔后细胞存活率低</td>
			<td>人源单个iPS细胞存活率低</td>
			<td>电穿孔后添加ROCK抑制剂，增加细胞数量。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4.1</td>
			<td>PCR失败</td>
			<td>高GC含量或重复序列</td>
			<td>优化PCR条件，在PCR体系中加入DMSO。</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：常见问题的故障排除指南。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>引物名称</td>
			<td>序列</td>
			<td>备注</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rb-IL2RG-F</td>
			<td>CATGACAGTGACAGGGTCCC</td>
			<td rowspan="2">用于扩增兔 IL2RG DNA 片段</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rb-IL2RG-R</td>
			<td>TGCCAGAGACACAAGCGAAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rb-SPR-F</td>
			<td>GTACTTTGGAGGGACAGAGG</td>
			<td rowspan="2">用于扩增兔 SPR DNA 片段</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RB-SPR-R</td>
			<td>CTCAGCACCCTGACACTGGG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H-EGFR-F</td>
			<td>TGATGGCCAGCGTGGACAAC</td>
			<td rowspan="2">用于扩增人 EGFR DNA 片段</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H-EGFR-R</td>
			<td>ACCAGTTGAGCAGGTACTGGG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H-Mybpc3-F</td>
			<td>ATGCCCCGTGCTTCTGGAAC</td>
			<td rowspan="2">用于扩增人 Mybpc3 DNA 片段</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H-Mybpc3-R</td>
			<td>TCAGGGGAGCCAACCCTCAT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H-HBB-F</td>
			<td>TAACCTTGATACCAACCTGC</td>
			<td rowspan="2">用于扩增人 HBB DNA 片段</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H-HBB-R</td>
			<td>CATTTGCTTCTGACACAACT</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表3：步骤4.3中使用的引物。

本文介绍了一种利用电穿孔管对哺乳动物细胞进行高效CRISPR/Cas9核糖核蛋白介导的基因编辑的实验方案。

通过电穿孔转染CRISPR/Cas9核糖核蛋白实现精确基因编辑

以CRISPR相关蛋白9（Cas9）为代表的基因编辑核酸酶，正成为生物医学研究中的主流工具。成功递送……

安全有效地将Cas9元件递送至细胞内对于基于基因编辑的治疗至关重要。我们在此展示的方案为此方向提供了一种新颖的方法，该方法采用了一种名为管式电穿孔的新型电穿孔技术。这可以实现较高的细胞存活率以及基因编辑效率。该电穿孔方法无需使用病毒、药物以及报告基因富集步骤。这些优势使其在临床应用中更受青睐，尤其适用于基于基因编辑的治疗方案。该方法可普遍适用于多种细胞类型。例如，人类造血细胞、原代T细胞以及其他细胞均可使用我们的方法进行编辑。这种管式电穿孔方法采用一根细管。如果您是首次使用者，可以尝试使用表达GFP的质粒DNA。本实验操作将由我实验室的博士后Linyuan Ma进行演示。开始本实验前，请从美国模式培养物集存库（ATCC）获取人iPSCs。按照供应商的说明，在37摄氏度、5%二氧化碳的细胞培养箱中，将iPSCs接种于人工细胞外基质上，并使用无饲养层细胞培养基进行培养。转染前两小时，用10微摩尔Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶抑制剂Y-27632处理iPSCs。转染时，在37摄氏度下使用细胞解离溶液将iPSCs解离为单细胞，持续5分钟。然后计数细胞数量。为建立兔成纤维细胞培养，从兔耳尖端获取耳部皮肤活检组织。用含5%青霉素-链霉素的DPBS冲洗组织两次。将洗涤后的耳部组织转移至新的6厘米组织培养皿中，将组织切成小块，每块大小约为1毫米×1毫米。加入数滴胎牛血清（FBS）以防止组织干燥。随后，将剪碎的组织均匀铺展于10厘米组织培养皿中，并加入10毫升培养基。将细胞置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养三至五天。接种后三至五天，使用胰蛋白酶-EDTA在37摄氏度下消化细胞两分钟，随后计数细胞数量。在设计并合成gRNA和供体寡核苷酸后，按照前述方法准备细胞。将20至30,000个细胞重悬于20 µL电穿孔缓冲液中。轻轻吹打混匀，制成单细胞悬液。进行Cas9 RNP转染时，在室温下预先将2 µg带核定位信号（NLS）的Cas9蛋白与0.67 µg gRNA混合孵育10至15分钟。将形成的RNP复合物与两微克ssODN轻轻混匀后加入细胞中。使用电穿孔试剂盒中的通用移液器吸头，将细胞混合物转移至20微升电穿孔管中。将电穿孔管插入电穿孔仪的插槽中，按下“开始”按钮以完成操作。电穿孔成功完成的标志是电穿孔仪显示屏上的脉冲报告。电穿孔结束后，将人iPS细胞转移至1毫升预先温育的含Y-27632的培养基中，操作步骤如前所述。随后将重悬的细胞接种至12孔细胞培养板的一个孔中。继续培养该培养板，确保每天更换培养基。电穿孔后24小时，从人iPSC培养基中去除Y-27632。电穿孔后72小时，收集细胞。对于兔成纤维细胞，使用胰蛋白酶-EDTA 从培养板上消化细胞。对于人诱导多能干细胞（iPSCs），使用细胞解离液从培养板上消化细胞。将样品在1000 rpm下短暂离心5分钟，并用350毫升裂解缓冲液重悬细胞。在55摄氏度下孵育过夜。次日，采用标准方法用苯酚-氯仿抽提基因组DNA。使用凝胶回收试剂盒或PCR SV mini试剂盒，从凝胶中扩增100至200个碱基对的DNA片段，或直接从PCR产物中扩增。为了通过细菌菌落测序确定基因编辑效率，使用 TOPO-TA 克隆试剂盒将纯化的 PCR 产物连接至 PCR4-TOPO 载体中。随机挑选细菌克隆，并使用 TOPO-TA 克隆试剂盒提供的通用测序引物对插入片段进行测序。为了通过深度测序确定基因编辑效率，将先前获得的纯化 PCR 产物送至 DNA 测序核心 facility 进行 CRISPR 扩增子测序。本研究中，采用了一种高效的管式电穿孔方法，将CRISPR/Cas9核糖核蛋白（RNP）和单链寡脱氧核苷酸（ssODNs）递送至兔和人类细胞，实现了高效且精确的基因编辑。首先，在兔成纤维细胞中成功诱导了IL2RG基因的C231Y和Q235X突变，以及SPR基因的R150G突变。此处展示了特异性的sgRNA设计及通过细菌TA克隆测定的基因编辑效率。在已测序的28个克隆中，IL2RG C231位点有一个携带精确的C231Y突变，四个携带插入或缺失突变，其余23个为野生型。在已测序的27个克隆中，IL2RG Q235位点有两个携带精确的Q235X突变，三个携带插入缺失（indel）突变，其余为野生型。在已测序的20个克隆中，SPG R150位点有五个携带精确的R150基因突变，十个携带插入缺失（indel）突变，其余为野生型。随后采用管式电穿孔法将 Cas9 核糖核蛋白（RNP）和单链寡脱氧核苷酸（ssODN）递送至人诱导多能干细胞（iPSCs），以靶向 EGFR、Mybpc3 和 HBB 基因中具有临床相关性的位点。在 EGFR 位点，15.68% 的等位基因携带精确的点突变，22.75% 携带插入/缺失（indel）突变，其余 61.57% 为野生型。在 Mybpc3 位点，37.92% 的等位基因携带精确的四碱基对 TGAA 缺失，2.24% 携带插入/缺失突变，其余 59.84% 为野生型。在 HBB 基因座处，11.5% 携带精确的 E6V 突变，35.4% 携带插入缺失突变，其余 65% 为野生型。由于 Cas9 核糖核蛋白（RNP）的尺寸较质粒 DNA 更小，因此是递送 Cas9 的首选形式。试管电穿孔是一种有效的 Cas9 RNP 递送方法。我们特别感兴趣的是在CAR T细胞应用中，对原代T细胞使用Cas9核糖核蛋白的管式电穿孔技术。

crisprcas9-ribonucleoprotein-mediated-precise-gene-editing-tube

Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

CRISPR/Cas9 核糖核酸蛋白介导的精确基因编辑通过管电穿孔

本视频演示了使用 CRISPR-Cas9 技术在人 T 细胞中进行基因编辑的实验方法。将原代 CD4+ 和 CD8+ T 细胞与靶向特定基因以实现基因敲除的 CRISPR-Cas9 核糖核蛋白复合物混合。通过电穿孔后，sgRNA 引导 Cas9 至目标 DNA...

一种用于T细胞基因编辑的CRISPR-Cas9技术

本视频展示了一种利用Cas9核糖核蛋白介导对原代自然杀伤（NK）细胞进行基因修饰的技术。通过电穿孔将Cas9核糖核蛋白导入原代自然杀伤细胞，该核糖核蛋白由Cas9核酸内切酶与引导RNA（gRNA）结合而成，其中引导RNA通过CRISPR...

一种利用CRISPR Cas9对自然杀伤细胞进行基因编辑的技术

近年来，在体细胞系中进行基因操作的能力取得了显著进展，为基础研究和应用研究带来了巨大潜力。本文介绍了两种在哺乳动物细胞系中利用CRISPR/Cas9技术生成基因敲除并进行筛选的方法，一种使用可选择标记，另一种则不使用可选择标记。...

基于选择依赖性与非依赖性的CRISPR/Cas9介导的哺乳动物细胞基因敲除生成方法

关键词：CRISPR/Cas9，基因敲除，哺乳动物细胞，选择标记，非选择性筛选，基因编辑

利用预先组装的Cas9核糖核蛋白复合物（RNP）是一种实现精确、高效基因组编辑的有力方法。本文重点介绍该方法在多种细胞和生物体中的应用，包括原代人源细胞以及经典和新兴的模式生物。...

利用Cas9核糖核蛋白在多种细胞和生物体中实现增强的基因组编辑

本文介绍了一种利用CRISPR-Cas9核糖核蛋白和同源依赖性修复模板对秀丽隐杆线虫（C.

使用 CRISPR/Cas9 核糖核蛋白在 C. elegans 中快速简便地生成基因组点突变的流程

本文介绍了一种基于小分子 Shield-1...

一种利用条件性 Cas9 稳定化评估基因功能的新工具包

本实验方案的目的是利用组装的核糖核蛋白复合物以及 dpy-10 共CRISPR标记进行筛选，实现对 C. elegans 基因组的无缝CRISPR/Cas9编辑。该方案可用于在 C. elegans...

使用 dpy-10 共 CRISPR 筛选标记和组装的核糖核蛋白复合物对 C. elegans rbm-3.2 基因进行 CRISPR/Cas9 编辑。

本文介绍一种简单的方法，旨在高效产生名为“CRISPR RNP...

通过CRISPR显微注射对小鼠受精卵进行高效基因组编辑

THP-1细胞系被广泛用作研究人类单核细胞/巨噬细胞在各个生物学相关研究领域中功能的模型。本文介绍了一种高效的基于CRISPR-Cas9的基因编辑和单细胞克隆分离方案，可实现稳定且可重复的表型数据的获取。...

基于电穿孔的CRISPR-Cas9介导的THP-1细胞基因敲除及单细胞克隆分离

以RNA形式递送基因组编辑器是修饰原代哺乳动物细胞和细胞系基因组的一种特别有效的方法。本方案的目标是将基因组编辑器以mRNA形式递送至原代哺乳动物细胞和细胞系中，随后通过靶向Illumina测序与分析，定量编辑结果。...

通过电穿孔递送编辑器RNA在原代哺乳动物细胞中进行基因组编辑

了解CRISPR/Cas9核糖核蛋白介导的精确基因编辑技术，通过管电穿孔方法在人诱导多能干细胞和兔成纤维细胞中实现高效基因编辑。该方法无病毒、无药物，适用于临床应用。

通过电穿孔转染CRISPR/Cas9核糖核蛋白实现精确基因编辑

探索更多视频