通过双路西法酶检测系统构建CRISPR质粒和检测哺乳动物细胞的挖空效率
December 5th, 2020
在这里，我们提出了一个协议，描述了一个简化的方法，用于有效生成质粒，同时表达CRISPR酶和相关的单导RNA（sgRNA）。哺乳动物细胞与这种sgRNA/CRISPR载体的共转染，以及检查双链断裂修复的双荧光素酶报告器载体，可以评估敲除效率。
该协议描述了生成和优化高效 sgRNA 载体的关键步骤。我们对候选 sgRNA 的预加速针对相对时间和推论。该协议的主要优点是，它使得分析每个sgRNA的DNA编码印象，而无需编辑内源基因。
这种预选择方法也可以通过双链断裂应用于其他基因编辑措施。首先将冻干寡核苷酸稀释到双蒸馏水中的最终浓度为10微摩尔。在薄壁PCR管中以一比一的比例混合前进和反向寡核苷酸，无需添加任何额外的缓冲液。
在95摄氏度下孵育混合物5分钟，然后将温度降到72摄氏度10分钟。从 PCR 机器上去除寡核苷酸混合物，并允许它在室温下冷却。要消化pX330-xCas9载体，与Bbs1一起，将载体、酶和消化缓冲液在50微升体积中结合，并在37摄氏度下孵育反应两小时。
进行细胞转化后，从 LB 板中选择 5 到 10 个细菌菌落，并在 1.5 毫升管中使用 1 毫升 LB 培养基接种 1 毫升 LB 介质。然后在旋转摇床上孵育管子两到三个小时。执行 PCR 以筛选文本手稿中描述的重组质粒，然后在每厘米 10 伏以下的 2% Agarose 凝胶上运行产品。
识别阳性质粒后，使用它们以及记者向量共同感染适当的细胞系。要对细胞进行精使，请从培养的细胞中去除生长介质。用 PBS 轻轻清洗培养容器的表面，将 100 微升 PLB 放入每个培养井中，以完全覆盖细胞单层。
让板在室温下孵育20分钟，然后将落酸转移到管或小瓶中，以进行进一步处理或储存。要执行双荧光素酶测定，对亮度计进行编程，以提供两秒的预读延迟，然后进行 10 秒的测量周期。然后，将100微升荧光素测定试剂分配到适当数量的发光计管中。
小心地将20微升的细胞利沙酸盐加入发光计管中，通过移液混合两到三次。将管子放在发光计中并启动读数。从发光仪上拆下样品管。
加入100微升停止试剂和涡流短暂混合。将样品返回亮度计并开始读数。记录蕾妮拉路西法酶活动，与萤火虫路西法酶活动正常化，特别是屏幕上显示的比例的倒数。
完成后丢弃反应管。该方法用于为绵羊DKK2 Exon 1生成三个sgRNA载体。sgRNA 和 xCas9 表达载体是通过预先消化向量骨干，然后通过退火寡对将载体骨干连接成一系列短的双链 DNA 片段而构建的。
用特定的底基因对引导PCR对筛选了7个细菌菌落，并检测出阳性菌落。通过双荧光素酶测定同时检测出pX330-xCas9 T1、T2和T3的基因靶向能力。最后一个sgRNA载体显示最高的检测信号，随后用于绵羊基因编辑研究。
按照此协议，可以进行 T7EI 测定或核糖核酸酶测定。这些额外的措施给内源基因编辑更准确的印象。
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概述
本协议描述了一种简化的方法，用于生成表达CRISPR酶和相关单向导RNA（sgRNA）的质粒。它允许通过与双荧光素酶报告质粒载体的共转染来评估敲除效率。
关键研究组成部分
科学领域
- 基因编辑
- CRISPR技术
- 质粒构建
背景
- 高效生成sgRNA载体对于基因编辑至关重要。
- 该协议能够在不编辑内源基因的情况下分析DNA编码印象。
- 预选sgRNA目标可以提高编辑效率。
- 该方法可应用于各种基因编辑措施。
研究目的
- 提供生成高效sgRNA载体的协议。
- 促进分析sgRNA在基因编辑中的有效性。
- 简化评估敲除效率的过程。
使用的方法
- 将冻干寡核苷酸稀释至最终浓度为10微摩尔。
- 在PCR管中混合正向和反向寡核苷酸。
- 用sgRNA/CRISPR载体和报告载体共转染哺乳动物细胞。
- 评估双链断裂修复效率。
主要结果
- 该协议允许高效生成sgRNA载体。
- 可以有效评估敲除效率。
- 预选sgRNA目标增强了编辑过程。
- 该方法适用于其他基因编辑策略。
结论
- 该协议为生成sgRNA载体提供了一种可靠的方法。
- 它促进了不改变内源基因的基因编辑分析。
- 该方法可以适用于基因编辑的各种应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Efficient sgRNA vector construction and rapid knockout efficiency assessment are critical for accelerating CRISPR-based target validation in early discovery pipelines. The dual luciferase reporter system enables quantitative, pre-endogenous screening of candidate sgRNAs, reducing time and resource expenditure before full-scale gene editing. This workflow supports portfolio triage by prioritizing sgRNAs with the highest editing potential for downstream applications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables rapid preselection of sgRNAs with high editing efficiency before endogenous gene targeting.
- Supports functional target validation by quantifying double-strand break repair via reporter assays.
- Reduces mechanistic ambiguity by isolating sgRNA performance in a controlled system.
- Facilitates predictive confidence in CRISPR reagent selection for subsequent studies.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, quantitative readout for sgRNA activity using dual luciferase ratios.
- Improves assay reproducibility and comparability across candidate sgRNAs.
- Enables scalable screening of multiple sgRNA constructs in parallel.
- Prepares validated sgRNA/CRISPR vectors for downstream gene editing workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns sgRNA selection with translational goals by ensuring only high-efficiency reagents advance.
- Supports continuity from discovery to preclinical validation by minimizing failed edits in disease-relevant models.
- De-risks preclinical studies by front-loading sgRNA efficacy assessment.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates at the interface of early discovery and lead identification, enabling efficient sgRNA selection prior to endogenous gene editing and downstream functional studies.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway interrogation by enabling rapid sgRNA efficacy screening.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible luciferase-based outputs for sgRNA comparison.
- Analytics: Provides normalized dual luciferase ratios to objectively rank sgRNA performance.
- Translational Research: Ensures only validated, high-performing sgRNAs progress to disease-relevant or preclinical models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for sgRNA validation across multiple gene targets and projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic uncertainty in CRISPR reagent selection.
- Operational Value: Standardizes sgRNA screening and accelerates vector construction timelines.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital allocation by prioritizing high-efficiency sgRNAs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement and reduces late-stage failure due to ineffective gene editing.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, cell transfection, and luciferase assay execution.
- Needs access to PCR, gel electrophoresis, and luminometer instrumentation.
- Demands cross-team standardization of assay conditions and data normalization.
- Adaptable to various mammalian cell lines and gene targets with appropriate optimization.
- Dependent on accurate oligonucleotide design and vector preparation for reproducible results.
