BK-多瘤病毒非编码控制区域驱动转录活性通过流细胞测定的测量

该协议的总体目标是通过流式细胞测量双荧光细胞，测量BK-多病毒非编码控制区域驱动的转录活性。BK-多瘤病毒可导致免疫功能低下的患者出现严重疾病，尤其是肾移植接受者。然而，由于目前没有有效的杀毒软件，因此需要测量其他化合物的潜在抗病毒影响的方法。

这种方法允许病毒学家分析由非编码控制区域驱动的BK-多孔病毒转录活动的潜在抗病毒剂的影响。该分析进一步允许研究重新排列对启动子活动的影响，与典型的非编码控制区域相比。用双荧光报告研究病毒促进活动的好处是，可以相互独立地分析早期和晚期基因表达。

此外，由于只分析转染和荧光细胞，因此不需要对病毒储存的困难穿孔和长期感染细胞培养实验进行分析，还可以研究降低细胞生存能力和穿孔的药物。该协议遵循杜伊斯堡-埃森大学医学院伦理委员会批准的人类研究指南。第一步是收集血液样本，以分离多瘤病毒DNA。

在EDTA采集管中收集至少三毫升的血液。将样品在2，500G下离心15分钟，将等离子体移液到新管中。将40微升蛋白质SK放入1.5毫升微离心管中，通过移液加入400微升等离子体。

使用制造商说明中所述的 DNA 污点提取试剂盒分离 DNA。使用总体积为 50 微升的底向对 A 为 PCR 准备主组合，并使用先前分离的 DNA。将主混合物的 45 微升分配到 PCR 管中。

将分离的DNA的五微升加入PCR管中，并在反应条件下运行PCR，如表三所示。在 35 个周期内重复变性退火和延长。对于嵌套应用程序，请使用底像对 B，并包含用于克隆的限制站点。

将 PCR 产品的 10 微升与两个六折凝胶加载染料的微升混合。在 1.5% 的加糖凝胶上装载 10 微升混合物，并在 60 毫安培下运行凝胶 30 分钟。使用适当的紫外线记录系统可视化凝胶。

使用 PCR 纯化套件根据制造商的说明进行纯化 PCR 安普利。在37摄氏度下用指标限制酶消化纯化的安普利森两小时。重复净化步骤以净化消化的安普利孔。

同时，还消化质粒骨干。在0.8%的低安装加糖凝胶上分析消化的质粒骨干。请勿在高于 40 毫安的电流下运行凝胶。

使用长波紫外光可视化DNA片段，并使用干净的手术刀切割骨干弯曲。避免长时间的紫外线照射，防止DNA损伤。将一块浮糖凝胶碎片放入新的1.5毫升微离心管的围栏。

在65摄氏度下加热含有低模气糖片的骨干10分钟，以熔化凝胶片，每两分钟通过轻轻的涡流混合一次。熔化的凝胶可直接用于结扎。利盖特骨干和消化的安培康使用T4 DNA连接酶过夜在16摄氏度。

经过标准克隆程序，分离血浆DNA。执行限制性酶消化，检查阳性克隆，并在1%的阿加罗斯凝胶上可视化消化片段。种子100，000 HEK293T细胞每井12井板前24小时转染和孵育过夜在37摄氏度，保持活增殖在转染期间。

细胞在转染时应大约在80%的汇合。将250微升的减少血清介质放在无菌管中，并加入每组报告的血浆DNA一微克，通过移液轻轻混合。将转染试剂的三微升加入脱氧核糖核酸混合物中，通过移液和孵育在22摄氏度下轻轻混合15分钟。

加入混合物，滴到井中，轻轻分配到井中。四小时后，用含有测试剂和溶剂控制的新鲜介质更换上一液。在此示例中，使用了 mTOR 抑制剂 INK-128 和拉帕霉素。

在37摄氏度下孵育，直到分析。在荧光显微镜下检查细胞有红荧光和绿色荧光。红色和绿色荧光分别对应于早期和晚期BK-多病毒基因表达。

转染后 72 小时，精心向往上一道。用一毫升的冷PBS清洗细胞两次。轻轻加入500微升的试金，稍微转动板，避免细胞过早分离。

此步骤对于避免单元格双精度很重要。添加后，使用相同的移液器尖端直接去除三辛。在37摄氏度下孵育细胞至少5分钟。

用含有 3%FCS 的毫升 PBS 重新悬浮 trypsin S 细胞，并在预标记的 FACS 管中转移悬浮液。在 FACS 分析之前，以每毫升一微克的浓度添加 DAPI。使用流动细胞计分析细胞。

对于每个样本，测量至少10，000个活细胞。初始补偿对于区分红色和绿色信号以实现准确结果至关重要。使用嵌套 PCR 协议放大非编码控制摄政，该协议使用内部底像对进行放大，该底的是包含克隆限制站点的。

安培孔验证是通过阿加罗斯凝胶电泳进行的，而从典型的NCCR序列中派生的安培子在凝胶中具有同质大小分布，而从重新排列的NCCR中派生的带插入和删除的NCCR，其大小不同。通过限制分析验证了含有NCCR的正克隆的选择。小空间区域被指示正克隆的较大 NCCR 片段所取代。

从经过验证的克隆中分离出的质粒DNA被送去进行脱氧核糖。在此示例中，检测到 P 块中的删除和 O 块中的替换。HEK293T细胞在尊重可报告结构时瞬态转染，NCCR活性通过荧光显微镜进行监测。

红色荧光和绿色荧光分别对应于早期和晚期BK-多病毒基因表达。第一个NCCR显示强后期基因表达，而第二个例子具有相对强的早期但中度晚基因表达。DAPI 负细胞被封口，并创建了一个点图，显示 eGFP 与 tdTomato。

仅包含阴性样本以及 tdTomato 或 eGFP 阳性样本。平均荧光强度来自每个测试克隆。在此示例中，使用双 mTOR 抑制剂 INK128 的治疗显著减少了 tdTomato MFI，这意味着早期表达被抑制。

此方法允许通过转录活性识别当前使用的其他化合物来检测 BK-多瘤病毒。在早期的基因表达中，这决定了病毒的含意。在BK-多孔病毒重新激活的情况下，抑制滴可被视为免疫功能低下患者的剂。