通过流式细胞术测量BK多瘤病毒非编码调控区驱动的转录活性

本方案的总体目标是通过流式细胞术检测双荧光细胞，来测量BK多瘤病毒非编码调控区驱动的转录活性。BK多瘤病毒可在免疫功能低下患者中引起严重病理反应，尤其是在肾移植受者中。然而，由于目前尚无高效抗病毒药物，因此需要建立能够评估其他化合物潜在抗病毒作用的方法。

该方法可使病毒学家分析潜在抗病毒药物对BK多瘤病毒非编码调控区驱动的转录活性的影响。该检测方法还可用于研究与原型非编码调控区相比，基因重排对启动子活性的影响。利用双荧光报告系统研究病毒启动子活性的优势在于，可以相互独立地分析早期和晚期基因的表达。

此外，由于仅需分析转染后具有荧光的细胞，因此无需进行病毒储备液的难于操作的穿孔处理以及长期的感染性细胞培养实验，同时也可研究那些会降低细胞活力和导致穿孔的药物。本实验方案遵循经杜伊斯堡-埃森大学医学院伦理委员会批准的人类研究指南。第一步是采集血液样本以分离多瘤病毒DNA。

使用EDTA采血管收集至少三毫升血液。将样本在2,500 G下离心15分钟，用移液器将血浆转移至新管中。在1.5毫升微量离心管中加入40微升蛋白SK，并通过移液加入400微升血浆。

按照制造商说明书，使用DNA印迹提取试剂盒提取DNA。使用引物对A配制预PCR的总反应体系，体积为50微升，并加入先前提取的DNA。将45微升的主混合液分装至PCR管中。

将5 µL分离的DNA加入PCR管中，并按照表三所示的反应条件进行PCR扩增。变性、退火和延伸共循环35次。对于巢式应用，使用引物对B，其含有用于克隆的限制性酶切位点。

取10微升PCR产物与2微升6倍浓度的上样缓冲液混合。将10微升混合液上样至1.5%琼脂糖凝胶中，在60毫安条件下电泳30分钟。使用适当的紫外成像系统观察凝胶结果。

根据制造商说明书，使用PCR纯化试剂盒对PCR扩增产物进行纯化。将纯化后的扩增产物在37摄氏度下用指示性限制性内切酶消化两小时。重复纯化步骤，以纯化消化后的扩增产物。

同时，对质粒骨架进行酶切消化。将消化后的质粒骨架在0.8%低熔点琼脂糖凝胶上进行分析。电泳时电流不得超过40毫安。

使用长波紫外光观察DNA片段，并用洁净的手术刀切下骨架部分。避免长时间暴露于紫外光下，以防止DNA损伤。将凝胶片段转移至新的1.5毫升微量离心管中。

将含有低熔点琼脂糖的骨架片段在 65 摄氏度下加热 10 分钟，以融化凝胶，并每隔两分钟轻轻涡旋混匀一次。融化的凝胶可直接用于连接反应。使用 T4 DNA 连接酶在 16 摄氏度下过夜连接骨架片段与已消化的扩增产物。

经过标准的克隆步骤后，分离质粒DNA。进行限制性内切酶消化以检测阳性克隆，并在1%琼脂糖凝胶上观察消化后的片段。转染前24小时，将100,000个HEK293T细胞接种至12孔板的每个孔中，于37摄氏度培养过夜，确保转染期间细胞保持活跃增殖状态。

转染时，细胞应达到约80%的融合度。取250微升低血清培养基置于无菌离心管中，加入每种报告质粒DNA各1微克，用移液器轻轻吹打混匀。向DNA混合物中加入3微升转染试剂，用移液器轻轻吹打混匀，于22摄氏度孵育15分钟。

将混合物逐滴加入孔中，并轻轻混匀。四小时后，用含有待测试剂和溶剂对照的新鲜培养基替换上清液。本示例中使用了 mTOR 抑制剂 INK-128 和雷帕霉素。

在37摄氏度下孵育直至分析。在荧光显微镜下观察细胞的红色和绿色荧光。红色和绿色荧光分别对应BK多瘤病毒的早期和晚期基因表达。

转染后72小时，小心吸除上清液。用一毫升冷PBS洗涤细胞两次。轻柔加入500微升胰蛋白酶，并轻轻转动培养板，以避免细胞过早脱落。

此步骤对于避免细胞成对出现至关重要。加入后，使用同一移液枪头直接吸除胰蛋白酶。将细胞在37摄氏度下孵育至少五分钟。

用含有3% FCS的1毫升PBS重悬胰蛋白酶S细胞，并将悬液转移至预先标记的FACS管中。在进行FACS分析前，加入终浓度为1微克/毫升的DAPI。使用流式细胞仪分析细胞。

每个样本至少检测 10,000 个活细胞。初始补偿调节至关重要，可区分红色和绿色信号，以获得准确结果。非编码对照试剂采用嵌套 PCR 方案扩增，使用带有克隆所需限制性酶切位点的内侧引物对。

通过琼脂糖凝胶电泳进行扩增子验证。在凝胶中，来源于典型NCCR序列的扩增子呈现均一的大小分布，而来源于发生重排并带有插入和缺失的NCCR的扩增子则在大小上有所不同。通过限制性酶切分析验证含有NCCR的阳性克隆。阳性克隆表现为较小的间隔区域被较大的NCCR片段所取代。

将从已验证克隆中分离的质粒DNA送进行焦磷酸测序。在此示例中，检测到P区段的缺失和O区段的替换。将报告载体瞬时转染至HEK293T细胞，并通过荧光显微镜监测NCCR活性。

红色和绿色荧光分别对应BK多瘤病毒的早期和晚期基因表达。第一个NCCR表现出强烈的晚期基因表达，而第二个例子则表现出相对较强的早期基因表达和中等程度的晚期基因表达。对DAPI阴性细胞进行设门，并绘制eGFP与tdTomato的散点图。

分析中纳入了检测结果为阴性以及仅对 tdTomato 或 eGFP 呈阳性的样本。每个检测克隆的平均荧光强度均被记录。在此示例中，使用双mTOR抑制剂INK128处理显著降低了tdTomato的MFI，表明早期表达受到抑制。

该方法可用于通过转录活性检测当前使用及其他化合物以鉴定BK多瘤病毒。在早期基因表达中，这明确决定了病毒的参与程度。在BK多瘤病毒再激活的情况下，可考虑使用抑制性滴剂作为免疫功能低下患者的治疗试剂。