Name: 使用活细胞STED成像可视化神经元细胞模型中的线粒体内膜超微结构 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-30T14:25:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: 了解活细胞STED超分辨显微技术用于可视化神经元模型中线粒体内膜超微结构的方法。该技术可实时观测线粒体嵴动态变化，为研究细胞衰老与线粒体功能障碍提供重要工具。

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原代大鼠海马神经元由康涅狄格大学（美国康涅狄格州斯托尔斯）生物医学工程系的George Lykotrafitis博士和Shiju Gu提供。位于开放研究资源与设备中心先进光学显微镜平台的Abberior STED仪器由授予Christopher O'Connell的美国国立卫生研究院（NIH）资助项目S10OD023618购得。本研究由授予Nathan N. Alder的美国国立卫生研究院（NIH）资助项目R01AG065879资助。

Unveiling Mitochondrial Ultrastructure in Neurons Using STED Microscopy

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案介绍了利用人神经母细胞瘤细胞系 SH-SY5Y 和原代大鼠海马神经元，结合新型靶向线粒体内膜（IMM）的 PKMO 染料进行活细胞 STED 成像的方法。由于 PKMO 染料较新，目前尚无大量文献报道其用于活细胞 STED 成像。使用这些细胞类型进行 STED 成像存在挑战，尤其是神经元细胞的线粒体更为纤细。本方案的一个局限性在于所使用的 PKMO 染料可能对细胞具有毒性。不同细胞及细胞系对该染料的反应各异，因此可能需要调整染料浓度和孵育时间，以在获得强信号的同时避免损伤细胞。一种建议的解决方案是降低染料浓度并延长染色时间63；然而，这可能导致染色效果变差，且未必提高细胞存活率。
与PKMO类似，商用染料Live Orange mito（材料表）也表现出一定的细胞毒性。该染料已用于多种培养细胞，但在相同实验参数下，无法在RA诱导分化的SH-SY5Y细胞中实现与其未分化细胞相当的染色效果（我们未发表的观察结果）。然而，针对此探针和特定细胞类型，可能通过优化获得适宜的染色方案。使用该染料时，探测器门控时间设置为1-1.05至7-7.05 ns，其余参数与表1中保持一致。通常情况下，使用200-250 nM的Live Orange mito对细胞染色45分钟，可获得与本文所示PKMO结果相当的效果。较高浓度短时间染色，或较低浓度相同或略长时间染色，可能产生不同结果，可能更适用于其他细胞类型或培养条件。
成像原代大鼠海马神经元与永生化细胞有所不同，这是由于在成像时轴突和树突的投射特性以及线粒体分布存在差异。本实验步骤中的一个难点在于，接种密度决定了原代培养细胞能否良好贴壁和健康生长；而在较高密度下，到体外培养第10天（DIV 10）时，神经突起容易过度生长。因此，从这些原代神经元中所成像的线粒体很可能主要来自胞体而非突起部分；然而，起始细胞密度较低时若培养成功，则在较晚时间点可获得更佳的成像效果。关键在于尽量降低背景荧光和离焦光，以获得最适合受激辐射损耗显微技术（STED）的对比度。为解决细胞群体纯度问题，使用添加B27的神经元生长培养基培养原代海马神经元可抑制胶质细胞的生长，文献报道该方法可有效提高神经元纯度。 &#60;5%的细胞为星形胶质细胞，而在培养基中缺乏NbActiv1添加剂时，培养物中的星形胶质细胞数量减少至 &#60;2%87对于培养的 SH-SY5Y 细胞和原代大鼠海马神经元，用于细胞生长的 PDL 包被会在图像中产生背景雾状干扰。采用文中报告的设置可获得足够的信噪比。表1）且去卷积消除了大部分观察到的背景信号。
除了本文所述的成像方法外，还可在成像前或成像过程中对细胞施加处理或应激刺激。例如，加入tert-丁基过氧化氢（tBHP）可诱导氧化应激，从而可在添加后随时间监测线粒体的动态变化。加入带有荧光标记的淀粉样蛋白-β（Aβ），可实时监测该多肽相对于线粒体的分布及其对线粒体结构的影响。线粒体健康状况在阿尔茨海默病（AD）中具有重要作用，并被广泛认为参与了Aβ的毒性机制43,71,72。值得注意的是，SH-SY5Y细胞的分化状态会影响Aβ前体蛋白（AβPP）的定位85，因此涉及AβPP的实验需谨慎设计。
作为该方案可调整性的一个示例，本文展示了可在成像前15分钟将荧光标记变体Aβ(1-42)-HiLyte 647加入PKMO染色的细胞中（补充图1）。成像参数相似（补充表2），主要区别在于成像较窄的线粒体时需要更小的针孔。使用STED成像Aβ-HiLyte647时，所需的总激发激光功率（6%–8%）和STED耗尽激光功率（10%–12%）较低，且累积次数较少（六次）。探测器门控时间也从0.1 ns延长至10 ns。尽管对Aβ进行STED超分辨成像并非必需，但原始STED图像的整体信噪比和Aβ颗粒尺寸优于共聚焦图像，且后续还可进行去卷积处理。在将Aβ的STED原始图像或去卷积后的STED图像与PKMO染色的原始STED或去卷积STED图像合并时，采集STED图像并对Aβ的原始STED z轴层扫投影进行去卷积显得尤为有用（补充图1B,C）。两个通道均在同一帧步骤中采集。在施加应激处理或其他添加物后，可获得与图2所列类似、并在图5中适用的时间依赖性定位测量结果，以及线粒体嵴结构的差异。
本文未报道但已有其他研究报道的活细胞线粒体STED双标记其他可能方法包括使用SNAP标记蛋白93、Halo标记蛋白，以及使用针对通用靶点的其他细胞通透性染料，例如线粒体DNA（mtDNA）63。值得注意的是，SNAP和Halo标记的标记策略会影响成像时荧光信号的强度和持续时间94。此外，尽管本方案展示了可应用于分割后线粒体的多种分析示例，但软件工具包还可对这些图像执行大量其他类型的分析。

线粒体是一类起源于内共生的真核细胞器，负责调控多种关键的细胞过程，包括中间代谢和ATP生成、离子稳态、脂质生物合成以及程序性细胞死亡（凋亡）。这些细胞器具有复杂的拓扑结构，包含双层膜系统，从而形成多个亚区室1（图1A）。外线粒体膜（OMM）与细胞质接触，并建立直接的细胞器间连接2,3。内线粒体膜（IMM）是一种能量保存膜，通过维持离子梯度（主要以电膜电位（ΔΨm）形式储存），驱动ATP合成及其他需能过程4,5。IMM进一步分为内边界膜（IBM），其紧贴于OMM，以及由嵴膜（CM）包被的突出结构——线粒体嵴。该膜将最内层的基质区室与嵴内空间（ICS）和膜间隙（IMS）分隔开来。
线粒体具有动态的形态，其形态依赖于由动力蛋白超家族的机械酶所调控的持续且平衡的分裂与融合过程6。融合可增强线粒体之间的连接性并形成网状结构，而分裂则导致线粒体碎片化，并通过线粒体自噬（mitophagy）促进受损线粒体的清除7。线粒体的形态因组织类型8和发育阶段9而异，并受到调控以使细胞能够适应各种因素，包括能量需求10,11和应激刺激12。由于线粒体的标准形态学特征（如网络形成程度（相互连接或碎片化）、周长、面积、体积、长度（长宽比）、圆形度以及分支程度）的尺寸大于光的衍射极限（约200 nm），因此可通过标准光学显微镜进行测量和定量分析13。
嵴的结构决定了线粒体的内部构造（图1B）。嵴形态的多样性大致可分为扁平状（层状或盘状）和管泡状14。所有嵴均通过称为嵴连接（cristae junctions, CJs）的管状或狭缝样结构与内膜（IBM）相连，这些连接可将膜间隙（IMS）与嵴内腔（ICS）以及内膜（IBM）与嵴膜（CM）分隔开来，实现区室化15。嵴形态受内膜（IMM）上关键蛋白复合物的调控，包括：（1）定位于嵴连接处、稳定内膜-外膜（IMM-OMM）接触的线粒体接触位点与嵴组织系统（mitochondrial contact site and cristae organizing system, MICOS）16；（2）调控嵴重塑的视神经萎缩蛋白1（optic atrophy 1, OPA1）GTP酶17,18,19；以及（3）在嵴尖端（cristae tips, CTs）形成稳定寡聚结构的F1FO ATP合酶20,21。此外，内膜富含非双层磷脂，如磷脂酰乙醇胺和心磷脂，有助于稳定高度弯曲的内膜结构22。嵴还具有动态性，在不同代谢状态23,24、不同呼吸底物条件下25、饥饿和氧化应激状态下26,27、细胞凋亡过程中28,29以及衰老过程中30，均可观察到其形态的变化。最近研究表明，嵴可在数秒的时间尺度内发生显著的重塑事件，进一步凸显其动态特性31。嵴的多种特征可被量化，包括单个嵴内部结构的尺寸（如嵴连接宽度、嵴长度和宽度），以及描述单个嵴与其他结构关系的参数（如嵴间间距、嵴相对于外膜的入射角）32。这些可量化的嵴参数与功能呈直接相关性。例如，线粒体ATP的生成水平与嵴的丰度呈正相关，后者可通过嵴密度或归一化于某一结构特征的嵴数量（如单位外膜面积内的嵴数量）来量化33,34,35。由于内膜形态由纳米级结构特征决定，属于线粒体超微结构范畴，因此需要采用分辨率高于光衍射极限的成像技术。如下所述，此类技术包括电子显微镜和超分辨率显微镜（纳米显微技术）。
中枢神经系统（CNS）中的神经元和胶质细胞特别依赖线粒体功能。大脑平均仅占人体总重量的2%，却消耗了全身25%的葡萄糖，并占人体氧气消耗量的20%，因此极易受到能量代谢障碍的影响36。进行性神经退行性疾病（NDs），包括阿尔茨海默病（AD）、肌萎缩侧索硬化症（ALS）、亨廷顿病（HD）、多发性硬化症（MS）和帕金森病（PD），是迄今为止研究最为广泛的病理类型之一，相关研究涵盖从解析这些疾病的分子基础到探索潜在的治疗性预防和干预手段。NDs与氧化应激增加相关，部分原因来自线粒体电子传递链（ETC）产生的活性氧（ROS）37，同时也与线粒体钙离子调控异常38以及线粒体脂质代谢改变39有关。这些生理变化常伴随明显的线粒体形态缺陷，已在AD40,41,42,43,44、ALS45,46、HD47,48,49、MS50和PD51,52,53中被广泛报道。这些结构与功能缺陷之间可能存在复杂的因果关系。例如，由于嵴的形态有助于稳定氧化磷酸化（OXPHOS）酶复合体54，线粒体ROS不仅由ETC产生，还会进一步破坏ETC所处的结构基础，从而形成正反馈的ROS循环，增强对氧化损伤的易感性。此外，嵴的紊乱已被证实可触发线粒体DNA（mtDNA）释放以及与自身免疫性疾病、代谢性疾病和年龄相关疾病相关的炎症通路55。因此，&#160;对&#160;线粒体结构的分析对于全面理解NDs及其分子机制至关重要。
观察嵴的常用方法包括透射电子显微镜、电子断层扫描、冷冻电子断层扫描（cryo-ET）以及X射线断层扫描，尤其是冷冻软X射线断层扫描，这些技术已揭示了重要发现，并适用于多种类型的样本56,57,58,59,60。尽管近年来在细胞器超微结构的观测方面取得了进展，但这些方法仍存在局限性，即需要对样本进行固定，因此无法直接捕捉嵴的实时动态。超分辨率荧光显微镜，特别是结构光照明显微镜（SIM）、随机光学重建显微镜（STORM）、光激活定位显微镜（PALM）、膨胀显微镜（ExM）以及受激发射损耗（STED）显微镜，已成为观察需突破传统光学显微镜衍射极限分辨率结构的常用手段。当ExM与其他超分辨率技术联合使用时，结果令人印象深刻，但样本必须固定并染色于凝胶中61。相比之下，SIM、PALM/STORM和STED均已成功应用于活体样本，且近年来新出现的、通常靶向内膜（IMM）的染料为线粒体嵴动态的活体成像提供了新颖而简便的方法62,63,64,65,66。近期用于STED成像的活体染料在亮度和光稳定性方面有所提升，且相较于早期染料，其对内膜（IMM）的特异性靶向能力更高。这些进展使得长期时间序列和z轴层析的超分辨率成像实验成为可能，为线粒体超微结构与动态过程的活细胞分析开辟了新的前景。
本文介绍了利用STED显微技术对经PKmito Orange（PKMO）染料染色的未分化与分化SH-SY5Y细胞进行活细胞成像的实验方案63 提供的SH-SY5Y细胞系是亲本细胞系SK-N-SH经过三次亚克隆得到的衍生细胞系，该亲本细胞系源自转移性神经母细胞瘤的骨髓活检样本67,68,69,70该细胞系是常用的 体外 在神经退行性疾病（ND）研究中，特别是在阿尔茨海默病（AD）、亨廷顿病（HD）和帕金森病（PD）中，线粒体功能障碍被广泛认为具有重要作用的模型10,43,71,72,73通过调控培养基使SH-SY5Y细胞分化为具有神经元样表型的细胞，已被证实是一种适用于神经科学研究的模型，且无需依赖原代神经元细胞。10,74在本实验方案中，将视黄酸（RA）添加至细胞培养基中，以诱导 SH-SY5Y 细胞的分化。RA 是维生素 A 的衍生物，已被证实可调控细胞周期，并促进调控神经元分化的转录因子的表达。75还提供了一种培养分离自大鼠海马体的神经元并进行活细胞成像的实验方案。研究表明，海马体易受线粒体退化的影响，并与大脑皮层共同在衰老及神经退行性疾病中发挥重要作用。76,77,78,79,80.

<table><tbody><tr><td>0.05% 胰蛋白酶-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>0.4% 台盼蓝</td><td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>0.5% 胰蛋白酶-EDTA，无酚红</td><td>Gibco</td><td>15400054</td><td></td></tr><tr><td>100 X 抗生素-抗真菌剂</td><td>Gibco</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>100 X/1.40 UPlanSApo 油浸物镜</td><td>Olympus</td><td></td><td>配备于 Olympus IX83 显微镜，用于第 4 节所述的 STED 系统构建</td></tr><tr><td>全反式维甲酸</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>淀粉样蛋白-&amp;beta; (1-42, HiLyte Fluor647, 0.1 mg)</td><td>AnaSpec</td><td>AS-64161</td><td>可提供其他荧光偶联物</td></tr><tr><td>B27 添加剂（50 X），无血清</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>细胞计数仪（Countess II FL）</td><td>Life Technologies</td><td>AMQAF1000</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5804-R</td><td></td></tr><tr><td>计数载玻片</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td></td></tr><tr><td>锥形管（15 mL）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>比色皿（石英比色皿）</td><td>Starna Cells, Inc.</td><td>9-Q-10</td><td>与分光光度计联用，如第 1.3 节所述</td></tr><tr><td>DMEM（高糖含丙酮酸钠）</td><td>Gibco</td><td>11995073</td><td>用于第 1 节所述的 SH-SY5Y 细胞材料</td></tr><tr><td>DMEM（高糖不含丙酮酸钠）</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td>用于第 2 节所述的原代细胞材料</td></tr><tr><td>DMEM（无酚红）</td><td>Gibco</td><td>31053028</td><td>用于第 3 节所述的成像实验</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>牛胰脱氧核糖核酸酶 I</td><td>Sigma</td><td>DN25</td><td>用于第 2.2.1 和 2.2.2 节所述的原代细胞材料制备</td></tr><tr><td>DPBS（无钙、无镁）</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>E18 大鼠海马组织</td><td>Transnetyx Tissue</td><td>SDEHP</td><td></td></tr><tr><td>乙醇（200 证明）</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP28184</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS），未经热灭活</td><td>Gibco</td><td>26140079</td><td>用于第 1 节中的培养细胞</td></tr><tr><td>胎牛血清（经热灭活）</td><td>Gibco</td><td>10082147</td><td>用于第 2 节的原代细胞培养</td></tr><tr><td>滤膜除菌装置（0.1 &amp;micro;m，500 mL）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>5660010</td><td></td></tr><tr><td>FIJI（即 ImageJ）及可训练 Weka 分割（TWS）插件</td><td>--</td><td>--</td><td>免费开源图像分析软件，包含第 5 节所述的 Trainable Weka Segmentation 插件；TWS 插件来源见正文参考文献 90</td></tr><tr><td>GlutaMAX 添加剂（100 X）</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>用于第 2.1.2 节所述原代细胞材料的谷氨酰胺补充剂</td></tr><tr><td>Hausser Scientific Bright-Line 和 Hy-Lite 计数板</td><td>Hausser Scientific</td><td>267110</td><td></td></tr><tr><td>HBSS（无钙、无镁）</td><td>Gibco</td><td>14170120</td><td>用于第 2.2.1 和 2.2.2 节所述的原代细胞材料制备</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Huygens Professional 去卷积软件（V. 20.10）</td><td>Scientific Volume Imaging (SVI)</td><td>--</td><td>本实验方案中使用的去卷积软件，详见第 5 节</td></tr><tr><td>配备连续自动对焦功能的 IX83 倒置显微镜</td><td>Olympus</td><td>--</td><td>本文采用基于 Olympus IX83 倒置显微镜构建的 STED Infinity Line 系统，详见第 4 节</td></tr><tr><td>Lightbox 软件（V. 16.3.16118）</td><td>Abberior</td><td>--</td><td>用于 STED 图像采集的厂商软件，详见第 4 节</td></tr><tr><td>Live Orange Mito 染料</td><td>Abberior</td><td>LVORANGE-0146-30NMOL</td><td>活细胞成像中用于线粒体靶向的染料，详见讨论部分</td></tr><tr><td>Neurobasal 培养基</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td>用于第 2.1.2 节所述的原代细胞材料</td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek II 双孔腔室盖玻片</td><td>Nunc</td><td>155379</td><td>可购买多种规格腔室，但需确保盖玻片为 #1.5</td></tr><tr><td>巴斯德吸管（Fisherbrand）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22183632</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（10,000 U/mL）</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>PKmito Orange 染料</td><td>Spirochrome</td><td>SC053</td><td></td></tr><tr><td>聚-D-赖氨酸</td><td>Gibco</td><td>A3890401</td><td></td></tr><tr><td>SH-SY5Y 细胞系</td><td>ATCC</td><td>CRL2266</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠（100 mM）</td><td>Gibco</td><td>11360070</td><td>用于第 2 节所述的原代细胞材料</td></tr><tr><td>分光光度计（GENESYS 180 UV-Vis）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>840309000</td><td></td></tr><tr><td>STED Expert Line 显微镜</td><td>Abberior</td><td>--</td><td>STED 系统可定制，但在采购时该仪器属于 Abberior&amp;rsquo;s Expert Line 系列；系统简要描述见实验方案第 4 节</td></tr><tr><td>T25 培养瓶（经组织培养处理，带滤膜瓶盖）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>156367</td><td>其他培养容器和规格亦可选用</td></tr></tbody></table>

利用活细胞sted成像技术可视化神经元细胞模型中线粒体内膜的超微结构

Using Live Cell STED Imaging to Visualize Mitochondrial Inner Membrane Ultrastructure in Neuronal Cell Models

线粒体在细胞中发挥多种重要功能，包括能量生成、钙离子调节、细胞凋亡调控以及活性氧的产生。2+ 稳态、脂质生物合成以及活性氧（ROS）的产生。这些线粒体介导的过程在神经元中具有特殊功能，通过协调有氧代谢以满足这些细胞的高能量需求，并调控钙离子（Ca2+ 信号传导、为轴突生长和再生提供脂质，以及调节活性氧（ROS）的产生以支持神经元的发育与功能。因此，线粒体功能障碍是神经退行性疾病的核心驱动因素。线粒体的结构与功能密切相关。其内膜形态复杂，具有称为嵴的结构折叠，容纳多种执行线粒体特征性功能的分子系统。内膜的结构特征属于超微结构，尺寸过小，无法通过传统的衍射极限分辨率显微镜观察。因此，目前关于线粒体超微结构的大多数认识均来源于对固定样品进行的电子显微镜研究。然而，新兴的超分辨率荧光显微技术现已实现低至数十纳米的分辨率，使得在活细胞中可视化超微结构特征成为可能。因此，超分辨率成像技术以前所未有的能力直接呈现线粒体结构的精细细节、纳米尺度的蛋白质分布以及嵴的动态变化，为揭示线粒体与人类健康和疾病之间的联系提供了重要的新见解。本实验方案介绍了利用受激发射损耗（STED）超分辨率显微镜对活体人神经母细胞瘤细胞及原代大鼠神经元中的线粒体超微结构进行成像的方法。该流程分为五个部分：（1）SH-SY5Y细胞系的培养与分化，（2）原代大鼠海马神经元的分离、接种与培养，（3）用于活细胞STED成像的染色步骤，（4）使用STED显微镜进行活细胞STED实验的操作流程&#160;作为参考，以及（5）利用示例提供内膜形态特征测量与定量的分割及图像处理指导。

本方案描述了培养细胞和原代细胞的生长条件，重点用于活细胞STED成像以及后续对线粒体嵴的分析。利用ImageJ对未分化的SH-SY5Y细胞（图3A）和RA诱导分化的SH-SY5Y细胞（图3B）的线粒体进行投影，可通过传统共聚焦显微镜和STED显微镜以z轴层扫形式采集图像，随后对原始STED图像进行去卷积处理。也可进行延时成像并进行后续去卷积（图3C，D）。对于原代大鼠海马神经元，采用略有不同的成像参数（表1），可采集共聚焦和原始STED的z轴层扫图像，并对原始STED图像进行去卷积处理（图4A）。对原代神经元中的线粒体也可进行延时成像（图4B）。总体而言，延时图像应能够展示线粒体的动态事件。
当用于分割的样本原始STED图像与去卷积STED图像的z层投影结果一致时，即可进行定量测量。TWS插件利用去卷积后的STED图像进行分割，生成概率掩膜，进而创建线粒体嵴的二值掩膜，以获取其大小和形态参数（图5A）。该掩膜所定义的区域将保存至ROI管理器中，如有需要，可将其应用于原始STED图像，以测量相对强度的差异。此外，去卷积STED投影图像还可用于分析特定区域内线粒体嵴的周期性与密度（图5B）。
<img alt="线粒体结构示意图，标注了嵴、基质和膜；用于细胞呼吸研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65561/65561fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：线粒体形态。 线粒体具有双层膜系统，可划分出不同的亚区室（A）。嵴是内膜向内折叠形成的结构，具有特定的形态特征（B）。缩写：OMM，外线粒体膜；ICS，嵴间腔；IMS，膜间隙；CM，嵴膜；IBM，内边界膜；IMM，内线粒体膜；CT，嵴尖端；CJ，嵴连接处。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="使用STED显微镜进行细胞成像的流程图；显示线粒体分析和图像处理步骤。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65561/65561fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：实验流程示意图。 将SH-SY5Y细胞或原代大鼠海马神经元培养在PDL包被的盖玻片上。SH-SY5Y细胞并行培养，一部分保持未分化状态，另一部分则通过视黄酸（RA）诱导分化，持续六天。原代大鼠海马神经元在从海马组织分离后，接种于PDL包被的盖玻片上培养七天。待细胞准备成像时，使用PKMO染色，并通过STED显微镜进行成像。随后对原始STED图像进行去卷积处理，将去卷积后的图像导入FIJI软件进行分析，以获得大小和形态参数，如嵴密度、面积、周长、圆度和长宽比。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="STED 显微成像，共聚焦与 STED 对比，未分化与分化细胞对比，时间序列成像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65561/65561fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 3"> 
图 3：SH-SY5Y 细胞中线粒体的成像。 展示了非分化（A）和 RA 诱导分化（B）的 SH-SY5Y 细胞中经 PKMO 染色的线粒体的代表性共聚焦图像（左）、原始 STED 图像（中）以及 Huygens 去卷积处理后的 STED 图像 z 轴投影（右）。图（C）展示了 RA 诱导分化 SH-SY5Y 细胞的时间序列成像，时间间隔为 30 秒，共 5 次成像，其中选定区域（白色框）被放大显示于图（D），放大图使用无插值缩放的图像。比例尺：A,B，250 nm；C,D，1 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="STED显微镜对比：共聚焦、原始STED、去卷积；随时间变化的结构动态。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65561/65561fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图4"> 
图4：大鼠原代海马神经元中线粒体的成像。 展示了来自大鼠原代海马神经元的线粒体代表性共聚焦（左）、原始STED（中）和Huygens去卷积STED（右）图像的z轴投影（A）。展示了这些神经元中线粒体的时间序列图像，时间间隔为25秒，共5次迭代（B）。比例尺：A，250 nm；B，1 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="去卷积过程示意图；包括显微分析、概率图、掩膜、感兴趣区域（ROI）、灰度值。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65561/65561fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图5"> 
图5：在ImageJ中处理去卷积后的STED图像。 展示了使用可训练Weka分割插件（Trainable Weka Segmentation plugin）测量线粒体嵴大小和形状的代表性流程（A）。从左至右依次显示：去卷积后的STED图像、基于TWS插件分割生成的概率图、以概率图作为输入在FIJI中进行阈值处理后得到的掩膜、标注出感兴趣区域（ROI）的掩膜，以及将ROI叠加至原始去卷积STED图像的结果。对应这些对象所测得的面积、周长、圆形度和长宽比数据见补充表1。图中还展示了利用去卷积STED图像绘制线图以测量峰-峰间距，作为线粒体嵴密度的读数指标（B）。比例尺：0.5 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>像素大小 (nm)</td>
			<td>停留时间 (µs)</td>
			<td>扫描线累加</td>
			<td>STED 采集期间 561 nm 激发功率 (%)</td>
			<td>775 nm STED 耗尽光功率 (%)</td>
			<td>步进大小 (nm)</td>
			<td>针孔大小 (AU)</td>
			<td>时间序列间隔 (s)</td>
			<td>时间序列循环次数</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>未分化的 SH-SY5Y 细胞</td>
			<td>20</td>
			<td>4</td>
			<td>10</td>
			<td>15</td>
			<td>20</td>
			<td>200</td>
			<td>1.0</td>
			<td>30</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RA 诱导分化的 SH-SY5Y 细胞</td>
			<td>20-25</td>
			<td>4</td>
			<td>10-12</td>
			<td>15</td>
			<td>20-22</td>
			<td>150-200</td>
			<td>1.0</td>
			<td>30</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>原代神经元</td>
			<td>20-25</td>
			<td>4</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>25</td>
			<td>200</td>
			<td>0.7</td>
			<td>30</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="10">注：像素大小可根据成像需求以及是否计划对图像进行去卷积处理而调整。若需进行去卷积，必须满足适当的采样条件。未经去卷积处理的原始 STED 图像像素大小可高达 30 nm。</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：STED成像参数汇总。 显示了针对每种细胞类型（未分化SH-SY5Y细胞、RA诱导分化的SH-SY5Y细胞以及原代大鼠海马神经元）进行2D STED成像时所使用的设置。所有时间序列成像均采集5次，时间间隔根据ROI大小进行调整。
补充图 1：添加淀粉样蛋白-β（Aβ）的 SH-SY5Y 细胞成像。 显示了经视黄酸（RA）分化的 SH-SY5Y 细胞在添加 PKMO 染料（上排）和 Aβ-HiLyte647（下排）后的代表性共聚焦图像（左）、原始 STED 图像（中）和去卷积 STED 图像（右）（A）。原始 PKMO STED（绿色）与原始 Aβ STED（品红色）的合并 z 轴投影图像（B），以及去卷积后的 PKMO STED（绿色）与去卷积后的 Aβ STED（品红色）的合并 z 轴投影图像（C）也一并展示。比例尺：0.5 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/Suppl%20Fig.pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充表 1：分割后嵴的尺寸和形状测量结果。 显示了来自分割线粒体的、对应于图 5A中轮廓对象的面积（µm2）、周长（µm）、圆形度和长宽比的尺寸和形状测量结果。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561_Supplementary%20Table%201.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充表 2：Aβ 样品采集参数汇总。 显示了用于未分化和 RA 分化 SH-SY5Y 细胞中 PKMO 与 Aβ-HiLyte647 进行二维 STED 成像的设置。Aβ-HiLyte647 可单独使用共聚焦成像，因为无需分辨特定结构；此处展示 Aβ-HiLyte647 的 STED 图像旨在呈现更小颗粒的尺寸。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561_Supplementary%20Table%202.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件1：淀粉样蛋白-β处理方案。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561_Supplementary%20File%201.docx" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本方案介绍了一种用于培养SH-SY5Y细胞和原代大鼠海马神经元的增殖、分化与染色的工作流程，旨在通过受激发射损耗（STED）显微镜对线粒体超微结构进行可视化与分析。

利用活细胞STED成像技术可视化神经元细胞模型中线粒体内膜的超微结构

线粒体在细胞中发挥多种重要功能，包括能量生成、钙离子稳态调节、脂质生物合成以及……

我们的研究项目聚焦于线粒体的结构与功能，特别是与衰老相关功能障碍有关的方面。为此，我们采用多种生物物理、生物化学和结构生物学技术，探索线粒体衰老的基本机制，并开发用于维持和恢复线粒体健康的治疗干预手段。线粒体的功能与结构密切相关。标准的光学显微技术适用于测量线粒体的大尺度特征，例如基本形态和网络结构。对于需要高于传统光学显微镜分辨率的线粒体超微结构或特征的分析，通常采用电子显微镜或断层扫描技术对固定样品进行观察。超分辨率显微技术是一种基于荧光的成像方法，能够检测超出衍射极限的结构特征。对于线粒体，这包括纳米级蛋白质分布和嵴结构的测量。此处描述的STED成像方案使研究人员能够在活细胞中测量内膜的精细结构。活细胞STED成像使我们能够在生理相关条件下观察并定量分析嵴的复杂特征，而无需对样品进行固定。这将使研究人员深入了解超微结构特征的动态变化及其对压力因素和药物化合物的时间响应。首先，在补充有10% DMSO的FBS中快速解冻SH-SY5Y细胞的冷冻保存液，并用预热的培养基稀释十倍。然后离心细胞并弃去上清液。将细胞沉淀重悬于5毫升预热的培养基中，并将细胞接种至T25培养瓶。为制备多聚赖氨酸（PDL）包被的盖玻片，向无菌腔室盖玻片的每个孔中加入600微升浓度为50微克/毫升的PDL溶液。根据孔的大小，每个孔中加入的PDL溶液体积可能有所不同。将盖玻片在室温下孵育一小时。孵育结束后，除去多聚赖氨酸（PDL）溶液，并用1.8毫升蒸馏水冲洗盖玻片三次。让包被好的培养腔室在空气中干燥两小时。当 SH-SY5Y 细胞融合度达到 80% 至 90% 时，加入胰蛋白酶溶液进行消化。加入预热的 DMEM 培养基以中和胰蛋白酶。离心细胞悬液，并将沉淀重悬于 DMEM 中。使用自动细胞计数器对细胞进行计数。随后，将细胞以每平方厘米1.5 × 10⁴个细胞的密度接种至PDL包被的腔室载玻片中。在第1天和第3天，更换培养基为DMEM，分别添加5%或2% FBS、1% 抗生素-抗真菌剂，并分别加入10 µmol RA或等体积的95%乙醇，后者作为分化的溶剂对照。根据细胞分化状态，用预热的不含酚红的DMEM培养基配制PKMO储存液，培养基中添加2%或10%胎牛血清（FBS）、1%抗生素-抗真菌剂以及20毫摩尔HEPES。在第6天，用成像培养基冲洗细胞两次，然后在37摄氏度、5%二氧化碳条件下，将细胞与PKMO溶液共同孵育30分钟。染色后，用预热的成像培养基冲洗细胞三次。最后一次洗涤时，将细胞在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育30分钟。孵育结束后，用含有20毫摩尔HEPES的新鲜预热成像培养基替换最后一次洗涤液。打开Lightbox软件以进行图像采集。选择激光和滤光片组合时，从染料列表中选择染色所用的染料，以设置橙色染料的参数。通过概览图像，单击 LIVE 以聚焦细胞。待细胞清晰聚焦后，调整共聚焦采集参数。接下来，选择矩形 ROI 按钮，通过单击并拖动来围绕目标线粒体创建感兴趣区域。为了调整受激发射损耗（stimulated emission depletion, STED）成像的探测器门控，请在 GENERAL 菜单旁选择 GATING 菜单，或单击并按住以将该菜单添加到视图中。对于 STED 成像，将激发激光设置为 15% 至 20%，将 STED 耗尽激光设置为 20% 至 25%，并设置 10 次线累积。采用4微秒的像素驻留时间，像素大小为20至25纳米。通过选择“时间”下拉菜单，设置迭代次数为5次，时间间隔为25或30秒，以进行延时成像。可使用“体积”选项并调节所需的Z轴体积范围和步长，来获取Z轴层扫图像。打开STED图像去卷积软件，使用软件算法对原始STED图像进行去卷积。在确认显微镜参数正确后，选择“快速”按钮，并将去卷积类型设置为“快速”、“标准”、“激进”或“保守”，以实现不同程度的去卷积强度。执行去卷积操作。将图像保存为 ICS2 格式。在 ImageJ 中，单击“文件”，然后选择“打开”，以从去卷积软件中打开 ics2 文件。选择“插件”，然后选择“分割”，接着选择“可训练的 Weka 分割”插件来打开去卷积后的 STED 图像。在分割设置中，选择高斯模糊、膜投影和 Sobel 滤波器特征。将一个类别标记为“嵴”，另一个类别标记为“背景”。接着，在结构上绘制一条线，以分配至任一类。然后在右侧选择“嵴”或“背景”对应的“添加”按钮。然后在左侧选择“训练分类器”按钮，根据提供给插件的信息生成图像。单击“保存分类器”按钮，以保存分类器设置，供后续分割使用。在 ImageJ 中利用嵴概率图对图像进行阈值分割，生成二值化掩膜，然后进入“分析”菜单，选择“分析颗粒”。最后，绘制一条多点连线，将线条粗细调整为几个像素宽，并对线条进行样条拟合以贴合线粒体轮廓。本研究展示了对未分化的、经视黄酸分化的SH-SY5Y细胞进行线粒体成像，并采用延时成像技术。去卷积后的STED图像可用于测定特定区域内嵴的周期性以及嵴的大小和形态参数。

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科研

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Neuroscience

神经科学

使用活细胞STED成像可视化神经元细胞模型中的线粒体内膜超微结构

活细胞成像在研究细胞器运输动态时具有特别重要的应用价值。本文描述了一种利用宽场荧光显微镜对培养神经元中致密核心囊泡进行活体成像的实验方案。该方案具有良好的灵活性，可经适当调整用于成像其他细胞器，如线粒体、内体和过氧化物酶体。...

活体成像原代培养的海马神经元中的致密核心囊泡

我们描述了一种通过荧光显微镜对活神经元中的线粒体进行长时间成像的实验方案。通过慢病毒介导表达线粒体靶向的荧光蛋白，并结合使用本实验室设计和构建的低成本载台式培养箱，可实现对样本的长期连续成像。...

神经调节与线粒体运输：对海马神经元进行长时间活体成像

来源：Kennedy, L. H., 等人 利用腺相关病毒和共聚焦显微镜对脑片中少突胶质细胞细胞器进行可视化与活体成像 视频实验杂志...

器官型脑切片培养中少突胶质细胞内线粒体运动的共聚焦成像

线粒体运输和形态异常与多种神经退行性疾病相关。本方案利用诱导性多能干细胞分化的前脑神经元，评估遗传性痉挛性截瘫中的线粒体运输和形态。该方案可实现对轴突中线粒体运输的表征及其形态学分析，有助于推动神经退行性疾病的机制研究。...

分析遗传性痉挛性截瘫患者来源的人诱导多能干细胞衍生神经元中的线粒体运输与形态

本方案旨在提供一种方法 体外 和 体内 线粒体 Ca2+...

成像线粒体 Ca2+ 星形胶质细胞和神经元中利用基因编码Ca探针检测摄取2+ 指示剂（GECIs）

本文介绍了配备MitoTimer生物传感器的星形胶质细胞培养物的线粒体延时成像方法，以及对线粒体动力学、运动性、形态、生物发生、氧化还原状态和周转的多参数分析。...

活体成像培养星形胶质细胞中的线粒体系统

本文介绍了一种利用共聚焦活细胞显微镜检测原代海马神经元和皮层神经元基础氧化还原状态差异以及对急性干扰的氧化还原反应差异的实验方案。该方案经少量修改后也可适用于其他细胞类型和显微镜系统。...

利用比率型探针对原代神经元中线粒体谷胱甘肽氧化还原状态进行活体成像

本方案描述了如何重建线粒体嵴以实现高精度、高分辨率和高通量的三维成像。...

一种用于可视化胰腺癌细胞线粒体超微结构变化的三维技术

FM染料在理解突触动态方面提供了不可估量的帮助。通常在不同刺激条件下，通过荧光显微镜观察FM染料的信号。然而，将FM染料的光转化技术与电子显微镜相结合，可实现对突触小体中不同突触囊泡池以及其他超微结构组分的可视化观察。...

利用 Styryl 染料光转化研究突触囊泡池

我们开发了一款用于分析神经元形态的计算机程序。结合两种现有的开源分析工具，该程序可进行Sholl分析，并确定神经突的数量、分支点数量以及神经突末端数量。这些分析能够揭示神经突形态的局部变化。...

多尺度数字化神经元形态的自动Sholl分析

了解活细胞STED超分辨显微技术用于可视化神经元模型中线粒体内膜超微结构的方法。该技术可实时观测线粒体嵴动态变化，为研究细胞衰老与线粒体功能障碍提供重要工具。

利用活细胞STED成像技术可视化神经元细胞模型中线粒体内膜的超微结构

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