一种用于在致密核环境中研究染色质的多标记单分子定位显微镜实验方案

我们的研究探讨染色质压缩结构域的表观遗传组成，以及调控因子如何塑造其结构与功能。该实验方案对于研究靶标与致密细胞环境（如细胞核）之间的空间关系最为有用。首先，称取牛血清白蛋白，使其在实验所需缓冲液体积中的终浓度为3%。将牛血清白蛋白加入离心管中。

将离心管倾斜至45度角，使牛血清白蛋白晶体铺展开，然后向管中加入PBS。这可以防止晶体结块。让所有牛血清白蛋白晶体在室温下自然溶解，避免振荡或涡旋。

待晶体完全溶解后，加入 Triton X-100，使其终浓度为 0.2%。若仍有晶体残留，可反复吹打溶液数次，缓慢混匀，避免产生气泡。从培养箱中取出活细胞，移除培养皿中的细胞培养基。

加入足量 PBS 覆盖细胞以洗涤细胞，然后用移液器吸出 PBS。接着，加入足量固定液覆盖细胞，并让细胞固定 10 分钟。使用天平称取硼氢化钠，配制 0.1% 的淬灭溶液。

将硼氢化钠加入离心管中。用移液器从培养皿中吸出固定液。然后，向培养皿中加入足量的磷酸盐缓冲液（PBS），以覆盖细胞表面。

将培养皿置于摇床上，振荡五分钟以洗涤细胞。接着，向离心管中的硼氢化钠加入所需体积的磷酸盐缓冲液（PBS）。涡旋振荡离心管，充分混匀淬灭溶液。

从摇床上取下培养皿，弃去培养皿中的 PBS。加入足量的淬灭液以覆盖培养皿表面。然后将培养皿置于摇床上震荡七分钟，以淬灭细胞中的自发荧光。

将离心管中剩余的淬灭溶液弃入适当标记的液体化学废液容器中。从摇床中取出培养皿，然后移除培养皿中的淬灭溶液。接着，向培养皿中加入足量的 PBS 以覆盖表面。

将培养皿置于摇床上震荡5分钟以洗涤细胞。孵育结束后，吸除PBS，并用PBS再重复洗涤两次。随后，向培养皿中加入足量的封闭缓冲液，覆盖整个表面。

将培养皿置于摇床上孵育至少一小时，以通透细胞膜并封闭结合位点。为配制一抗染色液，将所需体积的封闭缓冲液原液转移至新的离心管中。向封闭缓冲液中加入所需体积的一抗原液，以达到制造商规定的终浓度。

接下来，用足量的一抗染色液替换封闭缓冲液，以覆盖培养皿表面，并在摇床上孵育1至2小时或过夜。一抗孵育结束后，用洗涤缓冲液替换一抗溶液。然后将培养皿置于摇床上洗涤5分钟，以清洗细胞。

用洗涤缓冲液再重复洗涤两次，共洗涤三次。根据推荐浓度配制二抗染色液。通过将覆盖细胞所需的液体体积加上0.5毫升，计算出总的染色液体积。

将计算好的封闭缓冲液体积转移至新的离心管中，以配制染色溶液。然后，向封闭缓冲液中加入适量的二抗原液，以获得正确的终浓度。用铝箔纸包裹含有二抗染色溶液的离心管，并通过上下吹打混匀溶液。

加入足量的二抗染色液以覆盖培养皿表面。将培养皿置于摇床上孵育40分钟，使荧光染料与标记的细胞靶标结合。用铝箔包裹培养皿，防止荧光染料发生漂白。

40分钟后，进行两次PBS洗涤，操作方法如前所述。若需要储存，请在储存前向培养皿中加入足量PBS以覆盖细胞表面。用封口膜包裹培养皿以防止液体蒸发，再用铝箔包裹以避免荧光染料漂白。

将包裹好的培养皿置于 4°C 保存，直至准备成像。该顺序染色方案为多种细胞系（包括 BJ 成纤维细胞、HeLa 细胞和 MCF 10A 细胞）生成了具有代表性的三色染色质 dSTORM 图像。分析流程通过模拟数据集进行评估，这些数据集代表了以异染色质簇位置为锚定点的正常均匀环状和随机空间分布。

当分析定位坐标相对于异染色质中心的距离时，不同的空间组织模式产生了特征性的距离直方图分布。在正常脉络膜构型中，模拟的空间分离标记产生的联合密度极低，从而形成平坦的分布曲线；而在正常的随机构型中，模拟的重叠标记模式则表现出随着与参考点距离的增加，联合密度逐渐降低的趋势。

基于DB扫描的异染色质区域鉴定能够根据有效半径将异染色质区域分为小、中、大三类。定量距离分析显示，RNA聚合酶II和H3K27ac在小、中、大三类异染色质区域的边界附近均有定位。联合密度分析表明，H3K27ac与RNA聚合酶II的共定位峰值恰好位于异染色质簇边界的外侧。

通过本方案，研究人员可以探究染色质看似无序的组织结构，进而分析其结构、调控元件与功能结果之间的关系。按照此流程，可采用基于图像或点云的计算分析方法，从空间数据中提取定量的结构特征，具体方法取决于所使用的成像模式。研究人员还可通过优化额外的标记物并利用多通道数据，进一步拓展该标记方法，以实现更高级、更全面的分析。