从胚胎干细胞中分离富含粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的外泌体富集型细胞外囊泡

本方案可用于从表达免疫刺激因子 GM-CSF 的胚胎干细胞中制备高质量的外泌体富集型细胞外囊泡。携带 GM-CSF 的外泌体富集型细胞外囊泡，有望作为无细胞的免疫调节囊泡，用于调控免疫反应。具备基础分子与细胞生物学实验技能的研究人员均可轻松应用本方案；但首次操作本方案的人员应严格遵循操作步骤进行。

由于我们的实验方案较为复杂，以可视化方式呈现每一步的精细操作细节将有助于其他研究人员。为制备无外泌体的胎牛血清（FBS），需对所需体积的FBS进行超速离心，并收集无外泌体的上清液。在接种ESD-3细胞前，使用0.1%明胶在室温下孵育15厘米组织培养皿30分钟进行包被。通过抽吸去除明胶，随后将ESD-3细胞接种于ESD-3细胞培养基中，在37°C、含5%二氧化碳的湿化培养箱中培养，无需饲养层细胞，直至细胞融合度达到90%。

用每皿5毫升0.05%胰蛋白酶洗涤接近融合的细胞培养物，随后在新鲜胰蛋白酶中于37摄氏度孵育5分钟。孵育结束后，将脱落的细胞收集至离心管中，并加入5毫升新鲜培养基以灭活胰蛋白酶。通过离心沉淀细胞，然后将沉淀物重新悬浮于新鲜培养基中进行计数。传代时，将5×10⁶个ESD-3细胞接种至含15毫升细胞培养基的新明胶包被培养皿中，培养3天后再进行继代培养。为收集细胞培养上清液以分离富含外泌体的细胞外囊泡，每块新的明胶包被培养皿中接种1×10⁷个ESD-3细胞，加入15毫升细胞培养基，培养3天后收集细胞培养上清液。在进行富含外泌体的细胞外囊泡分离时，首先对来自72小时培养的ESD-3细胞的上清液进行离心，以沉淀其中的大细胞碎片。

收集上清液后，将样品进行超速离心，并弃去上清液。每次用一毫升磷酸盐缓冲液（PBS）轻轻冲洗沉淀物两次，以去除任何残留的培养上清液，并根据制造商说明书，采用二辛可宁酸法（Bicinchoninic acid assay）定量外泌体富集的细胞外囊泡蛋白含量。然后将外泌体富集的细胞外囊泡重新悬浮于磷酸盐缓冲液（PBS）中，浓度为每微升6微克，于-80摄氏度保存。

为通过透射电子显微镜观察富含外泌体的细胞外囊泡，将每毫升含3至5微克的细胞外囊泡与终浓度为2%的电镜级多聚甲醛在室温下固定2小时。孵育结束后，取10微升固定后的样品滴加于带有碳支持膜的铜网上，作用1分钟后用滤纸吸去多余液体，随后根据制造商说明书加入适当的染色液对铜网进行染色，并用镊子将铜网转移至一片滤纸上。最后，按照标准操作流程，使用50,000倍放大倍率的透射电子显微镜采集电镜图像。为制备全细胞提取物，从培养物中收集ESD三细胞，用PBS重悬收获的细胞并进行计数。

经过第二次离心后，将细胞重悬于含有0.5% SDS浓度的SDS-PAGE上样缓冲液中，细胞浓度为每微升5 × 10³个细胞，并在超声破碎仪上以10%的振幅超声处理10秒。然后将样品在100摄氏度下加热5分钟。为制备用于外泌体富集的细胞外囊泡的裂解液，将外泌体富集的细胞外囊泡重悬于含有0.5% SDS的SDS-PAGE上样缓冲液中，浓度为1.2微克/微升，按上述方法超声处理10秒，随后在100摄氏度下加热5分钟。

进行蛋白质印迹分析时，将10 µL粗提物以及外泌体富集的细胞外囊泡裂解液样品分别加入最佳变性PAGE凝胶的各个加样孔中。电泳结束后，将蛋白质转移至PVDF膜上，并用相应的特异性一抗和二抗孵育膜，然后根据制造商说明书，使用增强型化学发光检测试剂盒检测蛋白表达水平。为评估外泌体富集的细胞外囊泡中GM-CSF的含量，可使用小鼠GM-CSF检测试剂盒，用抗GM-CSF捕获抗体包被ELISA板；随后，将0.6 µg外泌体富集的细胞外囊泡样品分别与100 µL PBS，或含0.05% Tween 20的PBS在室温下处理30分钟。

孵育结束后，将处理后的样品加入已准备好的ELISA板的各个孔中，在室温下孵育1小时，随后用PBS或含0.05% Tween 20的PBS洗涤相应孔。洗涤后，向样品中加入检测抗体，在室温下孵育1小时，再用PBS或含0.05% Tween 20的PBS进行洗涤。然后向样品中加入亲和素-辣根过氧化物酶（Avidin Horseradish Peroxidase），在室温下孵育30分钟，再次洗涤后，使用酶标仪在450纳米波长下测定各孔的吸光度。表达GM-CSF的ESD三细胞系或表达空载体的ESD三细胞系的GFP荧光强度明显高于其亲本细胞系。

ELISA 检测显示，表达 GM-CSF 的 ESD three 细胞在其细胞培养上清液中产生的 GM-CSF 水平显著高于空载体对照细胞。此外，表达 GM-CSF 的 ESD three 细胞所产生的 GM-CSF 量与表达 GM-CSF 的 STO 成纤维细胞相当。对来自载体转导和 GM-CSF 转导细胞培养物中分离出的细胞外囊泡进行透射电子显微镜观察，结果显示存在不同大小的囊泡，其直径均在预期的 30 至 100 纳米范围内。

通过Western blot分析发现，与全细胞裂解物相比，从ESD三个细胞中分离出的细胞外囊泡中外泌体标志物（包括CD81、Annexin V和flotillin-1）的表达显著增强。重要的是，在ESD三个细胞来源的细胞外囊泡中未检测到其他亚细胞结构标志物，包括内质网标志物蛋白二硫键异构酶（Protein Disulfide Isomerase）、线粒体标志物细胞色素C（cytochrome C）和氧化磷酸化复合物IV亚基IV（Oxphos complex IV-subunit IV），以及胞质标志物GAPDH。用0.05% Tween 20洗涤后，对照组细胞外囊泡中检测到的背景GM-CSF水平显著降低。

相比之下，表达GM-CSF的细胞所分泌的细胞外囊泡中，GM-CSF水平在添加吐温20后显著升高。获取富含携带GM-CSF的外泌体的高质量细胞外囊泡，是本实验方案成功最关键的一步。研究人员可进一步开展其他实验，例如在依赖GM-CSF的细胞系和动物模型中进行研究，以确定富含携带GM-CSF的外泌体的细胞外囊泡是否可作为无细胞的免疫调节囊泡发挥作用。

这些富含外泌体的细胞外囊泡可用于研究免疫反应的调节如何影响不同的疾病状态。