Name: 分离外体富集的细胞外囊泡携带颗粒细胞-巨噬细胞-胚胎干细胞的细胞外刺激因子 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: 学习从胚胎干细胞中分离富含外体的细胞外囊泡并携带粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的方法。该方案可生产高质量免疫调节囊泡，用于细胞外免疫治疗研究。

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我们感谢 Arkadiusz Slusarczyk 先生以及肯塔基生物医学研究基础设施网络（KBRIN, P20GM103436）在获取透射电子显微镜图像方面提供的帮助。本研究部分得到了以下资助：NIH AA018016-01（J.W.E.）、肯塔基州研究挑战信托基金（J.W.E.）、NIH CA106599 和 CA175003（C.L.）、NIH CA198249（K.Y.）以及 Free to Breathe 研究基金（K.Y.）。

1. 培养ES-D3细胞
<ol>
	<li>为制备无外泌体的胎牛血清（FBS），将FBS加入超速离心机中，在4 °C条件下以100,000 × g 离心16小时。离心后，收集上清液作为无外泌体FBS，用于培养小鼠ESC细胞系ES-D3并获取富含外泌体的细胞外囊泡（EVs）。</li>
	<li>在接种ES-D3细胞前，使用0.1%明胶在室温下孵育15 cm组织培养皿30分钟进行包被处理。</li>
	<li>按照先前描述的方法16，在经明胶包被的15 cm组织培养皿中无饲养层细胞培养ES-D3细胞。ES-D3细胞培养基由DMEM、无外泌体FBS（15%）、非必需氨基酸（0.1 mM）、L-谷氨酰胺（2 mM）、β-巯基乙醇（0.1 mM）、青霉素（50 units/mL）、链霉素（50 µg/mL）和白血病抑制因子（LIF；100 units/mL）组成。将ES-D3细胞置于37 °C、5% CO2的湿化培养箱中培养。</li>
	<li>当ES-D3细胞在15 cm组织培养皿中融合度达到约90%时，通过抽吸去除培养基。用胰蛋白酶（5 mL；0.05%）洗涤细胞，随后加入胰蛋白酶（5 mL），在37 °C孵育5分钟。从培养皿中收集细胞。</li>
	<li>向收集的细胞中加入新鲜培养基（5 mL）以灭活胰蛋白酶。在390 × g 条件下离心5分钟。用新鲜培养基重悬细胞，并使用血细胞计数板测定细胞数量。</li>
	<li>进行细胞传代时，将ES-D3细胞（5 × 106）接种于经0.1%明胶包被的15 cm组织培养皿中，加入新鲜培养基（15 mL），培养3天后进行继代培养。</li>
	<li>为收集用于分离富含外泌体EVs的细胞培养上清液，将ES-D3细胞（1 × 107）接种于经0.1%明胶包被的15 cm组织培养皿中，加入新鲜培养基（15 mL），培养3天后收集细胞培养上清液。</li>
</ol>
2. GM-CSF 表达质粒的构建
注意：构建转染质粒 pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP，用于在 ES-D3 细胞中过表达 GM-CSF。该质粒中，小鼠 GM-CSF cDNA 与标记蛋白人源化 Renilla reniformis GFP（hrGFP）的表达由人肽链延伸因子 1α（EF1α）启动子驱动17,18。
<ol>
	<li>构建载体骨架。
	<ol>
		<li>使用限制性内切酶EcoRI（100单位）在37 °C下消化质粒pEF1α-FD3ER-IRES-hrG（20 µg DNA）2小时，产生两个DNA片段：载体骨架（6.0 kb）和FD3ER插入片段（2.5 kb）。</li>
		<li>将50%的消化后质粒DNA（10 µg）转移至一个1.5 mL微量离心管中，并在37 °C下用碱性磷酸酶（20单位）处理1小时。通过琼脂糖凝胶电泳（2%）分离未处理和去磷酸化的DNA。</li>
		<li>使用DNA凝胶回收试剂盒纯化载体骨架DNA片段（6.0 kb）。其中，未处理的载体骨架将作为空载体（pEF1α-IRES-hrGFP），而去磷酸化的载体骨架将用于构建表达GM-CSF的质粒（pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>构建GM-CSF cDNA插入片段。
	<ol>
		<li>使用限制性内切酶EcoRI（100单位）在37 °C下消化质粒pMSCV-mGM-CSF-IRES-EGFP19（20 µg）2小时，产生两个DNA片段：载体骨架（6.5 kb）和小鼠GM-CSF cDNA插入片段（474 bp）。</li>
		<li>通过琼脂糖凝胶电泳（2%）分离消化后的DNA。使用DNA凝胶回收试剂盒纯化小鼠GM-CSF cDNA片段（474 bp）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>构建表达质粒。
	<ol>
		<li>使用DNA连接试剂盒设置两个连接反应（总体积10 μL）。
		<ol>
			<li>为构建空载体pEF1α-IRES-hrGFP，将第2.1.3步中未处理的载体骨架（6.0 kb；500 ng）进行连接。</li>
			<li>为构建pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP，连接以下DNA片段：（1）第2.1.3步中去磷酸化的载体骨架（6.0 kb；500 ng）和（2）第2.2.2步中获得的mGM-CSF cDNA片段（474 bp；200 ng）。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在25 °C下连接5分钟。将连接产物转化至DH5α感受态E. coli细胞中。将转化后的E. coli细胞涂布于含羧苄青霉素（50 μg/mL）的LB琼脂平板上。</li>
		<li>使用DNA提取试剂盒从单个E. coli菌落中提取质粒DNA。通过DNA测序验证质粒的正确性。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 过表达GM-CSF的ES-D3细胞的制备
注意：将质粒 pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP 转染至 ES-D3 细胞中，以过表达 GM-CSF。同时共转染质粒 pBabe-Neo 至 ES-D3 细胞中，以利于稳定转染细胞的筛选18,20。
<ol>
	<li>将质粒转染至 ES-D3 细胞中。
	<ol>
		<li>将 ES-D3 细胞（1.4 × 106）接种于经明胶（0.1%）包被的 10 cm 组织培养皿中，加入培养基（10 mL）进行转染。将接种后的 ES-D3 细胞在 37 °C 培养 24 h。</li>
		<li>在 1.5 mL 微离心管中配制两种质粒混合物：（1）pEF1α-IRES-hrGFP（28 µg，空载体对照）与 pBabe-Neo（4 µg）；（2）pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP（28 µg，表达 GM-CSF）与 pBabe-Neo（4 µg）。使用转染试剂盒，按照制造商提供的操作说明进行转染。</li>
		<li>向每管含有质粒混合物的溶液中加入转染培养基（1 mL）和转染试剂（64 µL），室温孵育 5 min。</li>
		<li>将转染混合物分别加入含有 ES-D3 细胞的 10 cm 培养皿中。在 37 °C 孵育 5 h。</li>
		<li>将 10 cm 培养皿中的培养基更换为新鲜培养基（10 mL）。在 37 °C 继续孵育 24 h。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>建立稳定转染的 ES-D3 细胞群体。
	<ol>
		<li>移除转染后 ES-D3 细胞的培养基，用胰蛋白酶（2 mL；0.05%）洗涤细胞。加入胰蛋白酶（2 mL），在 37 °C 孵育 5 min。将细胞转移至 15 mL 离心管中，并加入 2 mL 新鲜培养基以中和胰蛋白酶。在 390 × g 离心 5 min。</li>
		<li>将转染后的细胞重悬于新鲜培养基（10 mL）中。按照制造商的操作说明，使用荧光激活细胞分选（FACS）检测转染 ES-D3 细胞中 GFP 的荧光强度。</li>
		<li>将转染后的细胞转移至两个含有新鲜培养基（10 mL）的 10 cm 培养皿中。加入新霉素（0.5 mg/mL）以清除未转染的细胞。</li>
		<li>在含新霉素（0.5 mg/mL）的培养基中持续培养转染细胞。当转染的 ES-D3 细胞达到 90% 汇合度时，再次将细胞转移至 15 cm 组织培养皿中。重复该过程 2 周。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>建立稳定转染的 ES-D3 细胞克隆。
	<ol>
		<li>在获得稳定转染的 ES-D3 细胞群体后，按前述方法收集细胞。使用血细胞计数板测定细胞数量。在 390 × g 离心 5 min。将细胞重悬于新鲜培养基中，浓度为 1 × 107 个细胞/mL。</li>
		<li>通过无菌 40 µm 细胞滤网过滤细胞。按照制造商的操作说明，使用 FACS 分选 GFP 阳性的 ES-D3 细胞。</li>
		<li>将单个分选后的 ES-D3 细胞接种至经明胶（0.1%）包被的 96 孔组织培养板的一个孔中，每孔含无新霉素的培养基（200 µL）及亲本 ES-D3 细胞（1 × 103 个）。将转染的 ES-D3 细胞与未转染的亲本细胞共培养，可确保稳定转染的单个 ES-D3 细胞存活并增殖形成单克隆。</li>
		<li>培养 48 h 后，向 96 孔板中加入新霉素（0.5 mg/mL），以清除未转染的亲本 ES-D3 细胞。</li>
		<li>在含新霉素（0.5 mg/mL）的培养基中继续培养 GFP 阳性的 ES-D3 细胞 1 周。随后将克隆的 ES-D3 细胞系转移至含新霉素（0.5 mg/mL）的培养基（5 mL）的明胶（0.1%）包被的 6 cm 组织培养皿中，继续培养 1 周。</li>
		<li>按照制造商的操作说明，使用 FACS 检测各转染 ES-D3 细胞克隆中 GFP 荧光强度。选择表达 GM-CSF 或空载体且绿色荧光水平较高的 ES-D3 克隆。</li>
		<li>按照制造商的操作说明，使用小鼠 GM-CSF ELISA 试剂盒测定 ES-D3 细胞分泌的 GM-CSF 含量。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 外泌体富集的细胞外囊泡的分离
<ol>
	<li>将 ES-D3 细胞（1 × 107）在 15 cm 组织培养皿中于 37 °C 培养 72 小时。收集细胞培养上清液。将收集的上清液在 4 °C 下保存，最长可保存 1 周，以维持外泌体的完整性。</li>
	<li>使用离心机在 4 °C 下以 5,000 × g 离心细胞培养上清液 60 分钟，以沉淀较大的细胞碎片。</li>
	<li>收集上清液，并使用超速离心机在 4 °C 下以 100,000 × g 离心 90 分钟。</li>
	<li>弃去上清液。用磷酸盐缓冲液（PBS；1 mL）轻轻冲洗每个沉淀物两次，以去除残留的培养上清液。</li>
	<li>将每个沉淀物重悬于 PBS 中。通过蛋白质含量定量富含外泌体的细胞外囊泡（EVs）5。
	<ol>
		<li>使用二辛可宁酸（BCA）法测定富含外泌体的 EVs 的蛋白质浓度。从 ES-D3 细胞获得的富含外泌体的 EVs 预期产量约为每毫升细胞培养上清液 4 µg 蛋白质。将富含外泌体的 EVs 重悬于 PBS 中（蛋白质浓度：约 6 µg/µL）。将富含外泌体的 EVs 储存在 -80 °C。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 通过透射电子显微镜表征外泌体富集的细胞外囊泡
注意：使用透射电子显微镜（TEM）分析从胚胎干细胞（ESCs）中分离的富含外泌体的细胞外囊泡（EVs）的组成和结构5。
<ol>
	<li>在室温下，用终浓度为2%的电镜级甲醛固定外泌体富集的细胞外囊泡（3-5 µg/µL），固定时间为2小时。</li>
	<li>将固定后的样品（10 µL）加到带有碳支持膜的铜网上，孵育1分钟，然后用滤纸吸去多余液体。</li>
	<li>按照生产商说明书，使用染色液对铜网进行染色。</li>
	<li>用镊子将铜网转移至一张滤纸上，于室温下静置过夜使其自然干燥。</li>
	<li>按照生产商说明书，使用透射电子显微镜（放大倍数50,000×）采集电镜图像。</li>
</ol>
6. 通过蛋白质印迹分析评估外泌体富集的细胞外囊泡
<ol>
	<li>制备全细胞提取物。
	<ol>
		<li>移除在15 cm培养皿中培养的ES-D3细胞的培养基。用胰蛋白酶（5 mL；0.05%）洗涤细胞。向细胞中加入胰蛋白酶（5 mL）。在37 °C孵育5 min。收集细胞，并加入新鲜培养基（5 mL）以中和胰蛋白酶。在390 x g离心5 min。用PBS重悬细胞。</li>
		<li>使用血细胞计数板确定细胞数量。再次在390 x g离心5 min。用含有0.5% SDS的SDS-PAGE上样缓冲液重悬细胞（5,000个细胞/µL）。</li>
		<li>使用超声破碎仪（振幅10%，功率：500 W，超声频率：20 kHz）对样品超声处理10 s。在100 °C加热样品5 min。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备富含外泌体的细胞外囊泡（EV）裂解液。
	<ol>
		<li>将富含外泌体的EV用含有0.5% SDS的SDS-PAGE上样缓冲液重悬，浓度为1.2 µg/µL。</li>
		<li>使用超声破碎仪（振幅10%，功率：500 W，超声频率：20 kHz）对样品超声处理10 s。在100 °C加热样品5 min。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过Western blot检测蛋白质。
	<ol>
		<li>将全细胞提取物（10 µL；5,000个细胞/µL）和富含外泌体的EV裂解液（10 µL；1.2 µg/µL）分别上样至Bis-Tris PAGE凝胶（4–20%）的每个孔中。将蛋白质转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。</li>
		<li>用适当的一抗和二抗孵育膜。将抗体（按以下指示浓度）稀释于含有PBS、Tween-20（0.2%）和脱脂奶粉（10% w/v）的杂交缓冲液中。
		<ol>
			<li>使用以下一抗：抗Annexin V抗体（200 ng/mL）、抗CD81抗体（50 ng/mL）、抗Flotillin-1抗体（200 ng/mL）、抗细胞色素c抗体（100 ng/mL）、抗蛋白二硫键异构酶抗体（200 ng/mL）、抗GAPDH抗体（33 ng/mL）和抗Oxphos COX IV亚基IV抗体（600 ng/mL）。</li>
			<li>使用以下二抗：辣根过氧化物酶偶联的山羊抗兔IgG（20 ng/mL）和辣根过氧化物酶偶联的山羊抗小鼠IgG（20 ng/mL）。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用增强型化学发光检测试剂盒检测蛋白质。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 通过ELISA测定富含外泌体的细胞外囊泡中的GM-CSF浓度
注意：使用小鼠 GM-CSF 检测试剂盒，按照生产商说明书进行 ELISA 检测，评估外泌体富集的细胞外囊泡中 GM-CSF 的含量，并作部分修改。
<ol>
	<li>用捕获抗体包被ELISA板。将外泌体富集的EVs（0.6 µg）溶于PBS或含0.05% Tween-20的PBS中（100 µL），室温处理30分钟。将处理后的样品加入包被好的ELISA板中，室温孵育1小时。用PBS或含0.05% Tween-20的PBS洗涤平板。</li>
	<li>向样品中加入检测抗体，室温孵育1小时。用PBS或含0.05% Tween-20的PBS洗涤平板。向样品中加入链霉亲和素-HRP，室温孵育30分钟。再次用PBS或含0.05% Tween-20的PBS洗涤平板。</li>
	<li>使用酶标仪在450 nm处测定吸光度，以确定外泌体富集EVs中GM-CSF的浓度。</li>
</ol>

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Kavitha Yaddanapudi、Chi Li 和 John W. Eaton 提交了一项美国专利申请：“包含工程化胚胎干细胞来源的外泌体的组合物及其使用方法”。

本研究展示了一种高效制备富含外泌体（exosome-enriched EVs）并携带免疫刺激蛋白GM-CSF的方法，可用于研究富含外泌体的EVs在免疫调节方面的作用。多项研究表明，外泌体具有免疫调节和抗肿瘤功能22。因此，表达GM-CSF的胚胎干细胞（ESC）来源的外泌体也可能具有调节免疫反应的生物学活性。在本实验方案中，通过转染技术在小鼠ES-D3细胞中稳定过表达外源性小鼠GM-CSF（图1）。重要的是，在过表达GM-CSF的ES-D3细胞所分离出的富含外泌体的EVs中，检测到大量GM-CSF蛋白（图5）。
这些数据表明，几乎所有GM-CSF均存在于外泌体富集的细胞外囊泡（EVs）中。作为一种细胞因子，大部分GM-CSF蛋白被分泌到细胞外11。与其他外泌体 cargo 物质（如mRNA、miRNA和蛋白质）类似，细胞质中的GM-CSF分子被包裹在多泡体（MVBs）的腔...

胚胎干细胞（ESCs）来源于着床前胚胎的囊胚阶段1。作为多能干细胞，ESCs 具有自我更新的能力，并可分化为任何类型的胚胎细胞。由于其显著的发育潜能和长期增殖能力，ESCs 在生物医学研究中具有极高的价值1。目前的研究工作主要集中于 ESCs 在多种重大病理疾病治疗中的潜力，包括糖尿病、心脏病和神经退行性疾病2,3,4。
已知包括胚胎干细胞（ESCs）在内的哺乳动物细胞会向细胞外环境释放大小不一的囊泡，这些细胞外囊泡（EVs）因其在细胞间通讯中的作用而具有多种生理和病理功能5。在不同亚型的EVs中，外泌体（exosomes）是当内体中间区室——多泡体（MVBs）与质膜融合时，由多种细胞类型释放到细胞外空间的小型膜性囊泡6。已有研究报道，外泌体介导细胞间通讯，并在多种（病理）生理过程中发挥关键作用7,8。外泌体继承了其亲代细胞的部分生物学功能，因为其含有来自细胞质的生物分子，包括蛋白质和核酸。因此，针对特定疾病激发免疫反应的相关抗原或因子可被包裹于特定类型细胞来源的外泌体中9。这为探索肿瘤来源的外泌体作为抗肿瘤疫苗的临床试验奠定了基础10。
GM-CSF 是一种由多种类型免疫细胞分泌的细胞因子11。越来越多的证据表明，GM-CSF 能够激活并调节免疫系统，在抗原呈递过程中发挥关键作用12。例如，一项临床研究报告指出，GM-CSF 作为疫苗佐剂可刺激机体对肿瘤的免疫应答13。目前已有多种基于 GM-CSF 的癌症免疫治疗策略，旨在利用 GM-CSF 强效的免疫刺激活性，并已在临床试验中得到研究验证14。其中，一种由经辐照后可分泌 GM-CSF 的肿瘤细胞组成的癌症疫苗，在晚期黑色素瘤患者中显示出一定前景，能够诱导细胞免疫和体液抗肿瘤反应，进而导致转移性肿瘤发生继发性坏死15。
由于胚胎干细胞（ESCs）来源的外泌体具有与原始胚胎干细胞相似的生物学活性，因此携带粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）的胚胎干细胞外泌体可能作为无细胞囊泡来调节免疫反应。本文描述了一种从表达GM-CSF的胚胎干细胞中制备高质量外泌体富集型细胞外囊泡（EVs）的详细方法。这些外泌体富集的EVs有望作为免疫调节性囊泡，用于调控免疫反应。

<table><tbody><tr><td>小牛肠碱性磷酸酶</td><td>New England Biolabs</td><td>M0290S</td><td>质粒DNA去磷酸化</td></tr><tr><td>抗Annexin V单克隆抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>克隆H-3, sc-74438</td><td>Western blot, RRID:AB_1118989</td></tr><tr><td>抗CD81单克隆抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>克隆B-11, sc-166029</td><td>Western blot, RRID:AB_2275892</td></tr><tr><td>抗细胞色素c单克隆抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>克隆A-8, sc-13156</td><td>Western blot, RRID:AB_627385</td></tr><tr><td>抗Flotillin-1单克隆抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>克隆C-2; sc-74566</td><td>Western blot, RRID:AB_2106563</td></tr><tr><td>抗GAPDH多克隆抗体</td><td>Rockland</td><td>600-401-A33S</td><td>Western blot, RRID:AB_11182910</td></tr><tr><td>辣根过氧化物酶标记的抗小鼠IgG山羊抗体</td><td>Thermo Fisher</td><td>31430</td><td>Western blot, RRID:AB_228307</td></tr><tr><td>抗氧化磷酸化复合物IV亚基IV（COX IV）单克隆抗体</td><td>Thermo Fisher</td><td>克隆20E8C12 A21348</td><td>Western blot, RRID:AB_221509</td></tr><tr><td>抗蛋白二硫键异构酶（PDI）多克隆抗体</td><td>Enzo</td><td>ADI-SPA-890</td><td>Western blot, RRID:AB_10616242</td></tr><tr><td>辣根过氧化物酶标记的抗兔IgG山羊抗体</td><td>Thermo Fisher</td><td>31460</td><td>Western blot, RRID:AB_228341</td></tr><tr><td>BCA（双辛可宁酸）蛋白定量试剂盒</td><td>Thermo Fisher</td><td>23223</td><td>测定蛋白质浓度</td></tr><tr><td>Bis-Tris PAGE凝胶，ExpressPlus，4-20%</td><td>Genscript</td><td>M42015</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>羧苄青霉素二钠盐</td><td>Thermo Fisher</td><td>10177012</td><td>筛选&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt;菌落</td></tr><tr><td>Avanti J-26 XPI离心机</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>低速离心</td></tr><tr><td>JA-10离心转子</td><td>Beckman Coulter</td><td>09U1597</td><td>低速离心</td></tr><tr><td>Nalgene PPCO离心瓶</td><td>Thermo Fisher</td><td>3120-0500PK</td><td>低速离心</td></tr><tr><td>带碳支持膜的铜网</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>FF200-Cu</td><td>获取透射电子显微镜图像</td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0101</td><td>质粒DNA酶切</td></tr><tr><td>增强型化学发光检测系统</td><td>Thermo Fisher</td><td>32106</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>FACScalibur流式细胞仪</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td>检测ES-D3细胞中GFP表达水平</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>ATCC</td><td>SCRR-30-2020</td><td>ES-D3细胞培养基</td></tr><tr><td>Fisherbrand无菌细胞筛，孔径：40&amp;mu;m</td><td>Thermo Fisher</td><td>22-363-547</td><td>过滤ES-D3细胞用于FACS分选</td></tr><tr><td>明胶（0.1%）</td><td>Thermo Fisher</td><td>ES006B</td><td>ES-D3细胞培养</td></tr><tr><td>GM-CSF ELISA试剂盒</td><td>Thermo Fisher</td><td>88733422</td><td>测定GM-CSF浓度</td></tr><tr><td>KnockOut Dulbecco&amp;rsquo;s改良Eagle&amp;rsquo;s培养基</td><td>Thermo Fisher</td><td>10-829-018</td><td>ES-D3细胞培养基</td></tr><tr><td>白血病抑制因子</td><td>Thermo Fisher</td><td>ESG1106</td><td>ES-D3细胞培养基</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>VWR</td><td>VWRL0131-0100</td><td>ES-D3细胞培养基</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000转染试剂</td><td>Thermo Fisher</td><td>11668019</td><td>转染ES-D3细胞</td></tr><tr><td>Microplate读板仪，PowerWave XS</td><td>BioTek</td><td></td><td>测定GM-CSF浓度</td></tr><tr><td>MoFlo XDP高速细胞分选仪</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>分离单个ES-D3细胞克隆</td></tr><tr><td>NEB 5-alpha感受态E. coli</td><td>New England Biolabs</td><td>C2988J</td><td>构建GM-CSF表达质粒</td></tr><tr><td>新霉素</td><td>Thermo Fisher</td><td>10-131-035</td><td>筛选ES-D3细胞克隆</td></tr><tr><td>非必需氨基酸</td><td>Thermo Fisher</td><td>SH3023801</td><td>ES-D3细胞培养基</td></tr><tr><td>脱脂奶粉</td><td>Thermo Fisher</td><td>NC9022655</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Opti-MEM I低血清培养基</td><td>Thermo Fisher</td><td>31985062</td><td>转染ES-D3细胞</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>获取透射电子显微镜图像</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>VWR</td><td>sc45000-652</td><td>ES-D3细胞培养基</td></tr><tr><td>质粒pEF1a-FD3ER-IRES-hrGFP</td><td>Addgene</td><td>37270</td><td>构建GM-CSF表达质粒</td></tr><tr><td>PVDF膜</td><td>Millipore EMD</td><td>IPVH00010</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep试剂盒（250）</td><td>QIAGEN</td><td>27106</td><td>构建GM-CSF表达质粒</td></tr><tr><td>QIAquick凝胶回收试剂盒（50）</td><td>QIAGEN</td><td>28704</td><td>构建GM-CSF表达质粒</td></tr><tr><td>Quick Ligation连接试剂盒</td><td>New England Biolabs</td><td>M2200S</td><td>构建GM-CSF表达质粒</td></tr><tr><td>透射电子显微镜</td><td>Hitachi</td><td>HT7700</td><td>获取透射电子显微镜图像</td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>VWR</td><td>45000-660</td><td>ES-D3细胞培养</td></tr><tr><td>OptimaTM L-100 XP超速离心机</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>高速离心</td></tr><tr><td>45Ti超速离心转子</td><td>Beckman Coulter</td><td>09U4454</td><td>高速离心</td></tr><tr><td>聚碳酸酯超速离心管</td><td>Beckman Coulter</td><td>355622</td><td>高速离心</td></tr><tr><td>UranyLess染色液</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>22409</td><td>获取透射电子显微镜图像</td></tr></tbody></table>

从胚胎干细胞中分离富含粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的外泌体富集型细胞外囊泡

Isolation of Exosome-Enriched Extracellular Vesicles Carrying Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor from Embryonic Stem Cells

胚胎干细胞（ESCs）是一类具有自我更新能力并能分化为所有类型胚胎细胞的多能干细胞。与其他多种细胞类似，ESCs 会向细胞外环境释放小的膜性囊泡，例如外泌体。外泌体作为细胞间通讯的重要介质，在多种（病理）生理过程中发挥基础性作用。粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）作为一种细胞因子，可调节免疫应答。外泌体中存在 GM-CSF 可能增强其免疫调节功能。本研究中，GM-CSF 在小鼠胚胎干细胞系 ES-D3 中实现了稳定过表达。我们建立了一种从过表达 GM-CSF 的 ES-D3 细胞中分离高质量外泌体富集型细胞外囊泡（EVs）的实验方案。通过多种实验方法对外泌体富集型 EVs 进行了表征。重要的是，在外泌体富集型 EVs 中检测到大量 GM-CSF 的存在。总体而言，携带 GM-CSF 的胚胎干细胞来源的外泌体富集型 EVs 可能作为无细胞囊泡发挥其免疫调节功能。

在小鼠 ESCs 中 GM-CSF 过表达。 
为了在 ES-D3 细胞中稳定过表达 GM-CSF，将小鼠 GM-CSF cDNA 克隆至转染载体中，构建表达载体 pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP（图 1A）。通过转染在 ES-D3 细胞中实现 GM-CSF 的过表达，约 20% 的瞬时转染 ES-D3 细胞呈 GFP 阳性。通过 FACS 获得稳定过表达 GM-CSF 或空载体对照的细胞克隆。如 图 1B 所示，表达 GM-CSF 的 ES-D3 细胞系或表达空载体的 ES-D3 细胞系的 GFP 荧光强度明显高于其亲本细胞。采用 ELISA 检测不同细胞系培养上清液中的 GM-CSF 浓度（图 2）。表达 GM-CSF 的 ES-D3 细胞在培养上清液中产生的 GM-C...

本研究描述了一种从胚胎干细胞中分离富含携带免疫刺激性粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的外泌体富集型细胞外囊泡的方法。

胚胎干细胞（ESCs）是一类具有自我更新能力并能分化为所有类型胚胎细胞的多能干细胞。与其他许多细胞类型相似……

本方案可用于从表达免疫刺激因子 GM-CSF 的胚胎干细胞中制备高质量的外泌体富集型细胞外囊泡。携带 GM-CSF 的外泌体富集型细胞外囊泡，有望作为无细胞的免疫调节囊泡，用于调控免疫反应。具备基础分子与细胞生物学实验技能的研究人员均可轻松应用本方案；但首次操作本方案的人员应严格遵循操作步骤进行。由于我们的实验方案较为复杂，以可视化方式呈现每一步的精细操作细节将有助于其他研究人员。为制备无外泌体的胎牛血清（FBS），需对所需体积的FBS进行超速离心，并收集无外泌体的上清液。在接种ESD-3细胞前，使用0.1%明胶在室温下孵育15厘米组织培养皿30分钟进行包被。通过抽吸去除明胶，随后将ESD-3细胞接种于ESD-3细胞培养基中，在37°C、含5%二氧化碳的湿化培养箱中培养，无需饲养层细胞，直至细胞融合度达到90%。用每皿5毫升0.05%胰蛋白酶洗涤接近融合的细胞培养物，随后在新鲜胰蛋白酶中于37摄氏度孵育5分钟。孵育结束后，将脱落的细胞收集至离心管中，并加入5毫升新鲜培养基以灭活胰蛋白酶。通过离心沉淀细胞，然后将沉淀物重新悬浮于新鲜培养基中进行计数。传代时，将5×10⁶个ESD-3细胞接种至含15毫升细胞培养基的新明胶包被培养皿中，培养3天后再进行继代培养。为收集细胞培养上清液以分离富含外泌体的细胞外囊泡，每块新的明胶包被培养皿中接种1×10⁷个ESD-3细胞，加入15毫升细胞培养基，培养3天后收集细胞培养上清液。在进行富含外泌体的细胞外囊泡分离时，首先对来自72小时培养的ESD-3细胞的上清液进行离心，以沉淀其中的大细胞碎片。收集上清液后，将样品进行超速离心，并弃去上清液。每次用一毫升磷酸盐缓冲液（PBS）轻轻冲洗沉淀物两次，以去除任何残留的培养上清液，并根据制造商说明书，采用二辛可宁酸法（Bicinchoninic acid assay）定量外泌体富集的细胞外囊泡蛋白含量。然后将外泌体富集的细胞外囊泡重新悬浮于磷酸盐缓冲液（PBS）中，浓度为每微升6微克，于-80摄氏度保存。为通过透射电子显微镜观察富含外泌体的细胞外囊泡，将每毫升含3至5微克的细胞外囊泡与终浓度为2%的电镜级多聚甲醛在室温下固定2小时。孵育结束后，取10微升固定后的样品滴加于带有碳支持膜的铜网上，作用1分钟后用滤纸吸去多余液体，随后根据制造商说明书加入适当的染色液对铜网进行染色，并用镊子将铜网转移至一片滤纸上。最后，按照标准操作流程，使用50,000倍放大倍率的透射电子显微镜采集电镜图像。为制备全细胞提取物，从培养物中收集ESD三细胞，用PBS重悬收获的细胞并进行计数。经过第二次离心后，将细胞重悬于含有0.5% SDS浓度的SDS-PAGE上样缓冲液中，细胞浓度为每微升5 × 10³个细胞，并在超声破碎仪上以10%的振幅超声处理10秒。然后将样品在100摄氏度下加热5分钟。为制备用于外泌体富集的细胞外囊泡的裂解液，将外泌体富集的细胞外囊泡重悬于含有0.5% SDS的SDS-PAGE上样缓冲液中，浓度为1.2微克/微升，按上述方法超声处理10秒，随后在100摄氏度下加热5分钟。进行蛋白质印迹分析时，将10 µL粗提物以及外泌体富集的细胞外囊泡裂解液样品分别加入最佳变性PAGE凝胶的各个加样孔中。电泳结束后，将蛋白质转移至PVDF膜上，并用相应的特异性一抗和二抗孵育膜，然后根据制造商说明书，使用增强型化学发光检测试剂盒检测蛋白表达水平。为评估外泌体富集的细胞外囊泡中GM-CSF的含量，可使用小鼠GM-CSF检测试剂盒，用抗GM-CSF捕获抗体包被ELISA板；随后，将0.6 µg外泌体富集的细胞外囊泡样品分别与100 µL PBS，或含0.05% Tween 20的PBS在室温下处理30分钟。孵育结束后，将处理后的样品加入已准备好的ELISA板的各个孔中，在室温下孵育1小时，随后用PBS或含0.05% Tween 20的PBS洗涤相应孔。洗涤后，向样品中加入检测抗体，在室温下孵育1小时，再用PBS或含0.05% Tween 20的PBS进行洗涤。然后向样品中加入亲和素-辣根过氧化物酶（Avidin Horseradish Peroxidase），在室温下孵育30分钟，再次洗涤后，使用酶标仪在450纳米波长下测定各孔的吸光度。表达GM-CSF的ESD三细胞系或表达空载体的ESD三细胞系的GFP荧光强度明显高于其亲本细胞系。ELISA 检测显示，表达 GM-CSF 的 ESD three 细胞在其细胞培养上清液中产生的 GM-CSF 水平显著高于空载体对照细胞。此外，表达 GM-CSF 的 ESD three 细胞所产生的 GM-CSF 量与表达 GM-CSF 的 STO 成纤维细胞相当。对来自载体转导和 GM-CSF 转导细胞培养物中分离出的细胞外囊泡进行透射电子显微镜观察，结果显示存在不同大小的囊泡，其直径均在预期的 30 至 100 纳米范围内。通过Western blot分析发现，与全细胞裂解物相比，从ESD三个细胞中分离出的细胞外囊泡中外泌体标志物（包括CD81、Annexin V和flotillin-1）的表达显著增强。重要的是，在ESD三个细胞来源的细胞外囊泡中未检测到其他亚细胞结构标志物，包括内质网标志物蛋白二硫键异构酶（Protein Disulfide Isomerase）、线粒体标志物细胞色素C（cytochrome C）和氧化磷酸化复合物IV亚基IV（Oxphos complex IV-subunit IV），以及胞质标志物GAPDH。用0.05% Tween 20洗涤后，对照组细胞外囊泡中检测到的背景GM-CSF水平显著降低。相比之下，表达GM-CSF的细胞所分泌的细胞外囊泡中，GM-CSF水平在添加吐温20后显著升高。获取富含携带GM-CSF的外泌体的高质量细胞外囊泡，是本实验方案成功最关键的一步。研究人员可进一步开展其他实验，例如在依赖GM-CSF的细胞系和动物模型中进行研究，以确定富含携带GM-CSF的外泌体的细胞外囊泡是否可作为无细胞的免疫调节囊泡发挥作用。这些富含外泌体的细胞外囊泡可用于研究免疫反应的调节如何影响不同的疾病状态。

isolation-exosome-enriched-extracellular-vesicles-carrying

Research

科研

JoVE Journal

Cancer Research

癌症研究

分离外体富集的细胞外囊泡携带颗粒细胞-巨噬细胞-胚胎干细胞的细胞外刺激因子

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基于SEC的分离小胶质细胞来源细胞外囊泡技术：从小胶质细胞条件培养基中分离细胞外囊泡的方法

关键词：SEC，小胶质细胞，细胞外囊泡，条件培养基，分离方法

本方案展示了如何从细胞培养基中纯化细胞外microRNA，用于小RNA文库构建及下一代测序。文中描述了多种质量控制检查点，帮助读者了解在处理低丰度样本（如exRNA）时的预期结果。...

分离、测序与分析人源间充质干细胞的细胞外微小RNA

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人脐带血干细胞来源外泌体处理后单核细胞向表型不同的巨噬细胞分化

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利用尺寸排阻色谱法从细胞条件培养基中分离细胞外囊泡

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一种简易台式过滤法从人源间充质干细胞分离小细胞外囊泡

本方案描述了通过差速离心法从培养的人源间充质干细胞（MSCs）中分离和表征典型细胞外囊泡（EVs，包括外泌体和微囊泡）的方法。本文还介绍了这些细胞外囊泡的进一步应用。...

从培养的人源间充质干细胞中分离、表征及治疗性应用细胞外囊泡

本文介绍一种磁分离辅助的高速均质化方法，用于大规模制备来源于内体的纳米囊泡，作为一种新型的外泌体模拟物（EMs），其具有与天然细胞外囊泡（EVs）相同的生物学来源，以及相似的结构、形态和蛋白质组成。...

一种磁分离辅助的高速均质化方法用于大规模制备内体来源囊泡

最近研究发现，骨肉瘤中的肿瘤干细胞（CSCs）与其发病机制相关。本文介绍了从常规骨肉瘤（OS）患者活检组织获得的原代细胞培养物中分离CSCs的方法，该方法基于CSCs在非黏附条件下生长的能力。...

建立人传统型骨肉瘤的肿瘤干细胞培养

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学习从胚胎干细胞中分离富含外体的细胞外囊泡并携带粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的方法。该方案可生产高质量免疫调节囊泡，用于细胞外免疫治疗研究。

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