在皮下肿瘤模型的评估肿瘤浸润白细胞亚群

以下实验的总体目标是对小鼠皮下肿瘤模型中的浸润白细胞进行详细分析。这是通过首先接种来自雌性 C 57 BL 6 小鼠的小鼠 B 16 F 零黑色素瘤细胞以在体内建立生长的肿瘤来实现的。接下来 B 16，对荷瘤小鼠实施安乐死，并切块切除皮下肿瘤，包括上覆和周围皮肤。

然后分离出肿瘤细胞和肿瘤浸润白细胞的单细胞悬液，然后可以通过流式细胞术进行分析。最后，确定单位体积的活细胞产量，并计算要染色和事实分析的细胞数量。最终，流式细胞术用于显示肿瘤微环境中白细胞亚群的频率和类型。

这项技术的影响延伸到癌症的治疗或诊断，因为人们可以评估治疗对肿瘤微环境中白细胞的影响。正是这种效应细胞和抑制细胞的平衡有助于确定肿瘤是生长还是消退以诱导肿瘤生长。根据文本方案，在雌性 C 57 BL 6 小鼠腹部中线或附近的生理缓冲液（例如磷酸盐缓冲盐水）中皮下接种小鼠 B 16 F 零黑色素瘤细胞，7 至 14 天后，就在切除肿瘤之前，每个肿瘤设置一个 50 毫升锥形管并置于冰上。

将 40 至 70 微米的细胞悬浮过滤器插入每根试管中。准备手术钳并找到剪刀进行切除和 70% 乙醇清洁肿瘤样本之间的器械对 B 16 荷瘤小鼠实施安乐死后，根据文本方案，将小鼠固定在手术阶段，使用 70% 乙醇喷洒肿瘤区域并擦去通路以防止毛发扩散。在使用镊子和剪刀切除肿瘤之前，确保局部乙醇被完全擦拭和蒸发，切开皮下肿瘤，包括上覆皮肤和周围大约 2 到 3 毫米的皮肤。

称量有和没有周围皮肤的切除肿瘤，并将每个切片放入锥形管中的过滤器中。要制备单细胞肿瘤悬液，请使用镊子和剪刀将肿瘤和上覆和周围的皮肤切碎，直到所有大块组织都加工成 1 到 2 毫米的切片。接下来，使用一次性 5 或 10 毫升注射器的柱塞，将切碎的肿瘤组织机械地分解到固定的过滤器上。

然后用移液器人和 5 到 10 毫升的冷、中或缓冲液。清洗处理过的肿瘤组织。这将通过过滤器刷新单个单元格。

重复分解和洗涤步骤数次，确保洗涤的总数和体积大致相同对于相似大小的肿瘤。清洗组织后，确认过滤器中留下了皮肤和/或其他结缔组织的小碎片，以便清洗和沉淀细胞，添加培养基，并在 500 G 和 4 摄氏度下离心 5 分钟。要进行传真分析，请使用冰冷的传真缓冲区重新悬浮细胞。

然后，使用 trian blue 和血细胞计数器计数，活细胞确定每体积的活细胞总数，用于推断肿瘤浸润白细胞的绝对数量，或结合事实进行耕作。来自 trian 染色计数数据的数据计算要染色的细胞体积的事实。例如，如果 TIL 通常占肿瘤细胞总数的 5%，则将其计入待染色的悬浮肿瘤细胞总数中。

对细胞进行染色以进行活死细胞鉴别。使用可固定或不可固定的染色剂，例如碘化丙啶。然后使用含 1% 大鼠血清和 FC 封闭剂的 PBS 中的 FBS 封闭细胞 10 分钟，然后使用标准事实染色方案对细胞悬液进行特定白细胞亚群染色。

染色后，使用 4% 多聚甲醛固定样品，并在 4 摄氏度下避光储存，直到收集和分析。使用流式细胞仪收集有事实的样品。数据分析软件首先设门死细胞，然后使用针对白细胞特异性标志物（如抗 CD 45）的抗体识别活细胞内的白细胞。

接下来，使用各种门控方案根据文本协议标识特定子集。分析数据并以多种方式呈现，以确保一致性并识别模式或趋势，如下所示。与该图中的对照组相比，在第 17 天切除的小鼠 B 16 肿瘤中强制过表达 kein 导致 CD 45 阳性细胞总数显着增加，对冷冻切片的 B 16 肿瘤进行免疫荧光检测。

证实肿瘤浸润 CD 45 阳性细胞增加。对传真数据的进一步分析显示，NK 细胞、T 细胞和常规 CD 11 C 阳性树突状细胞的平均相对增加。与对照肿瘤相比，在 kein 过度表达的肿瘤中，免疫抑制白细胞的百分比也相对降低，包括髓源性抑制细胞和浆细胞样树突状细胞。

研究表明，肿瘤内白细胞亚群的比例可能是肿瘤生长和临床结果的重要因素，为了支持这一点，与对照组相比，每个肿瘤的 CD 三阳性 T 细胞和 NK 细胞的数量越来越多地出现在表达 kein 的肿瘤中。该图显示，在肿瘤微环境中效应细胞群和抑制细胞群的直接比较中，在 kein 表达肿瘤中效应细胞群与抑制细胞群的比率显着增加。与对照组相比：请遵循此过程。

可以执行其他方法，如细胞分选或细胞分离，以回答解决肿瘤浸润白细胞功能的其他问题。