粪便（微量）RNA分离

我们提出了一种从粪便样品中分离 RNA 以研究 microRNA 的方案。该方案可用于从粪便中分离高质量和高数量的 RNA。它最大限度地减少了活微生物中的 RNA。

强调的是，该协议中不使用结合缓冲液。该协议简单明了。首先，将 25 至 100 毫克粪便样品重悬于 2 mL 微量离心管中的 600 μL 无菌 1X DPBS 中。

将装有样品的试管在室温下孵育 30 分钟。然后用 1 毫升移液器吸头捣碎混合物并充分涡旋。将混合物重悬于匀浆器中，以每分钟 4， 000 转的速度设置一个循环，持续 45 秒，以优化和增加 RNA 的数量和质量。

向样品中加入 600 微升酸性苯酚氯仿溶液，涡旋混合物 60 秒。或者，为了优化产量中增加的 RNA 量，将其与匀浆器混合。在室温下以 10， 000 x g 的离心力将样品离心 15 分钟，以分离水相和有机相。

重复离心，直到界面紧凑。小心地将上层水相转移至带铰链盖的新 2 mL 微量离心管中，不要干扰下层水相。以 1.25 倍获得的水相体积加入 ACS 级 100% 乙醇，涡旋 3 秒钟。

将滤芯放入收集管中。将每个样品加载到 microRNA 分离试剂盒中提供的滤筒中 600 μL。以 10， 000 x g 离心 90 秒，以通过小柱过滤混合物。

然后丢弃滤液。重复此作，直到在连续应用中通过同一滤膜过滤整个体积的混合物。毕竟，样品被过滤了。

将 700 μL microRNA 洗涤液 1 加入同一滤芯中。离心 60 秒，通过滤芯过滤洗涤液。弃去滤液，将滤芯放在同一个收集管上。

用 700 微升 ACS 级 100% 乙醇制备的 2/3 洗涤液清洗滤芯，并以 10， 000 x g 离心一分钟。弃去所得滤液，将滤芯放入同一管中。用 500 微升 2/3 洗涤液清洗滤筒，并以 10， 000 x g 离心一分钟。

弃去获得的滤液，将滤芯放入同一收集管中。用 250 微升 ACS 级 100% 乙醇制备的 2/3 洗涤液清洗滤芯，并以 10， 000 x g 离心一分钟。弃去获得的滤液，将滤芯放入同一收集管中。

最后，将滤芯转移到新的收集管中，并旋转组件 5 分钟以去除残留液体。将滤芯转移到新的收集管中，然后在过滤器中心加入 50 μL 无核酸酶的水并盖上管子。将试管在室温下孵育 10 分钟。

然后以 8， 000 x g 的离心速度旋转试管 5 分钟，以将 RNA 回收到新的收集管中。基于芯片的 RNA 电泳测定表明，来自小鼠和人粪便的代表性 RNA 分离物的 18S 和 28S rRNA 组成较低或缺乏，并且 RNA 分离物的大小位于小 RNA 区域。使用基于 ChIP 的电泳进行的进一步小 RNA 电泳显示，大部分 RNA 具有 microRNA 大小。

提取的 RNA 纯度很高，如 260 和 280 纳米波长的吸光度比值为 2.0 和 260 和 230 纳米的吸光度比值为 1.8 所示。为确保有机萃取成功，请确保表面明显，并且仅转移上层水相而不干扰下层水相，即使代价是减少水相的体积。