粪便（微量）RNA分离
October 28th, 2020
该协议从动物和人类受试者的粪便样本中分离出高质量的总RNA。商业 miRNA 分离试剂盒具有显著适应性，以优化数量和质量分离纯 RNA。RNA分离株适用于大多数下游RNA检测，如测序、微阵列和RT-PCR。
我们提出了一种从粪便样品中分离 RNA 以研究 microRNA 的方案。该方案可用于从粪便中分离高质量和高数量的 RNA。它最大限度地减少了活微生物中的 RNA。
需要强调的是，该协议中不使用结合缓冲液。该协议简单明了。首先，将 25 至 100 毫克粪便样品重悬于 2 mL 微量离心管中的 600 μL 无菌 1X DPBS 中。
将装有样品的试管在室温下孵育 30 分钟。然后用 1 毫升移液器吸头捣碎混合物并充分涡旋。将混合物重悬于匀浆器中，以每分钟 4， 000 转的速度设置一个循环，持续 45 秒，以优化和增加 RNA 的数量和质量。
向样品中加入 600 微升酸性苯酚氯仿溶液，涡旋混合物 60 秒。或者，为了优化产量中增加的 RNA 量，将其与匀浆器混合。在室温下以 10， 000 x g 的离心力将样品离心 15 分钟，以分离水相和有机相。
重复离心，直到界面紧凑。小心地将上层水相转移至带铰链盖的新 2 mL 微量离心管中，不要干扰下层水相。以 1.25 倍获得的水相体积加入 ACS 级 100% 乙醇，涡旋 3 秒钟。
将滤芯放入收集管中。将每个样品加载到 microRNA 分离试剂盒中提供的滤筒中 600 μL。以 10， 000 x g 离心 90 秒，以通过小柱过滤混合物。
然后丢弃滤液。重复此作，直到在连续应用中通过同一滤膜过滤整个体积的混合物。毕竟，样品被过滤了。
将 700 μL microRNA 洗涤液 1 加入同一滤芯中。离心 60 秒，通过滤芯过滤洗涤液。弃去滤液，将滤芯放在同一个收集管上。
用 700 微升 ACS 级 100% 乙醇制备的 2/3 洗涤液清洗滤芯，并以 10， 000 x g 离心一分钟。弃去所得滤液，将滤芯放入同一管中。用 500 微升 2/3 洗涤液清洗滤筒，并以 10， 000 x g 离心一分钟。
弃去获得的滤液，将滤芯放入同一收集管中。用 250 微升 ACS 级 100% 乙醇制备的 2/3 洗涤液清洗滤芯，并以 10， 000 x g 离心一分钟。弃去获得的滤液，将滤芯放入同一收集管中。
最后，将滤芯转移到新的收集管中，并旋转组件 5 分钟以去除残留液体。将滤芯转移到新的收集管中，然后在过滤器中心加入 50 μL 无核酸酶的水并盖上管子。将试管在室温下孵育 10 分钟。
然后以 8， 000 x g 的离心速度旋转试管 5 分钟，以将 RNA 回收到新的收集管中。基于芯片的 RNA 电泳测定表明，来自小鼠和人粪便的代表性 RNA 分离物的 18S 和 28S rRNA 组成较低或缺乏，并且 RNA 分离物的大小位于小 RNA 区域。使用基于 ChIP 的电泳进行的进一步小 RNA 电泳显示，大部分 RNA 具有 microRNA 大小。
提取的 RNA 纯度很高，如 260 和 280 纳米波长的吸光度比值为 2.0 和 260 和 230 纳米的吸光度比值为 1.8 所示。为确保有机萃取成功，请确保表面明显，并且仅转移上层水相而不干扰下层水相，即使代价是减少水相的体积。
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概述
该协议提供了一种从粪便样本中分离高质量RNA的简单方法，最大限度地减少了来自活微生物的污染。它适用于动物和人类对象，确保了下游应用的最佳产量和纯度。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 微生物学
- 分子生物学
背景
- 从粪便样本中分离RNA对于研究microRNA至关重要。
- 传统方法可能导致来自微生物RNA的污染。
- 高质量RNA对于准确的下游分析至关重要。
- 该协议适用于商用miRNA分离试剂盒以获得更好的结果。
研究目的
- 提供一种从粪便中提取RNA的可靠方法。
- 提高RNA分离物的质量和数量。
- 促进在各种生物学背景下对microRNA的研究。
使用的方法
- 在无菌1X DPBS中重新悬浮粪便样本。
- 使用两毫升微离心管进行处理。
- 改进商用miRNA分离试剂盒。
- 最大限度地减少来自活微生物的RNA污染。
主要结果
- 成功从粪便样本中分离出高质量总RNA。
- 优化的协议产生适合测序和RT-PCR的RNA。
- 证明了减少微生物RNA污染的有效性。
- 协议对研究人员来说简单明了。
结论
- 该协议提供了从粪便样本中提取RNA的可靠方法。
- 高质量RNA对于下游应用至关重要。
- 对商用试剂盒的改进可以提高RNA的产量和纯度。
常见问题
Executive Industry Relevance
Isolating high-purity RNA from fecal samples enables mechanistic de-risking in target validation by providing access to host-derived microRNAs without microbial contamination. This supports predictive confidence in biomarker discovery and pathway analysis for gastrointestinal and systemic diseases. The protocol’s scalability and reproducibility facilitate enterprise reuse across discovery and preclinical workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of host microRNA signatures in feces for therapeutic hypothesis testing and pathway clarification.
- Operational Value: Reduces mechanistic ambiguity by minimizing confounding signals from living microbes in sample preparation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces RNA isolates suitable for sequencing, RT-PCR, and microarray applications, enabling reliable compound screening readouts.
- Operational Value: Standardized washing steps and phase separation ensure reproducibility and scalability for high-throughput assay development.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports translational biomarker alignment by yielding disease-relevant small RNA profiles from animal and human fecal models.
- Operational Value: Facilitates continuity from discovery through preclinical validation with consistent RNA quality and quantity.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from Early Discovery to Lead Identification and Preclinical validation by providing a standardized input for omics and functional assays.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and biological de-risking by isolating host-derived RNA from complex fecal matrices.
- Screening: Enables assay readiness through high-yield, pure RNA outputs compatible with downstream analytical platforms.
- Analytics: Delivers quantitative RNA measurements with high purity (A260/A280 ~2.0, A260/A230 ~1.8) for accurate condition comparison.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity via species-agnostic application in mouse and human models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for fecal RNA isolation across multiple projects and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through reduced microbial contamination and enhanced target validation in host-microbiome studies.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability via optimized resuspension, washing, and filtration steps.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in biomarker-driven programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on reliable RNA-derived data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nucleic acid handling and phase separation techniques to avoid interphase disruption.
- Dependent on centrifugation equipment capable of 10,000 x g and homogenization at 4,000 rpm for sample processing.
- Necessitates cross-team standardization of sample mass limits (25–200 mg) to ensure consistent aqueous phase recovery.
- Adaptation considerations include adjusting wash volumes and incubation times for varying sample types and inhibitor loads.
- Practical limitation: samples exceeding 200 mg may compromise phase separation and RNA purity due to interface instability.
