Name: 使用 MALDI 质谱成像进行代谢分析的示例准备 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-22T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: 学习MALDI质谱成像技术进行代谢分析，掌握生物样本冷冻切片、基质喷涂及成像方法。该技术可无标记检测代谢物分布，适用于发育生物学和病理学研究。

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Ye He 和 Rinat Abzalimov 获得纽约市立大学专业职员协会（PSC-CUNY）研究奖项目的资助。Yuki Chen 和 Kelly Veerasammy 获得阿尔弗雷德·P·斯隆基金会纽约市立大学暑期本科生研究项目的资助。

本方案遵循纽约市立大学（CUNY）高级科学研究中心（ASRC）机构动物护理与使用委员会（IACUC）的指导原则。
1. 收集组织
<ol>
	<li>准备铝箔船。取一张10 cm × 20 cm的矩形铝箔，在中间对折形成10 cm的双层正方形。在一侧标记样品信息，将另一侧折叠成底部约为4 cm × 4 cm的船形。</li>
	<li>将载样舟置于液氮（LN₂）中预冷2在泡沫塑料箱中。 
	&#8203;注意：如果舟状容器过小，样品可能会从容器中脱落，并因直接接触液氮而过度冻结2这可能导致在冷冻切片过程中发生碎裂。</li>
	<li>根据机构IACUC指南，通过颈椎脱位法处死动物，立即解剖取出目标组织。
	<ol>
		<li>尽量缩短动物麻醉与快速冷冻之间的时间间隔，以最大限度减少组织取材过程中代谢物的改变，特别是由于死后缺血导致的脑组织中易变代谢物的变化。 
		注意：用磷酸盐缓冲液（PBS）灌注动物会延长缺血时间，进一步改变不稳定代谢物的浓度，并加剧人为假象结果。因此，除非在特定研究中血液或体液污染的影响比代谢物降解或被洗脱更为重要，否则不建议使用 PBS 进行组织灌注或洗涤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>立即将组织放入漂浮在液氮上的铝舟中，盖上泡沫箱盖子，根据组织大小冷冻2-10分钟：出生后第1天（P1）、P21、P60小鼠脑组织分别冷冻2分钟、5分钟、7分钟，P60大鼠脑组织冷冻10分钟。 
	注意：不要将组织长时间冷冻（例如，P1小鼠脑组织不超过5分钟），因为过度冷冻可能导致在冷冻切片过程中组织碎裂。</li>
	<li>用镊子取出样本船，折叠锡箔纸包裹组织，置于干冰上运输，并于 -80 °C 保存以备后续使用。若需立即切片，将样品置于干冰上运送至冷冻切片机。 
	&#8203;注意：为了更好地保存代谢物，建议将样品储存在完整的组织中，并在进行MALDI成像前立即进行切片。组织可在-80 °C下保存长达24个月。</li>
</ol>
2. 组织冷冻切片
注意：操作氧化铟锡（ITO）载玻片时务必始终佩戴手套。避免直接向载玻片呼气，或佩戴口罩（可选），以防止人体唾液污染组织切片。
<ol>
	<li>在切片组织之前，准备好所需数量的适用于基质辅助激光解吸电离（MALDI）的氧化铟锡（ITO）涂层玻璃载玻片。</li>
	<li>使用设置为电阻模式的电压表检测载玻片的导电性。标记出能测得电阻值的一侧：此侧为组织切片附着面。始终将载玻片放置在洁净的纸巾上，以避免污染。</li>
	<li>将载玻片预先冷却至设定温度为 -20 °C 的冷冻切片机中。</li>
	<li>若组织样本从 -80 °C 取出，根据组织大小，在冷冻切片机腔室内平衡约 45–60 分钟。若样本从干冰中取出，则平衡约 30 分钟。</li>
	<li>用 70% 乙醇彻底清洁冷冻切片机。将所有必要工具（包括细头画笔和镊子）预先冷却至冷冻切片机腔室内。</li>
	<li>根据组织类型设定冷冻切片机腔室和样本头的温度：肝脏为 -14 °C，肌肉为 -20 °C，皮肤为 -25 °C9。</li>
	<li>使用冷冻组织包埋剂 OCT 将组织固定在样本头（chuck）上，注意避免 OCT 覆盖目标区域。</li>
	<li>在切片台上安装洁净刀片并锁定。调整切片台位置和样本角度，以获得所需的切片角度。 
	注意：若需切取不同类型或基因型的组织，务必重新定位样本以使用刀片的洁净部分，或在切取下一个样本前更换新刀片，以防交叉污染。</li>
	<li>持续切片直至发现目标区域（例如脑中的胼胝体）。使用已在冷冻切片机中平衡过的画笔及时清除多余碎屑，保持切片台清洁。</li>
	<li>当目标区域暴露后，切取厚度为 10–12 µm 的较薄切片。若切片易碎或易脱落，可适当提高冷冻切片机温度，保持在 -22 °C 至 -11 °C 范围内。我们发现脑组织的最佳切片温度为 -15 °C 至 -18 °C。</li>
	<li>获得理想切片后，将其贴附于 ITO 载玻片上（操作在冷冻切片机腔室内进行）。</li>
	<li>使用画笔尖端将一片组织转移至 ITO 载玻片上。</li>
	<li>通过将手指置于载玻片下方轻微加热切片，以确保组织牢固贴附。组织切片会先在 5–10 秒内变为透明，随后在约 30–60 秒内转为不透明。</li>
	<li>小心将载玻片放置于冷冻切片机内暂存。</li>
	<li>对其他组织样本重复上述步骤，确保每一片组织&#160;均匀地放置在载玻片上，并尽可能对齐排列。</li>
	<li>由于 MALDI 目标板最多可容纳两张载玻片，因此可将同一批次多个样本的切片置于一张或两张载玻片上，以确保可同时进行分析。</li>
	<li>完成后，将 ITO 载玻片放入真空盒中，并转移至含有干燥剂的干燥器内。真空干燥 45–60 分钟。 
	注意：若实验室无真空干燥器，应始终将载玻片保存在 -20 °C 环境下，以防止代谢物降解。</li>
	<li>载玻片的储存与运输：除非样本由 MALDI 成像核心设施直接用于后续 MALDI 成像，否则应将载玻片储存于 -80 °C，或在干冰条件下运送至核心设施或其他 MALDI 研究实验室。</li>
	<li>为最佳保存样本，将载玻片放入载玻片运输盒中，可选择性充入氮气，用封口膜密封后放入自封袋，再将该自封袋放入另一个含有干燥剂的自封袋中。在外层自封袋上做好标签。</li>
	<li>随后进行 -80 °C 储存（最长可达 6 个月）或使用足量干冰进行运输。</li>
</ol>
3. 基质制备
<ol>
	<li>制备基质。 
	&#8203;注意：所有试剂必须为HPLC级。
	<ol>
		<li>配制浓度为10 mg/mL的NEDC。配制10 mL基质溶液，溶剂为70%甲醇（100 mg NEDC，7 mL甲醇，3 mL H2O）。</li>
		<li>另外额外配制10 mL 70%甲醇-水溶液，用于在填充基质前冲洗喷雾系统。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在步骤2.17完成切片脱水后，使用粗头银色标记笔在玻片上组织切片区域外的空白处标记一个&#34;X&#34;，然后使用细头黑色标记笔在银色&#34;X&#34;之上叠加标记一个黑色的&#34;x&#34;。黑色&#34;X&#34;在银色背景（粗体银色&#34;X&#34;）上具有高对比度，后续将作为MALDI仪器中质谱采集时的定位标记。</li>
	<li>将切片装入MALDI切片金属靶板中。使用塑料盖板，并在盖板上绘制或勾勒出样品所在位置。放置一旁备用。</li>
	<li>使用平板扫描仪对切片连同MALDI靶板进行成像扫描。靶板表面的螺丝可作为间隔物，防止扫描仪对组织切片造成损伤或污染。以16位灰度模式、2400 dpi分辨率预览并扫描选定的切片区域。保存图像以供后续MALDI质谱成像（MSI）使用。</li>
</ol>
4. 基质沉积
注意：在基质辅助激光解吸电离质谱（MALDI）载样片上施加一层均匀且晶体细小的基质有多种方法，包括升华法、液滴喷墨打印法、自动基质喷涂仪以及使用艺术家用喷笔进行手动喷涂9。本实验方案以自动基质喷涂仪为例，因其具有较高的可重复性。
<ol>
	<li>启动：打开基质喷雾仪，确保阀门处于LOAD位置，并启动喷雾软件。检查排风扇是否正常运行。若主动通风系统未正常工作，则不得启动溶剂泵。</li>
	<li>在Comms选项卡中确认所有组件通信正常，然后以0.1 mL/min的流速启动溶剂泵，背压约为500 psi（或3.4 MPa）。</li>
	<li>通过将氮气罐压力调至30 psi，启动基质喷雾仪的压缩空气供应。随后调节喷雾仪前端压力调节阀至10 psi，并根据需要设定喷嘴温度。 
	注意：若喷雾仪内气压低于5 psi，喷嘴将无法加热，从而失去保护功能。</li>
	<li>保持阀门仍处于LOAD位置，使用注射器以7 mL的70%甲醇冲洗进样环，然后用6 mL基质溶液充满进样环。</li>
	<li>将组织切片放入喷雾仪的载片架中，两端用胶带固定以防止移动，并保留无基质边缘，避免基质污染MALDI靶板上的金属夹具。 
	注意：强烈建议在处理珍贵样本切片前，先在空白载玻片上测试基质喷雾效果。</li>
	<li>检查流速和温度是否稳定，以开始喷雾。</li>
	<li>选择先前使用空白玻璃载片预测试过的喷雾方法。</li>
	<li>按下Start按钮。系统将自动设定喷嘴温度并调节泵流速以匹配所选方法。将阀门&#160;从Load切换至Spray位置，然后点击Continue确认。</li>
	<li>让系统运行，每张切片耗时约5–20分钟，具体时间取决于所选方法。喷雾完成后，将阀门从Spray切换回Load位置，并点击Continue确认。</li>
	<li>从喷雾仪中取出切片，在显微镜下观察基质覆盖模式，确保形成均匀的细小基质晶体层。</li>
	<li>基质沉积完成后，立即将切片放入金属MALDI样品托中使用。若仅有一张样本切片，需添加另一张空白切片以填满MALDI托的两个位置。</li>
	<li>使用后应立即按照制造商说明清洗系统，防止喷嘴堵塞。</li>
	<li>切片完成基质包被后，应立即送至MALDI成像仪器检测，或按照步骤2.19所述的双层密封袋方法，用干冰运输。 
	注意：在紧急情况下（如MALDI仪器无法立即使用），可将包被后的切片在真空条件下或-20 °C保存最多24小时，但部分代谢物可能在保存期间发生降解，此现象尚未被充分研究。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在竞争性财务利益。

基质辅助激光解吸电离成像（MALDI-MSI）是一种无标记成像技术，可使研究人员研究组织中多种生物分子及其修饰的分布情况，从而揭示病理学的分子基础。将MALDI-MSI与传统的液相色谱-质谱（LC-MS）方法结合用于组织分析，不仅能获得与传统组学工作流程相当的分子深度，还能保留这些信号在细胞网络中的空间关系。样品制备是MALDI-MSI中最关键的步骤，也是导致不同实验室所开展的代谢组学研究最终结果存在差异的主要原因4。本文提供了一套全面且实用的实验方案，旨在标准化基于MALDI-MSI的代谢组学分析样品制备流程，希望该方案&#160;能够惠及广泛的科研群体，助力其从基础生物学研究到转化医学研究的当前及未来工作中顺利实施MALDI-MSI技术。
在样品制备过程中，必须始终牢记所有预防措施，以尽量减少分子谱（包括丰度和空间分布）的变化，并避免污染。首先，应尽量缩短动物安乐死后与组织采集之间的时间，例如原位冷冻或采用微波固定加热的方式使脑组织中的酶失活，以降低死后缺血带来的影响4,5,6。其次，样品的速冻条件至关重要。冷冻不足会导致代谢物降解和丢失，而过度冷冻则会在冷冻切片过程中引起组织碎裂。冷冻时间应根据以往报道的研究先行测试确定，本文所展示的小鼠发育脑研究为啮齿类动物脑组织提供了参考依据。第三，在切割生物组织并将切片转移至ITO载玻片时，需要足够的操作经验。需特别注意的是，使用刷子从载物台上拾取切片时，应轻柔操作，仅让刷毛接触组织切片的边缘，以降低污染和切片碎裂的风险。应尽可能将切片在载玻片上展平，以防止在手指加热过程中发生卷曲。第四，在将切片贴附到ITO载玻片时，需确保整个切片牢固粘附于载玻片上，因为组织不同区域可能需要不同的手指加热时间。例如，脑肿瘤组织所需的加热时间比正常脑组织更长。贴附不良可能导致在MALDI-MS扫描过程中组织脱落或碎裂。需要注意的是，手指加热可能激活酶活性和代谢过程，从而导致代谢物出现人为假象性变化。第五，基质辅助激光解吸电离（MALDI）基质的精细且均匀沉积，对于获得准确的空间信息和强MALDI-MS信号具有重要作用。建议先在空白载玻片上测试基质喷涂效果，并在显微镜下观察晶体分布模式，确认覆盖均匀后再对珍贵的样品载玻片进行涂布。最后，由于不同研究人员在组织采集和载玻片制备过程中的操作速度存在差异，理想情况下应由同一名研究人员负责同一队列样品的制备，以最大限度减少实验变异。
上述方案详述了标准操作流程，可根据特定实验的需求进行调整。例如，通常用于样本冷冻切片的包埋剂OCT胶，还可进一步用作将组织固定到组织夹持器上的粘合胶（如上文所述研究中所示）。先前的研究表明，OCT中的聚合物成分会引起强烈的离子抑制14。然而，在某些情况下，若组织过于脆弱而无法在无聚合物凝胶支撑时进行切割，则必须使用包埋。为应对这些情况下可能出现的信号抑制问题，可在检测蛋白质或脂质时，用70%乙醇和95%乙醇依次洗涤组织，以去除残留的OCT；但该洗涤步骤不建议用于小分子代谢物的检测9。
基质辅助激光解吸电离质谱成像（MALDI MSI）在科研实验室和临床实践中的重要性日益凸显。例如，MALDI MSI 近期已被证明在蛋白质组学研究中具有实用价值，可用于表征生物体的表型功能状态15，也可作为微生物鉴定及相应疾病诊断的工具16。尽管 MALDI MSI 支持多种应用，但单独依赖该技术仍存在一些局限性，尤其是在区分相似物种或代谢物以及特异性靶标鉴定方面。另一个挑战是根据 MALDI MSI 信号对代谢物浓度进行定量。通常认为，MALDI MSI 谱图中的离子丰度与相应分子物种在组织切片中的空间分布（或相对丰度）之间具有良好的相关性。然而，必须始终牢记，离子强度与相应分子物种含量之间的关系受到多种因素的复杂影响，包括但不限于离子抑制效应、组织结构变化以及&#160;离子-分子反应17。可通过使用内标法实现 MALDI-MSI 中代谢物的绝对定量（µmol/g 组织）18。上述两个挑战通常通过将 MALDI MSI 与液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术联用的工作流程加以解决，其中 MALDI-MS 可用于定位感兴趣区域，随后对该区域进行微萃取并采用 LC-MS/MS 进一步分析，以提供更充分的信息用于代谢物鉴定19。
近年来，基于质谱的成像技术已发展成为对小分子代谢物进行成像的一种替代方法，用以补充以往的技术。随着基质辅助激光解吸电离质谱成像（MALDI MSI）技术的进步及其日益普及，预计MALDI成像将成为可视化小分子的新标准工具。在生物学背景下对脂质和内源性小分子（如神经递质和代谢物）进行成像，以及对外源性物质进行成像以支持新药研发，尤其受到关注。未来不久，随着MALDI MSI技术的应用，这三个领域预计将取得快速进展20。

代谢物是代谢过程中的中间产物或终末产物，包括核苷酸、氨基酸或有机酸、脂类等，是生物功能和生命过程的关键组成部分。代谢组学作为研究代谢物的科学，能够揭示这些分子之间的生物化学相互作用，并帮助理解其在基础研究、转化研究及临床研究背景下的作用。代谢物与生物体的表型密切相关，可提供细胞代谢过程中发生的生化活动信息1。因此，除了基因组学和蛋白质组学之外，代谢组学已成为理解生理与病理状态的重要工具。例如，代谢组学可用于阐明现有药物的作用机制及其耐受性。在药物研发中，外源性物质代谢有助于评估代谢物在不同物种中的活性或毒性，进而推动个体化医疗的发展2。尽管代谢组学应用广泛，但由于代谢物具有化学反应性强、结构异质性高以及浓度范围广等特点，其成像仍面临挑战3。此外，在组织样本采集过程中（如脑组织采集时的死后缺血），当组织内酶仍具有活性时，一些不稳定代谢物（包括高能化合物、葡萄糖、乳酸、糖酵解中间产物、戊糖旁路途径中间物、三羧酸循环中间物、磷脂、神经递质和信号分子）的浓度可能在数秒内发生变化，并在数分钟内持续演变4,5,6。为确保代谢组学数据的准确性，恰当且严谨的样本前处理至关重要7,8。目前用于检测代谢物的主要技术平台包括核磁共振（NMR）、酶学分析法和质谱法（含液相与气相色谱联用技术），其中质谱法将在下文进一步讨论。
基质辅助激光解吸电离质谱成像（MALDI-MSI）是一种先进的技术，可通过检测单个分子种类实现对复杂样品的分析。MALDI MSI 的优势在于能够快速、可重复地测定生物样品中的多种分子化合物。质谱成像技术进一步能够生成基于组织代谢物组成的图像，同时保留样品中代谢物的空间分布信息9。MALDI 能够在无需使用抗体标记、结构修饰或其他特殊试剂（如免疫染色中所用试剂）的情况下检测样品中的分析物，结合其在单次实验中监测数百种分子的能力，这些特点构成了质谱成像在代谢谱分析中的若干优势之一10,11。除了常用的基质（如 2,5-二羟基苯甲酸（DHB）和 9-氨基吖啶（9-AA））之外，近年来新发现的基质 N-(1-萘基)乙二胺二盐酸盐（NEDC）特别适用于多种低分子量代谢物的分析，进一步拓展了 MALDI MSI 在代谢谱分析中的应用12。
尽管MALDI质谱成像技术应用广泛，但仪器的高昂成本和实验操作的复杂性限制了其普及&#160;其在各个独立研究实验室中的广泛应用仍受限。因此，大多数基质辅助激光解吸电离质谱成像（MALDI MSI）研究依赖于共享的核心设施来开展。样品制备，包括载玻片处理和基质涂布，是MALDI MSI过程中最关键的步骤。然而，载玻片处理通常由各个研究人员在各自的实验室中完成，这可能导致后续MALDI MSI数据采集时出现潜在的变异。本文旨在提供一份详细的生物样品在进行MALDI MSI检测前的样品制备方案，并以发育中小鼠脑组织的代谢组学分析为例进行说明。

<table><tbody><tr><td>Andwin Scientific&amp;nbsp;Tissue-Tek CRYO-OCT 包埋剂</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>14-373-65</td><td></td></tr><tr><td>艺术家画笔 MSC #5 1/8 X 9/16 修剪红松鼠毛</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>50-111-2302</td><td></td></tr><tr><td>Autoflex speed MALDI-TOF 质谱系统</td><td>Bruker Daltonics Inc</td><td></td><td>MALDI-TOF 质谱仪</td></tr><tr><td>BD&amp;nbsp;带鲁尔锁头的注射器</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>14-823-16E</td><td></td></tr><tr><td>BD&amp;nbsp;Vacutainer 通用注射器针头</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>23-021-020</td><td></td></tr><tr><td>Bruker Daltonics&amp;nbsp;用于 MALDI 成像的载玻片</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>NC0380464</td><td></td></tr><tr><td>Drierite（含指示剂，8 目），ACROS Organics&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC219095000</td><td></td></tr><tr><td>Epson Perfection V600 照片扫描仪</td><td>Amazon</td><td>Perfection V600</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand&amp;nbsp;5 片装载玻片邮寄盒</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>HS15986</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand&amp;nbsp;数字自动量程万用表</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>01-241-1</td><td></td></tr><tr><td>FlexImaging v3.0</td><td>Bruker Daltonics Inc</td><td></td><td>Bruker 质谱成像分析软件</td></tr><tr><td>高效液相色谱级甲醇</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>MMX04751</td><td></td></tr><tr><td>高效液相色谱级水</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>W5-1</td><td></td></tr><tr><td>HTX M5 喷雾仪</td><td>HTX Technologies, LLC</td><td></td><td>自动加热基质喷雾仪</td></tr><tr><td>Kimberly-Clark Professional&amp;nbsp;Kimtech Science Kimwipes 精细任务擦拭纸</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>06-666A</td><td></td></tr><tr><td>MSC&amp;nbsp;Ziploc 冷冻袋</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>50-111-3769</td><td></td></tr><tr><td>N-(1-萘基)乙二胺二盐酸盐 (NEDC)</td><td>Millipore Sigma Aldrich</td><td>222488</td><td></td></tr><tr><td>SCiLS Lab (2015b)</td><td>SCiLS Lab</td><td></td><td>高级 MALDI MSI 数据分析软件</td></tr><tr><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;CryoStar NX50 冷冻切片机</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>95-713-0</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;Nalgene 透明聚碳酸酯经典设计干燥器</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>08-642-7</td><td></td></tr></tbody></table>

用于maldi质谱成像的代谢谱分析样品制备

Sample Preparation for Metabolic Profiling using MALDI Mass Spectrometry Imaging

代谢组学旨在鉴定和定量实验样品中存在的小分子和代谢物，已成为研究发育和疾病过程中生物学活动的重要工具。代谢组学方法&#160;被广泛应用于癌症、营养/饮食、糖尿病以及其他涉及代谢过程的生理和病理状态的研究中。本文推荐一种有助于代谢组学分析的有力工具——基质辅助激光解吸/电离质谱成像技术（MALDI MSI）。该技术能够在无需标记、结构修饰或使用免疫染色等特殊试剂的情况下原位检测代谢物，使其成为推动代谢组学相关方法学发展的一项独特技术。恰当的样品制备流程对于获得最佳结果至关重要，也是本文的重点内容。

代表性实验按照图1所示的工作流程进行。根据CUNY IACUC指南，采集出生后第1天、第21天和第60天（成年）的C57BL野生型小鼠脑组织，如上所述处理后，将组织置于漂浮于液氮上的铝制舟中，分别快速冷冻2、5和7分钟。冷冻组织在−15 °C条件下进行冷冻切片，样品头和切片室温度均设为−15 °C，切片厚度为10 µm。随后将组织切片轻轻转移至预冷的ITO涂层玻璃载片的导电面上，用于MALDI成像。贴附在ITO载片上的冷冻切片在室温下真空干燥45分钟，随后使用自动基质喷涂仪进行基质沉积。采用基质NEDC检测代谢物，基质溶液为10 mg/mL溶于甲醇/水（70/30, v/v），喷涂参数设置为流速0.1 mL/min，喷嘴温度75 °C，共喷涂12个循环，每循环间干燥5秒。喷涂速度为1300 mm/min，轨道间距2 mm，N2气体压力10 psi，气体流速3 L/min，喷嘴高度40 mm。
采用基质辅助激光解吸电离飞行时间（TOF）质谱成像（MSI）仪器在负离子模式下采集MALDI质谱数据。将0.5–1 µL红磷（Pn团簇，n = 1–90）的甲醇乳液点样于ITO载玻片上，紧邻贴附的组织样本，并用于在100–1000 m/z质量范围内通过二次校准曲线对仪器进行校准13。激光光斑直径聚焦为“中等”调制光束轮廓，光栅宽度为50 µm。在m/z 50至1000的质量范围内，以1000 Hz频率采集500次激光脉冲的质谱信号。记录质谱数据后，使用高级MALDI MSI数据分析软件进一步进行成像分析。离子图像采用均方根（RMS）归一化方法生成，质谱峰宽设置为±0.25 Da。
实验结果表明 图2 从MALDI质谱成像数据分析软件中展示每隔100道尔顿质荷比（m/z）区间选取的质谱图像，清晰呈现了从小分子代谢物到高分子量脂质的谱图鉴定实用性。每一行显示相应离子的热图，包含在出生后第1天、第21天和第60天采集的三种组织中特定代谢物种类的空间分布与谱图信息。针对每个代表性m/z值，通过分析其区域分布与离子丰度，可比较不同年龄间相应物种的相对含量。MALDI质谱成像技术的一个优势在于能够识别由m/z鉴定出的特定物种与发育关键阶段或特定解剖结构之间的特异性关联。某些代谢物在P1新生期富集（m/z 320.1），在P60成年期富集（m/z 846.5），或在各年龄阶段均匀分布（m/z 480.3）；其他分子种类则特异性富集于灰质（m/z 117.1；524.3；765.1）、白质（m/z 673.4；846.5）或脑脊液/脑室（m/z 239.0）图2A）。代表性代谢物的空间分布，包括次黄嘌呤（m/z 135.0）、N-乙酰-L-天冬氨酸（m/z 174.0）、花生四烯酸（m/z 303.2）以及多种脂质，如溶血磷脂酰乙醇胺 LPE (18:1)（m/z 478.3）、LPE(20:4)（m/z 500.3）、LPE (22:6)（m/z 524.3）、磷脂酰乙醇胺 PE (44:10)（m/z 838.5）、磷脂酰肌醇 PI(38:4)（m/z 885.6）也一并展示（图 2B).
<img alt="从冷冻切片到基质辅助激光解吸电离质谱的工作流程：组织切片、基质喷涂、数据采集、图像分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62008/62008fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1．基质辅助激光解吸电离飞行时间（TOF）质谱成像的工作流程。 快速冷冻的组织在恒温冷冻切片机中进行冷冻切片，并贴附于ITO导电载玻片上。→ 使用自动基质喷涂仪在带有组织切片的载玻片表面均匀喷涂一层精细的基质。→ 通过MALDI-TOF质谱成像（MSI）仪器以20–200 µm的光栅步长采集质谱数据。→ 利用先进的MALDI-MSI数据分析软件对数据进行分析并生成图像。比例尺：2 mm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62008/62008fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="质谱成像，m/z 离子分布，脑组织，分析结果，颜色编码图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62008/62008fig2v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 2"> 
图2。在50 µm空间分辨率下获得的质谱代表性输出及选定的m/z谱图。（A）热图显示了在出生后第1天（P1）、第21天（P21）和第60天（P60）三个发育阶段，每隔100道尔顿m/z区间所选特定代谢物种类的空间分布。（B）P1、P21和P60阶段代表性代谢物的空间分布，包括：次黄嘌呤、N-乙酰-L-天冬氨酸、花生四烯酸，以及不同种类的脂质，如溶血磷脂酰乙醇胺（LPE）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰肌醇（PI）。比例尺，500 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62008/62008fig2v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本实验方案的目的是在计划使用基质辅助激光解吸电离质谱成像（MALDI MSI）进行实验时，为样品制备提供详细的指导，以最大限度地提高生物样品中代谢物和分子的检测效果。

用于MALDI质谱成像的代谢谱分析样品制备

代谢组学，即对实验样本中存在的小分子和代谢物进行鉴定与定量的研究，已成为一种重要的工具，用于……

MALDI成像质谱技术是代谢组学领域的一项独特进展，使我们能够测量并可视化相对代谢物丰度及其分布情况，这些信息可反映生物体的生理和病理状态。MALDI成像的主要优势在于其能够在无需标记的情况下直接检测C2中的代谢物。在本实验演示中，由帕特里夏·卡西塔博士实验室的研究生Sami Sauma为您展示操作流程。Yuki Chen 和 Kelly Veerasammy，来自我实验室的学生研究人员。收获组织后，立即将其放入装有液氮、已冷却的铝箔船中，并置于聚苯乙烯盒内。盖上聚苯乙烯盒的盖子，根据组织大小冷冻 2 至 10 分钟。当组织充分冻结后，使用镊子取出包埋盒，并将包埋在铝箔中并置于干冰上的组织迅速转移至冷冻切片机。在切片前，注意不要向载玻片呼气。佩戴手套，并将万用表调至电阻模式，检测适量适用于基质辅助激光解吸电离（MALDI）分析的氧化铟锡涂层玻璃载玻片的导电性。标记后，将切片置于干净的纸巾上，并放入已用70%乙醇清洁且温度设定为零下20摄氏度的冷冻切片机中。将组织样本放入冷冻切片机内，并根据组织类型调节冷冻切片机腔体和样本头的温度。待组织平衡30分钟后，使用冷冻组织包埋剂将组织固定于样品头（chuck）上。将干净的刀片安装到切片机载物台上并固定，调整载物台位置和样本角度，以达到所需的切削角度。连续切片直至暴露出目标区域。当到达目标区域后，切取10至12微米厚的切片，使用预冷的毛笔迅速而小心地将每张切片收集到已标记的载玻片一侧。将手指置于载玻片下方以温热组织切片，确保切片牢固地贴附在载玻片上。切片将在5到10秒内变得透明，并在约30至60秒后变为不透明。当所有切片收集完毕后，将载玻片放入载玻片架中，并置于干冰上运送至干燥器。或者，可将载玻片放入真空盒中携带。将载玻片置于含有干燥剂的干燥器中，抽真空干燥45至60分钟。干燥后，若不立即使用，请将载玻片放入载玻片转运盒中，并用氮气充满转运盒。用Parafilm密封载片架，并将载片架放入自封袋中。然后将第一个自封袋放入第二个带有标签且内含干燥剂的自封袋中，于–80摄氏度条件下保存，最长可保存六个月。脱水后，使用粗头银色记号笔在组织切片区域以外的载片空白处标记X形记号，再用细头黑色记号笔在每个银色X形记号上叠加标记一个黑色X。将一张载片装入MALDI质谱金属靶板中，并在载片上覆盖塑料盖板。在塑料覆盖物上标出样品位置，将载玻片和MALDI靶板放置在平板扫描仪的表面。然后预览载玻片并选择所需区域。以16位灰度、2,400 dpi进行扫描，并将图像保存以供后续使用。为载玻片点样基质时，打开自动基质喷涂仪，确保阀门处于加载位置，并启动喷涂软件。检查排风扇是否正常工作，并在通信选项卡下确认系统通信正常。以约 500 psi 的背压，将溶剂泵的流速设为 100 µL/min 启动。启动氮气罐，将其压力设为每平方英寸30磅，以开始向基质喷雾器供应压缩空气。调节喷雾器前端的压力调节器至每平方英寸10磅，并根据需要设置喷雾器喷嘴温度。在阀门处于加载位置时，使用注射器用7毫升70%甲醇冲洗环路，然后用6毫升基质溶液填充环路。将一片空白的载玻片放入支架和喷雾器中，并用胶带固定两端以防止移动，检查流速和温度是否稳定。按下启动按钮，设置喷嘴温度并调节泵的流速，以匹配所选方法。将阀门从“加载”切换至“喷雾”，然后单击继续。让系统运行至完成。当沉积结束后，将阀门从喷雾切换至加载位置，然后点击继续。在显微镜下观察基质编码的模式。若观察到一层均匀的细密基质结晶，则按照上述方法将基质沉积到相应的样品载玻片上。当所有载玻片处理完毕后，应根据制造商的说明清洁系统，以防止喷雾器喷嘴堵塞。此处展示的是从每 100 道尔顿间隔中选取的质荷比信号所生成的 MALDI 质谱成像数据分析输出图像，清晰地体现了该技术在从小分子代谢物到高分子量脂质的谱图鉴定中的应用价值。每张图谱展示了特定代谢物在出生后第1天、第21天和第60天采集的三种组织中所对应的离子热图，包含其空间分布和光谱信息。MALDI质谱成像（MSI）技术的一个优势在于能够根据质荷比识别出的特定物种，判断其与发育阶段或特定解剖结构的相关特异性。在本分析中，某些代谢物被发现富集于出生后第1天的新生个体或出生后第60天的成年个体中，而另一些代谢物则在所检测的各个年龄段中呈均匀分布。其他分子物种被发现特异性富集于灰质、白质或脑脊液及脑室中。研究还分析了代表性代谢物的空间分布，包括次黄嘌呤、谷氨酸、N-乙酰天冬氨酸、花生四烯酸以及多种脂类。为保持代谢状态的真实性，适当的样本解剖、储存以及冷冻切片对于防止人为代谢变化至关重要。完成 MALDI 实验后，您可能需要验证所发现代谢物的身份。这可以通过微萃取结合液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）来实现。MALDI 质谱成像技术能够以空间分辨的方式促进基于代谢组学的研究，使研究人员有机会在定量且可视化的媒介中获取代谢数据。近年来，饮食对神经退行性疾病的影响，以及肠道微生物组与大脑之间的关系，受到了广泛关注。因此，从神经发育到神经退行性病变，代谢研究在神经科学中具有极其重要的意义。肠道-大脑相互作用是一个关键事实。在这一背景下，MALDI成像技术平台的理念能够提供卓越的技术，用于可视化特定干预对大脑可能产生的影响。

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