多肽基基质辅助激光解吸/电离质谱成像中福尔马林固定样品的优化制备工作流

该程序的总体目标是可重复地制备用于肽质谱成像的组织样品。这种方法允许新手质谱用户开发自己的成像质谱工作流程，而无需进行冗长的经验测定。该技术的主要优点是高度可重复、易于实施，并且使用经济高效的方法。

为了制备硝酸纤维素涂层载玻片，将 40 微升液态硝酸纤维素移液到导电铟锡氧化物显微镜载玻片的一个边缘。使用普通的玻璃显微镜载玻片，在表面张力下将硝酸纤维素拖过载玻片，以形成均匀的薄膜涂层。让硝酸纤维素在室温下干燥 20 秒，然后在室温下储存直到需要。

接下来，通过切割一张足够大的厚印迹纸来制作定制的均温板，以适合标准塑料培养皿的下半部分。剪纸，在中心留下一个矩形条带，其大小与显微镜载玻片相同。留下足够的多余部分，以便纸张在培养皿中保持其位置。

对于 FFPE 组织，按照文本方案中的说明，将切片浮选到硝酸纤维素预涂层的 ITO 载玻片上。将玻片浸入新鲜的二甲苯中，以去除残留的石蜡 2 分钟。将玻片浸入分级溶剂系列中，洗涤脱氢样品，该溶剂系列由 70% 体积的乙醇水溶液和 100% 乙醇组成，持续 30 秒。

然后，将玻片浸入 Carnoy 液中 2 分钟。最后，将玻片浸入一系列 100% 乙醇、超纯水和 100% 乙醇中，再次浸泡 30 秒。将样品载玻片装入塑料载玻片盒中，该载玻片盒顶部填充有 20 毫摩尔 tris HCO。

将盒子密封，放入盛有 500 毫升水的水浴中，让盒子接触浴槽底部。然后在压力锅中以 15 摄氏度加热盒子 120 分钟，可以达到 70 千帕斯卡的工作压力。取出载玻片，让它们冷却，然后在环境温度下干燥 15 分钟。

水解后，先将 10 μL 溶液移液到组织切片的边缘，在样品中涂上 10 μL 胰蛋白酶溶液和超纯水。然后，使用相同的移液器吸头，在表面张力下将液滴拖过组织的整个表面。让样品在环境温度下干燥后，用载玻片两侧的高压灭菌胶带将它们安装在先前构建的均温板顶部内。

小心地将 600 微升含有 100% 乙腈和 50 毫摩尔碳酸氢铵体积混合物的一比一体积的溶液移液到培养皿底部的吸墨纸手指上，直到手指看起来均匀湿润。移液至关重要，因为不正确的移液会导致基质和表面分析物离位，从而破坏样品中包含的空间信息。将均热板的上半部分放在下半部分，确保纸指和样品玻片完美对齐，并用石蜡膜密封均热板赤道周围的腔室。

将样品在 37 摄氏度的培养箱中放置过夜，以使其完全消化。消解后，将样品玻片放在五位数的微量分析天平上。将载玻片安装到升华装置的冷却指上，并按照与均温板相同的方式用铜胶带固定。

将 300 毫克 CHCA 基质放入腔室底部的玻璃培养皿中，均匀涂抹以形成一层薄薄的基质晶体。组装升华器。并用马蹄夹固定两半。

组装好的装置悬挂在预热至 220 摄氏度的沙浴上方 15 至 20 厘米处，将其放入连接到蒸馏架的金属环中。将腔室连接到真空源，接合真空，并使其稳定至约 25 毫托 5 分钟。将冷却指的顶部装满冰块，然后加入 50 毫升水。

让设备再静置 5 分钟，然后再继续。将腔室降低到支架表面，确保沙子完全接触腔室底部。放置 45 分钟，以形成每平方厘米 0.22 毫克的理想涂层。

45 分钟后，抬起金属环，将腔室从沙浴中取出，然后对腔室进行通风。升华后，像以前一样将样品载玻片安装在先前构建的均温板顶部内。小心地将 600 微升含有乙腈和三氟乙酸在水中体积混合物的一比一体积的溶液移液到培养皿底部的印迹纸上，以确保涂层均匀。

接下来，组装腔室，确保纸片和显微镜载玻片完美对齐。将腔室置于 37 摄氏度的培养箱中 1 小时。在平板扫描仪中扫描载玻片以创建数字图像。

将样品加载到质谱仪中，然后使用适当的软件平台进行分析。最后，按照文本协议中的说明分析样本。这里显示的是正确处理的组织标本，该标本以 50 微米成像，显示出良好的宏观结构以及白质和灰质之间的明显差异。

成功比较的样品将在不同的组织位置显示明显的分化。在这里，有一个明显的肽上调区域，由白质区域的质荷比 1， 085 表示，如白色区域所示。相比之下，这个制备不正确的样本显示出大规模的离域化。

三个面板中存在的分子模式清楚地表明，生物区域之间或所显示分子丰度的差异没有明确的定义。看完这个视频后，您应该对如何制备自己的样品进行肽成像分析有了一个很好的了解。通过适当的程序，该方法可以在 2 天内 8 小时内完成，从而允许过夜消化步骤。

在准备此方法时，在每个步骤中都要小心。组织发生的任何物理损伤都会破坏样品中包含的空间信息。当我们第一次开始自己的 IMS 空间调查时，我们就有了这种方法的想法，并意识到没有其他明确的方法被公布。

通过小的修改，我们的方法可以应用于蛋白质、肽、脂质和其他小分子的分析。在此程序之后，可以将其他组织学技术（如免疫荧光、苏木精和伊红染色）应用于您的样品，以获得成像质谱数据的参考点。在处理可能爆炸性的化学品（如液态硝酸纤维素）时，保持正确的安全程序非常重要。

最大限度地减少工作量并立即处理废物至关重要。