多肽基基质辅助激光解吸/电离质谱成像中福尔马林固定样品的优化制备工作流
January 16th, 2018
本协议描述了一种可重现且可靠的方法, 用于 sublimation-based 制备用于成像质谱的福尔马林固定组织。
该程序的总体目标是可重复地制备用于肽质谱成像的组织样品。这种方法允许新手质谱用户开发自己的成像质谱工作流程，而无需进行冗长的经验测定。该技术的主要优点是高度可重复、易于实施，并且使用经济高效的方法。
为了制备硝酸纤维素涂层载玻片，将 40 微升液态硝酸纤维素移液到导电铟锡氧化物显微镜载玻片的一个边缘。使用普通的玻璃显微镜载玻片，在表面张力下将硝酸纤维素拖过载玻片，以形成均匀的薄膜涂层。让硝酸纤维素在室温下干燥 20 秒，然后在室温下储存直到需要。
接下来，通过切割一张足够大的厚印迹纸来制作定制的均温板，以适合标准塑料培养皿的下半部分。剪纸，在中心留下一个矩形条带，其大小与显微镜载玻片相同。留下足够的多余部分，以便纸张在培养皿中保持其位置。
对于 FFPE 组织，按照文本方案中的说明，将切片浮选到硝酸纤维素预涂层的 ITO 载玻片上。将玻片浸入新鲜的二甲苯中，以去除残留的石蜡 2 分钟。将玻片浸入分级溶剂系列中，洗涤脱氢样品，该溶剂系列由 70% 体积的乙醇水溶液和 100% 乙醇组成，持续 30 秒。
然后，将玻片浸入 Carnoy 液中 2 分钟。最后，将玻片浸入一系列 100% 乙醇、超纯水和 100% 乙醇中，再次浸泡 30 秒。将样品载玻片装入塑料载玻片盒中，该载玻片盒顶部填充有 20 毫摩尔 tris HCO。
将盒子密封，放入盛有 500 毫升水的水浴中，让盒子接触浴槽底部。然后在压力锅中以 15 摄氏度加热盒子 120 分钟，可以达到 70 千帕斯卡的工作压力。取出载玻片，让它们冷却，然后在环境温度下干燥 15 分钟。
水解后，先将 10 μL 溶液移液到组织切片的边缘，在样品中涂上 10 μL 胰蛋白酶溶液和超纯水。然后，使用相同的移液器吸头，在表面张力下将液滴拖过组织的整个表面。让样品在环境温度下干燥后，用载玻片两侧的高压灭菌胶带将它们安装在先前构建的均温板顶部内。
小心地将 600 微升含有 100% 乙腈和 50 毫摩尔碳酸氢铵体积混合物的一比一体积的溶液移液到培养皿底部的吸墨纸手指上，直到手指看起来均匀湿润。移液至关重要，因为不正确的移液会导致基质和表面分析物离位，从而破坏样品中包含的空间信息。将均热板的上半部分放在下半部分，确保纸指和样品玻片完美对齐，并用石蜡膜密封均热板赤道周围的腔室。
将样品在 37 摄氏度的培养箱中放置过夜，以使其完全消化。消解后，将样品玻片放在五位数的微量分析天平上。将载玻片安装到升华装置的冷却指上，并按照与均温板相同的方式用铜胶带固定。
将 300 毫克 CHCA 基质放入腔室底部的玻璃培养皿中，均匀涂抹以形成一层薄薄的基质晶体。组装升华器。并用马蹄夹固定两半。
将组装好的装置悬挂在预热至 220 摄氏度的沙浴上方 15 至 20 厘米处，将其放入连接到蒸馏架的金属环中。将腔室连接到真空源，接合真空，并使其稳定至约 25 毫托 5 分钟。将冷却指的顶部装满冰块，然后加入 50 毫升水。
让设备再静置 5 分钟，然后再继续。将腔室降低到支架表面，确保沙子完全接触腔室底部。放置 45 分钟，以形成每平方厘米 0.22 毫克的理想涂层。
45 分钟后，抬起金属环，将腔室从沙浴中取出，然后对腔室进行通风。升华后，像以前一样将样品载玻片安装在先前构建的均温板顶部内。小心地将 600 微升含有乙腈和三氟乙酸在水中体积混合物的一比一体积的溶液移液到培养皿底部的印迹纸上，以确保涂层均匀。
接下来，组装腔室，确保纸片和显微镜载玻片完美对齐。将腔室置于 37 摄氏度的培养箱中 1 小时。在平板扫描仪中扫描载玻片以创建数字图像。
将样品加载到质谱仪中，然后使用适当的软件平台进行分析。最后，按照文本协议中的说明分析样本。这里显示的是正确处理的组织标本，该标本以 50 微米成像，显示出良好的宏观结构以及白质和灰质之间的明显差异。
成功比较的样品将在不同的组织位置显示明显的分化。在这里，有一个明显的肽上调区域，由白质区域的质荷比 1， 085 表示，如白色区域所示。相比之下，这个制备不正确的样本显示出大规模的离域化。
三个面板中存在的分子模式清楚地表明，生物区域之间或所显示分子丰度的差异没有明确的定义。看完这个视频后，您应该对如何制备自己的样品进行肽成像分析有了一个很好的了解。通过适当的程序，该方法可以在 2 天内 8 小时内完成，从而允许过夜消化步骤。
在准备此方法时，在每个步骤中都要小心。组织发生的任何物理损伤都会破坏样品中包含的空间信息。当我们第一次开始自己的 IMS 空间调查时，我们就有了这种方法的想法，并意识到没有其他明确的方法被公布。
通过小的修改，我们的方法可以应用于蛋白质、肽、脂质和其他小分子的分析。在此程序之后，可以将其他组织学技术（如免疫荧光、苏木精和伊红染色）应用于您的样品，以获得成像质谱数据的参考点。在处理可能爆炸性的化学品（如液态硝酸纤维素）时，保持正确的安全程序非常重要。
最大限度地减少工作量并立即处理废物至关重要。
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概述
本协议描述了一种基于升华的可重复和可靠的方法，用于制备甲醛固定的组织，以用于成像质谱。该技术旨在帮助新手用户高效地开发自己的工作流程。
关键研究组成部分
科学领域
- 质谱
- 组织制备
- 成像技术
背景
- 成像质谱是分析组织样品的强大工具。
- 甲醛固定是一种常见的生物组织保存方法。
- 重复性对于可靠的科学结果至关重要。
- 成本效益的方法对于广泛采用很重要。
研究目的
- 提供一种简单且可重复的组织样品制备方法。
- 使新手用户能够创建自己的成像工作流程。
- 简化准备肽质谱成像样品的过程。
使用的方法
- 制备硝酸纤维素涂层的载玻片。
- 将液体硝酸纤维素涂在导电载玻片上。
- 使用表面张力创建均匀的薄膜涂层。
- 在室温下干燥和储存载玻片。
主要结果
- 该方法高度可重复且易于实施。
- 成功使用了成本效益的方法。
- 新手用户可以高效地准备样品，无需进行大量的实验性尝试。
结论
- 本协议促进了成像质谱的组织样品制备。
- 它为该领域的研究人员提供了一种可靠的方法。
- 该方法提高了新手质谱用户的可访问性。
常见问题
Executive Industry Relevance
Peptide-based MALDI MSI workflows face significant challenges in detecting analytes from formalin-fixed tissues due to cross-linking and spatial delocalization risks. This protocol provides a reproducible, cost-effective method to preserve spatial information while maximizing peptide ionization, directly supporting target validation and assay development in discovery pipelines. By enabling reliable peptide detection from archival FFPE samples, it enhances mechanistic de-risking and predictive confidence in early-stage therapeutic hypothesis testing.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by detecting spatially resolved peptides from FFPE archives.
- Operational Value: Reduces mechanistic ambiguity through reproducible sample preparation that maintains tissue integrity.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by generating quantitative peptide maps for target engagement assessment.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening with preserved spatial context.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility via simple, manual coating steps.
- Scalability: Facilitates platform reuse across peptide, lipid, and small molecule screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery findings to preclinical validation through consistent FFPE sample handling.
- Biomarker Alignment: Enables correlation of MSI peptide signals with histopathological references like H&E staining.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by providing reliable molecular localization data from archival cohorts.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target hypothesis testing through lead identification and preclinical validation, specifically enabling peptide analysis from formalin-fixed samples that would otherwise be inaccessible to MALDI MSI.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by detecting endogenous peptides with spatial resolution.
- Screening: Delivers assay readiness through reproducible matrix coating and analyte localization without delocalization.
- Analytics: Generates quantitative ion intensity readouts that allow comparison of peptide abundance across tissue regions.
- Translational Research: Connects to preclinical workflows by enabling H&E and immunofluorescence co-registration for biomarker validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, low-cost capability for peptide MSI applicable across multiple therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through spatially resolved peptide detection from FFPE tissue.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via simple, manual steps requiring no automated instrumentation.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by reducing false negatives in peptide detection from archival samples.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization by unlocking historical tissue collections for target validation studies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in histology and mass spectrometry sample preparation.
- Depends on standard laboratory equipment including vacuum sublimation apparatus and incubators.
- Necessitates cross-team standardization of FFPE handling and reagent preparation between pathology and analytics teams.
- Involves adaptation considerations for different tissue types and fixation durations.
- Practical limitations include careful handling of explosive liquid nitrocellulose and precise volume control to prevent analyte delocalization.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:29
Preparation of Reagents and Equipment
1:21
Preparation of Tissue Sections and Methylene Crosslink Hydrolysis
2:40
Tissue Digestion
3:57
Matrix Coating via Sublimation
5:26
Recrystallization and Instrumentation
6:20
Results: Correctly and Incorrectly Prepared Human Brain Tissue
7:07
Conclusion
