福尔马林固定样本用于基于肽的基质辅助激光解吸/电离质谱成像工作流程的最佳制备方法

本实验的总体目标是可重复地制备用于肽段质谱成像的组织样本。该方法使质谱分析初学者能够在无需经历冗长的经验性摸索过程的情况下，建立属于自己的成像质谱工作流程。该技术的主要优势在于其高度可重复、操作简便，并且采用成本效益高的方法。

制备硝酸纤维素包被的载玻片时，将40微升液态硝酸纤维素移液至导电的氧化铟锡显微镜载玻片的一端。使用普通的玻璃显微镜载玻片，在表面张力作用下将硝酸纤维素沿载玻片表面拖拽，形成均匀的薄膜涂层。室温下静置干燥20秒，随后于室温保存备用。

接下来，通过裁剪一块厚吸水纸来制作定制的蒸气室，吸水纸的大小需足以覆盖标准塑料培养皿的下半部分。将纸裁成中央留有一条与显微镜载玻片尺寸相同的矩形条。保留足够的边缘余量，以确保吸水纸在培养皿中保持固定位置。

对于FFPE组织，按照文本方案所述，将切片漂浮贴附于硝酸纤维素预包被的ITO载玻片上。将载玻片浸入新鲜的二甲苯中，以去除残留石蜡，持续两分钟。通过将载玻片浸入梯度溶剂系列中清洗脱蜡样本：先浸入70%（体积比）乙醇水溶液，再浸入100%乙醇，每次30秒。

然后，将载玻片浸入卡诺氏液中固定两分钟。最后，将载玻片依次浸入100%乙醇、超纯水和再次浸入100%乙醇中，每次30秒。将样本载玻片放入塑料载玻片盒中，并加入20毫摩尔Tris HCO溶液至液面满溢。

将盒子密封后放入含有500毫升水的水浴中，使盒子接触水浴底部。然后在压力锅中于120摄氏度加热15分钟，压力锅可达到70千帕的操作压力。取出载玻片，使其冷却，并在室温下干燥15分钟。

水解完成后，先用移液枪吸取10微升超纯水配制的胰蛋白酶溶液，滴加至组织切片边缘，然后使用同一枪头在表面张力作用下将液滴均匀覆盖整个组织表面。待样本在室温下自然干燥后，用高压灭菌胶带将样本固定于先前制备的密闭湿盒顶部，两侧边缘均需粘贴固定。

用移液器小心地将600微升含有1:1体积比的100%乙腈和50毫摩尔碳酸氢铵的混合溶液滴加到培养皿底部部分的吸水纸手指上，直至该纸手指均匀湿润。移液操作至关重要，因为不正确的移液会导致基质和表面分析物的位移，从而破坏样本中所包含的空间信息。将蒸气室的上半部分放置在下半部分上，确保纸手指与样本载玻片完全对齐，并用石蜡膜在腔室赤道周围进行密封。

将样品置于37摄氏度培养箱中过夜，以确保完全消化。消化完成后，将样品载玻片放置在五位数微量分析天平上。将载玻片安装至升华装置的冷指上，并用铜箔胶带固定，固定方法与气相室所述方法相同。

将300毫克CHCA基质放入腔室底部的玻璃培养皿中，并均匀铺开，形成一层薄薄的基质晶体。组装升华仪，并用马蹄形夹固定两个半部分。

将组装好的装置置于连接至铁架台的金属环中，悬挂在已预热至 220 摄氏度的沙浴上方 15 至 20 厘米处。将腔室连接至真空源，启动真空泵，并使其稳定在约 25 毫托约五分钟。将冷指管用冰填满至顶部，并加入 50 毫升水。

继续静置装置五分钟后再进行后续操作。将腔室降至支架表面，确保砂子完全接触腔室底部。静置45分钟，以形成每平方厘米0.22毫克的理想涂层。

45分钟后，通过抬高金属环将培养 chamber 从沙浴中取出，并对 chamber 进行排气。待升华完成后，将样品载玻片安装在先前构建的蒸气 chamber 顶部内侧，操作方式与之前相同。小心地用移液器将600 µL含有等体积乙腈与三氟乙酸水溶液的混合液滴加到培养皿底部的吸水纸上，以确保均匀覆盖。

接下来，组装检测室，确保纸条与载玻片完全对齐。将检测室置于37°C培养箱中孵育1小时。使用平板扫描仪扫描载玻片，生成数字图像。

将样品载入质谱仪，然后使用相应的软件平台进行分析。最后，按照文本方案中所述分析样品。图中显示的是一个经过正确处理的组织样本，成像分辨率为50微米，呈现出良好的宏观结构以及白质与灰质之间的清晰差异。

成功制备的样本在不同组织位置应显示出明显的差异。此处，由白色区域代表的白质区域中，质荷比为1,085的肽段表现出明显的上调。相比之下，该制备不当的样本显示出大范围的去定位现象。

三个图谱中分子的分布模式明显表明，不同生物区域之间并无明确界限，所显示分子的丰度也无显著差异。观看本视频后，您应能充分了解如何制备用于肽段成像分析的样品。只要操作得当，该方法可在两天内完成，总耗时约八小时，其中包括一个过夜消化步骤。

在准备该方法学的过程中，每一步操作都需格外小心。任何对组织造成的物理损伤都会破坏样本中所包含的空间信息。当我们最初开始自己的成像质谱空间研究时，便萌生了该方法学的想法，并意识到此前尚未发表过其他明确的方法学。

经过少量修改后，本方法可应用于蛋白质、多肽、脂质及其他小分子的分析。在完成该操作步骤后，可对样本进一步采用其他组织学技术，如免疫荧光染色和苏木精-伊红染色，以便为成像质谱数据提供参考依据。在处理可能具有爆炸性的化学品（如液态硝化纤维素）时，必须严格遵守正确的安全操作规程。

尽量减少操作体积并立即处理废弃物至关重要。