全身质谱成像红外基质辅助激光解吸电喷雾电离（IR-MALDESI）

该协议的总体目标是描述全身组织切片的 IR-MALDESI 质谱成像所需的主要步骤。该方法可有效解答质谱成像领域的关键问题，例如同时辨别多个器官中内源性和外源性分析物的空间分布。该技术的主要优点是它在大气压下运行，外源性冰基质有助于解释不同器官中水分含量的变化。

尽管该协议提供了对目标全身成像的见解。IR-MALDESI 质谱成像也可用于靶向和定量药物分布分析。以下协议描述了如何执行 IR-MALDESI MSI 实验。

有关 IR-MALDESI 光源的优化几何形状及其与激光器、载物台和质谱仪的同步的详细信息，可在其他地方找到。要制备标本，请戴上防护手套，并在 40 毫米低温恒温器标本盘上涂上一层 OCT 封固剂。然后，轻轻地将冷冻的整个小鼠标本放在 OCT 涂层支架上，并确定其方向以进行切片。

OCT 仅用于将组织粘附到标本盘上。不要将组织完全嵌入 OCT 中。将标本盘放在低温恒温器的 Peltier 样品架上。

打开 Peltier 并等待 10 分钟，让样品平衡。然后，将标本盘放入光盘支架内，将其定向以切片到所需的平面。在 20 摄氏度下，例如 25 个微粒对标本进行切片，以进行全身分析。

使用防滚动玻璃板，并使用低温恒温器真空和刷子清除不需要的组织碎屑。组织切片后，用刀片防护罩盖住刀片。现在，将冷冻切片定向到标本板上，并将它们解冻安装到预先清洁的玻璃显微镜载玻片上。

使载玻片尽可能靠近切片，不要接触。将已安装的载玻片放在低温恒温器内，直到 IR-MALDESI 校准完成，以保持组织低温保存。首先，打开中红外激光器并启动激光控制应用程序。

然后，选择所需的波长。IR-MALDESI 实验通常在 2940 纳米处进行。接下来，打开舞台控制器并启动控制程序。

使用该程序，使用 Home 按钮校准舞台位置。接下来，用电喷雾溶剂填充 1 毫升注射器并冲洗二氧化硅毛细管。然后，使用离子源参数（如 ESI 点距离、点点入口距离、样品高度和溶剂流速）将 ESI 发射器与 MS 进样口对齐。

所有这些都已使用统计 DOE 进行优化，用于组织切片分析。现在启动电喷雾并评估其至少 10 分钟的稳定性。监测总离子流，此时，总离子流仅由环境化合物组成。

在 10-15 分钟内变化低于 10% 表明系统稳定。关闭电喷雾并确保其关闭后，将样品玻片从低温恒温器转移到 IR-MALDESI 样品板。然后，从 ESI 发射器上站起来，重新启动电喷雾。

关闭 IR-MALDESI 源的检修门，并用干燥的氮气吹扫外壳，以防止水在纸巾上凝结。一旦外壳内的相对湿度低于 3%，将帕尔贴板的直流电源切换到约 12 伏，将样品板冷却至 9 摄氏度。大约 5-10 分钟后，停止氮气吹扫并打开源检修门，使组织暴露在环境湿度下。

载物台和镶样的组织切片上会形成一层薄薄的冰。如果空气干燥，请在外壳内放置一个装有温水的烧杯。现在，关上门并重新开始氮气流，将湿度降低到 10% 左右根据需要调整氮气流，以在实验过程中保持样品上的冰层稳定。

使用 Rastier GUI，单击 LASER Position 按钮将舞台移动到分析位置。使用激光的调节二极管以确保关闭组织区域将被切割。然后，试拍以校准激光相对于摄像机视图的偏移。

单击 Laser Test Fire 按钮以更新激光位置。现在，返回相机位置并通过将激光对准标线放置在激光烧蚀点上来更新 Rastier 中的激光位置。然后，单击 ROI 按钮并选择感兴趣的区域。

包括一些脱离组织区域作为对照。使用此组织外切片进行峰挑选。激光在组织上的光斑尺寸约为 150 微米。

通过过采样可以获得更小的直径。现在，输入适当的实验参数并在项目名称框中命名质谱仪成像文件。然后，从下拉框中选择合适的激光频率。

通常，每个体素使用 20 赫兹的两个激光脉冲来完全解吸材料。此外，将延迟时间设置为 10 毫秒，以便离子有时间到达质量分析器。重复频率应设置为激光器的最大值。

现在，在质谱仪软件中选择质谱仪参数，例如电离模式、电喷雾电压、溶剂流速、毛细管温度和进样时间。设置完所有参数后，将质谱仪置于握手模式以进行同步并开始质谱仪采集。使用 Rastier 成像软件，验证清单中的所有步骤均已完成，然后加载程序。

RUN 按钮可用后，开始 MSI 信号采集。成像实验完成后，停止质谱仪采集并将仪器置于待机模式。关闭对机柜的氮气吹扫。

关闭舞台控制器。关闭 Peltier 板的电源并关闭激光器。然后，打开检修门。

从离子源外壳内侧取下 eletrospray 发射器尖端，并戴上防护手套，取下非常热的加长金属质谱仪入口。戴上手套和安全护目镜，使用超声波浴清洁入口。首先，使用 15% 硝酸 10 分钟。

然后，使用 HPLC 级水 10 分钟，最后，使用 HPLC 级甲醇 10 分钟。在氮气流下干燥金属毛细管入口，然后将其重新插入质谱仪中以备将来分析。使用所描述的方法分析了全身组织切片不同器官中代谢物的空间分布。

在所有组织中都观察到胆固醇，因为它在细胞膜中的结构作用。其他脂质代谢物在特定器官或组织区室内表现出不同的分布。例如，观察到一些脂质，例如惩罚性分配的 desmosterol 在大脑中具有特定的定位。

而其他脂质在脊髓中表现出更高的分布。其他脂质均匀分布在除大脑以外的所有器官中。IR-MALDESI 质谱成像是一种颠覆性技术，可在大气压下以最少的样品制备对组织中的分析物进行相对和绝对定量。

掌握后，所有样品制备步骤均可在大约 30 分钟内完成。样品制备的一个关键步骤是形成冰基质，这有助于组织相关物质的高效解吸。冰基质还有助于解释不同器官中水分含量的变化。

与该方案一起，可以进行补充分析，例如连续切片的组织学和免疫组织化学染色。