Name: 使用开源 smfBox 进行精确和准确的单分子 FRET 测量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-05T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: 学习使用开源smfBox进行单分子FRET实验，精确测量生物分子内的绝对距离。本方案涵盖仪器校准、样本制备、数据采集与分析，适用于DNA双链等体系，助力研究人员以低成本开展高质量单分子荧光共振能量转移研究。

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作者们衷心感谢以下资助来源：英国生物技术和生物科学研究生理事会（BBSRC，项目编号 BB/T008032/1）；工程与物理科学研究理事会（EPSRC，资助 B.A. 的博士生奖学金）以及医学研究理事会（MRC，资助 A. R.-T. 的博士生奖学金）。

1. 开启组件电源
<ol>
	<li>依次打开六个电源开关（无特定顺序）：压电控制器（z轴聚焦）、APD0、APD1、绿色激光器、红色激光器和光电探测器。</li>
</ol>
2. 软件1-实验设置
<ol>
	<li>启动激光控制中心。
	<ol>
		<li>确保选择连续波-交替恒定电流（CW-ACC）模式。</li>
		<li>打开两台激光器的电源。</li>
		<li>检查/设置激光功率。 
		注意：激光功率需要根据激发二向色镜前的实际测量值进行调整，因为激发光路中的ND滤光片和分束镜会降低激光器控制面板上显示的功率值。此处给出的数值为激发二向色镜处的功率，但需自行确定激光控制面板上对应此功率的设定值。
		<ol>
			<li>220 µW 绿色激光（515 nm，40 mW）</li>
			<li>70 µW 红色激光（638 nm，10 mW）</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>smOTTER采集软件
	<ol>
		<li>连接激光器、探测器、Z轴平台和相机，并正确配置（具体设置可能因NI数据采集卡配置不同而有所差异）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 发射光路的校准（通常不需要）
<ol>
	<li>设置对齐
	<ol>
		<li>将 10 µL 游离 Cy3B 染料（约 100 nM）用移液器点样至显微镜上，并按照下文步骤 4.3–4.5 所述进行聚焦。 
		注意：使用其他在受体通道中有一定泄漏的供体染料也可行。</li>
		<li>在 smOTTER 中打开 对齐 选项卡，降低激光功率，并调整 y 轴刻度，直到探测器显示出读数。 
		注意：此处的目标是增强信号，因此在信号增强后可能需要再次调整刻度。</li>
		<li>拧下 smfBox 前端的四个螺丝，取下前面板。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>针孔对齐
	<ol>
		<li>在观察“对齐”选项卡上的信号的同时，调节针孔定位器的 x 旋钮，尝试增强绿色和红色信号。</li>
		<li>接着调节 y 旋钮，以在另一方向上对齐针孔。</li>
		<li>返回调节 x 旋钮，检查信号是否可进一步增强。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>针孔-透镜对齐
	<ol>
		<li>沿一个方向调节透镜的 x 旋钮，信号将随之降低。</li>
		<li>沿相同方向调节针孔的 x 旋钮，使信号再次增强。</li>
		<li>如果新的最大信号高于之前，则继续迭代地朝该方向同时移动针孔和透镜；如果低于之前，则迭代地朝相反方向移动。</li>
		<li>对 y 方向重复上述步骤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>APD 透镜对齐
	<ol>
		<li>从绿色 APD 开始，调节 x 旋钮，使绿色信号达到最大。</li>
		<li>对 y 旋钮重复此操作。</li>
		<li>返回调节 x 旋钮，前后移动以找到信号开始下降的两个阈值点，并将旋钮置于这两个点之间的中间位置。</li>
		<li>对 x 旋钮重复此操作。</li>
		<li>对红色 APD 透镜重复上述步骤，同时观察红色信号。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将前面板重新装回 smfBox 并拧紧螺丝。 
	注意：建议每月执行一次上述对齐操作，若怀疑显微镜在测量间期出现对齐故障，也应作为预防措施进行对齐。</li>
</ol>
4. 测量数据采集
<ol>
	<li>对于第一个样品，使用浸有甲醇的镜头清洁纸清洁载物台；从一端到另一端轻轻擦拭物镜。</li>
	<li>在物镜中心滴加3–4滴显微镜用浸油；样品之间根据需要补充浸油。</li>
	<li>样品制备
	<ol>
		<li>用移液器将10 µL样品（首次使用I型超纯水）滴加到洁净盖玻片的中央。</li>
		<li>小心地将盖玻片以一定角度缓慢放置到物镜上，使其与浸油接触，避免在盖玻片与物镜之间夹入气泡。 
		注意：如有必要，可轻微滑动盖玻片，将油中的气泡移离焦点区域。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行交替激光激发（ALEX）实验时，在激光占空比设置面板中按如下方式配置激光：
	<ol>
		<li>供体（绿色激光）：0关，45开，55关</li>
		<li>受体（红色激光）：50关，45开，5关</li>
		<li>ALEX周期（µs）：100</li>
	</ol>
	</li>
	<li>点击功能区中的Z轴聚焦选项卡；在采集面板中将激光切换至实时模式并启动相机；调节曝光时间，使中央出现一个明亮的光斑，周围为黑色背景。 
	&#8203;注意：相机捕获的是盖玻片与样品之间玻璃/水界面反射的光，当焦点位于该界面时，可见光圈直径最小。因此必须从该界面下方开始，逐步升高Z轴至界面位置，再略微升高，使焦点位于盖玻片上方并进入待测样品中。
	<ol>
		<li>从较低的Z位置开始，逐步升高直至光斑达到最小尺寸，然后继续升高最多20 µm，使激光焦点位于浸油和盖玻片上方，并进入样品中。</li>
		<li>聚焦完成后停止相机采集。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为确认系统设置正确，监测I型超纯水的信号轨迹，应无荧光信号；对样品所用缓冲液也需重复进行纯度验证。</li>
	<li>使用带橡胶头的镊子小心移除盖玻片，避免损伤物镜，然后将按上述方法制备的待测样品放置到物镜上。根据需要补充浸油，以维持盖玻片与物镜之间均匀的接触面积（特别注意样品在盖玻片上的接触区域及物镜的焦点区域）。</li>
	<li>浓度优化
	<ol>
		<li>为获得单分子数据，样品浓度应调整至在smOTTER的实时轨迹面板中每秒观察到1–5个爆发信号为宜（此浓度可最大程度降低多个分子同时存在于检测体积内的可能性）。在确定合适浓度后开始测量。</li>
		<li>为防止长时间实验过程中样品蒸发，需制备密闭样品腔。将硅胶隔离器（直径8–9 mm）压在盖玻片中央（可用移液器吸头标记位置），然后小心地将样品滴加至中央，避免接触硅胶。随后将另一片盖玻片覆盖其上并轻压密封。</li>
		<li>检查实时的化学计量比与FRET效率（ES）直方图，确认样品行为符合预期，即具有预期的FRET效率和合理的化学计量比（约0.5）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>当样品准备就绪后，在保存设置面板中输入实验详细信息。通过点击保存设置面板中的省略号图标（文件以hdf5/h5格式保存），选择合适的目录和文件名。
	<ol>
		<li>输入样品名称、样品详情、供体与受体标记物、缓冲液、供体与受体激发波长、检测波长和激光功率，以及用户姓名和所属单位。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>返回功能区中的实时轨迹选项卡，在采集面板中输入实验时长（单位：分钟），选择合适的保存间隔以防止因意外导致数据丢失。如需，勾选保存激光功率。</li>
	<li>点击开始按钮开始采集数据。 
	&#8203;注意：为实现准确的FRET测定，需至少测量两个含有相同供体与受体染料但FRET效率差异足够的样品。</li>
</ol>
5. 分析/软件 2
<ol>
	<li>启动带有 FRETBursts Python 软件包的 Jupyter notebook（设置说明可在此处找到：https://craggslab.github.io/smfBox/anasoftware.html）</li>
	<li>如果无需对绝对 FRET 效率进行校正（即，仅需测量 FRET 的相对变化），则启动 Jupyter notebook FRET Analysis 1.4 Uncorrected.ipynb。可使用该文件将图表或数据导出为 csv 文件，以便在其他软件中进一步分析或绘图。 
	注意：每个 notebook 均包含详细说明，指导用户完成分析流程。如需更深入讨论分析流程，包括爆发搜索算法、背景校正及所有校正参数，请参见23,25。</li>
	<li>如果需要对绝对 FRET 效率进行校正，请首先计算串扰参数 alpha（供体发射泄漏至受体通道）和 delta（在供体激发条件下受体直接激发的比例）。
	<ol>
		<li>首先启动 Jupyter notebook Correction Factor Finder Alpha-Delta.ipynb，以确定 alpha 和 delta 参数。 
		注意：如果这些参数在不同样品间不一致，可能是显微镜在测量之间出现了光路对准问题，或染料光谱在样品间存在差异。</li>
		<li>如果 alpha 和 delta 参数一致，则启动 Jupyter notebook Correction Factor Finder Gamma-Beta.ipynb，以确定 gamma 和 beta 参数（用于校正染料间激发和检测效率的差异）。 
		&#8203;注意：如果 gamma 和 beta 的拟合效果不佳，可能是显微镜在测量之间出现了对准问题，或染料的量子产率或消光系数在样品间存在差异。</li>
		<li>在确定四个串扰参数后，可在 FRET Analysis 1.4 Corrected.ipynb Jupyter notebook 中使用这些参数，以计算绝对 FRET 效率。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 故障排除
<ol>
	<li>如果所有信号都很低，或每次猝发的计数低于预期（这取决于染料——对于 smfBox 上的 ATTO-550 和 ATTO-647N，单分子猝发期间典型的每毫秒计数在 50 到 100 之间），则需重新对准 smfBox。</li>
	<li>在 ES 直方图上，双标记与单标记群体之间出现桥接现象。 
	注意：这可能是由于浓度过高（可通过稀释样品来解决），或由光漂白引起，而光漂白可能源于激光功率过高（可通过降低激光功率来解决）。</li>
	<li>如果在整个实验过程中猝发率持续下降（荧光标记分子可能正在黏附于玻璃盖玻片），可提高 BSA 浓度以纠正此问题。</li>
	<li>如果在整个实验过程中猝发率持续上升（样品可能正在蒸发），请按照上述方法制备密封的样品腔室。</li>
	<li>如果在对准时信号骤降至零（软件可能因探测器信号过强而超载），应降低激光功率或使用更稀释的对准样品。</li>
	<li>如果 Z 轴聚焦出现同心环状图案（可能因物镜上贴附了多个盖玻片所致），请检查物镜上是否存在多个盖玻片。</li>
	<li>如果样品中出现明亮且持续时间较长的中等化学计量比猝发信号（由分子聚集引起），应使用去垢剂或修改样品纯化方案。 
	注意：获得洁净的缓冲液可能是一个挑战，因为某些缓冲液组分通常含有微量中等荧光污染物，这些污染物足以在时间轨迹上表现为单色猝发信号。如果缓冲液中此类污染物过多，则可能与样品猝发信号重叠，从而改变所测得的 FRET 效率或化学计量比。尤其 BSA 常在此方面存在问题，因此建议将储备 BSA 溶液暴露于强光源下进行预光漂白，以去除污染物。</li>
</ol>

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<li>Kapanidis, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternating-laser+excitation+of+single+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">Alternating-laser excitation of single molecules.</a> Accounts of Chemical Research. 38 (7), 523-533 (2005).</li>
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<li>Bennet, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+conformational+flexibility+couples+substrate+specificity+and+scissile+phosphate+diester+selectivity+in+human+flap+endonuclease+1%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Regional conformational flexibility couples substrate specificity and scissile phosphate diester selectivity in human flap endonuclease 1.</a> Nucleic Acids Research. 46 (11), 5618-5633 (2018).</li>
</ol>

作者声明无竞争利益。

该实验方案中最关键的步骤是显微镜的校准以及将样品浓度调整至合适的稀释度。如果校准不准确，可能导致信号不足，无法识别荧光爆发事件并绘制直方图；若不同样品间的校准存在偏差，则由于渗漏效应以及检测/激发效率的变化，可能导致FRET校正不准确。合适的浓度同样至关重要：浓度过高会产生重叠的荧光爆发，其中包含多个分子，这些分子可能具有不同的FRET效率或标记化学计量比；而浓度过低则会导致荧光爆发事件过少，难以进行可靠的数据分析。
本文所述方案适用于测量静态单个FRET物种中的距离。如果样品的FRET效率直方图中出现多个峰，或峰形较宽（动态物种可能出现此情况），则需要更多的爆发事件才能达到相同的拟合精度。对于两个分离良好的峰，大约需要两倍的数据量；但如果种群之间存在轻微重叠，则需要更多的数据。
如果两个种群在实验的时间尺度上发生相互转化，则有可能确定该系统的动力学和反应速率。BVA27 和 2CDE28 等测试可证实中间态的爆发具有动态特性，而 dPDA29,30 或 H2MM31 等分析方法则可用于确定相互转化的速率。BVA 和 2CDE 的 Jupyter 笔记本可在 FRETBursts26 网站获取，基于 MATLAB 的软件 PAM32 可用于运行 BVA、2CDE 和 PDA 分析。
共聚焦单分子FRET能够轻松观测到比TIRF更短的寿命状态（约1 ms）；然而，由于扩散限制，其观测时间较短，无法提供分子的历史信息，因此不能像表面固定实验那样确定较长的停留时间或复杂的跃迁网络。
由于该方案用于检测极低浓度下自由扩散的分子，因此在测量同一分子内的分子内距离时效果最佳。只要两种分子的解离常数（Kd）足够低，使得在实验所需的低工作浓度（约100 pM）下仍能形成显著数量的复合物，即可测量瞬时结合分子之间的分子间距离。如果Kd远高于此值，则只能观察到单标记的分子。这一问题可通过微流控技术加以克服，即先将两种标记组分在高浓度下混合，然后在复合物解离之前迅速稀释并流经物镜33,34。
在单分子水平上测量FRET效率相较于系综技术具有显著优势，因为它能够揭示异质性亚群，而在系综实验中这些亚群的信息会被平均化。此外，结合ALEX的单分子FRET可获得准确的FRET效率，这些效率可被转换为精确的距离信息，从而实现对更详细结构信息的解析，而不仅仅是探测相对距离的变化。smfBox具备所有这些优势和功能，但其构建成本远低于可进行共聚焦单分子FRET的商业显微镜23。
smfBox 大大降低了使用单分子FRET技术的门槛，使研究人员能够测量蛋白质和核酸内部及之间的构象变化以及精确的距离7,8,9,10,11,35。

单分子荧光共振能量转移（smFRET）是一种在单个分子水平上测量两种染料（供体与受体）之间FRET效率的技术。FRET是一种源于两种染料能量光谱重叠的光物理过程：供体被特定波长的光激发后，通过非辐射方式将能量转移至受体，从而导致受体发射荧光。该能量转移的效率与两个染料之间距离的六次方成反比，因此转移效率随距离变化而变化1。因此，这种FRET效率可用于确定染料所连接的分子的空间信息2，测量范围为3–10 nm。由于该尺度下FRET效率的变化对埃级分子运动具有高度敏感性3，且无需进行系综平均处理4,5,6，该技术特别适用于研究生物大分子（如核酸和蛋白质）的结构信息。相对FRET效率的变化可用于监测生物分子相互作用和构象动态，揭示蛋白质（去）折叠、转录、DNA复制与修复等关键细胞过程的机制；而绝对FRET效率则已被用于确定生物分子结构中的精确距离7,8,9,10,11，从而避免了其他一些结构解析方法所必需的结晶或冷冻步骤4,12。
单分子FRET实验最常见的两种形式是共聚焦显微镜和全内反射荧光（TIRF）显微镜。通过这两种方法，通常可以在皮秒到毫秒（共聚焦，自由扩散分子）至毫秒到小时（TIRF，表面固定分子）的时间尺度上研究生物大分子的动力学行为。这归因于每种技术所涉及的不同实验装置。在TIRF显微镜中，分子被固定在载玻片表面，并由隐逝波激发（图1A）。然而，本文重点在于共聚焦显微镜，因为这是smfBox所采用的形式。在共聚焦显微镜中，分子未被固定，而是通过布朗运动在共聚焦体积（约1 fL）中自由扩散，该体积由激光束经高数值孔径物镜聚焦至溶液中某一特定深度形成（图1B）。所产生的荧光发射光被重新聚焦通过同一物镜，并经由二向色镜滤光（图1C为完整示意图）。随后，光线通过一个针孔，以去除任何离焦光，最终到达雪崩光电二极管（APD）。当APD检测到光子时，会输出一个TTL脉冲，其时间可被记录至皮秒级分辨率。这些自由扩散分子在共聚焦体积附近被观测的时间通常在毫秒量级。
<img alt="显示荧光成像中激发和发射路径的光学显微镜示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62378/62378fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：显微镜原理及smfBox装置示意图。（A）全内反射荧光（TIRF）显微镜原理：激发光从物镜（Obj.）边缘射入，在盖玻片-缓冲液界面发生全内反射，产生指数衰减的隐逝场，用于激发表面附着的分子。（B）共聚焦显微镜：通过聚焦于样品中的近衍射极限光斑激发自由扩散的分子。（C）本实验方案中使用的smfBox装置，显示所有关键组件：雪崩光电二极管（APD）、分束器（BS）、二向色镜（DM）、滤光片（F）、反射镜（M）、物镜（O）和针孔（P）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62378/62378fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
近年来，单分子FRET技术引入了双色激发，即交替使用与供体和受体激发波长匹配的激光器5这可以通过两种方式之一实现，第一种是通过在千赫兹（KHz）时间尺度上调节连续波激光器，该方法称为交替激光激发（alternating laser excitation, ALEX）。13,14第二种方法在兆赫时间尺度上交错施加快速脉冲；这称为纳秒级ALEX15 或脉冲交错激发（PIE）16在所有这些方法中，受体激光的信息可用于计算所谓的化学计量比，从而区分具有低FRET效率的分子与缺乏受体（由于标记不完全或光漂白所致）的分子。结合PIE/ns-ALEX技术还可获得单分子水平的荧光寿命信息，而当与偏振光学元件联用时，亦可测量各向异性。此类多种测量方式的结合被称为多参数荧光检测（MFD）。9.
尽管单分子FRET具有诸多优势，但由于商用仪器成本高昂，且缺乏简单易行的自制替代方案，该技术尚未在专业实验室之外得到广泛应用。目前，低成本开源显微镜的开发正逐渐成为一种趋势，其他平台也相继出现，包括Planktonscope。17，OpenFlexure 显微镜18，Flexiscope19，miCube20，liteTIRF21和鱿鱼22本文介绍了使用smfBox的研究方案，smfBox是一种近期开发的低成本共聚焦装置，可测量在自由扩散的单分子上两种染料之间的FRET效率。详细的搭建说明及所有必要的操作软件均可在以下网址免费获取：https://craggslab.github.io/smfBox/23smfBox 的光学装置由来自价格实惠且广泛可及的制造商的现成组件组装而成，而传统共聚焦系统中成本较高的显微镜主体则被一个定制的、光密闭的阳极氧化铝盒所取代（使得在环境光照条件下仍可进行测量）。该盒子容纳了关键的光学元件，包括激发二向色镜、物镜和针孔，以及一个机械激光联锁装置，确保其作为一类激光产品安全运行（参见 图1C （完整示意图见相关说明）。smfBox 采用 ALEX 方法验证染料的化学计量比，并确定准确的 FRET 校正因子。该系统通过自主开发的开源软件（smOTTER）进行操作，该软件控制数据采集的各个方面，并将数据输出为开源的 photon-HDF5 格式。24，可与多种第三方分析工具兼容。smfBox 及其数据采集与分析方案 recently tested against &gt;20 台其他仪器（包括共聚焦和全内反射荧光显微镜）在多实验室盲法研究中25所获得的FRET效率与其他所有仪器的结果高度一致，尽管smfBox的成本仅相当于商业设备的一小部分。
本文详细阐述了一套逐步操作方案，用于使用smfBox获取并分析自由扩散DNA双链体的精确绝对FRET效率，涵盖从开启设备、光路校准与聚焦，到数据采集与分析的完整流程。本实验所用样品为三种DNA双链体（分别表现出高、中、低FRET效率，见表1），这些样品曾参与全球范围的盲测研究25；然而，该方法可适用于多种分子体系，包括蛋白质及其他核酸分子。期望本详细方案结合smfBox已有的构建说明23，能够进一步提升这一强大技术在各类实验室中的可及性。

<table><tbody><tr><td>氨基修饰寡核苷酸</td><td>Eurogentec</td><td>N/A</td><td>可从不同供应商订购或自行合成；氨基修饰可用于与NHS-酯修饰的染料进行标记</td></tr><tr><td>雪崩光电二极管（APD）</td><td>Excelitas</td><td>SPCM-AQRH-14</td><td>smfBox系统设置需要两个APD</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Merck</td><td>A2153</td><td>依赖系统；成像缓冲液组分（缓冲液中浓度为0.1 mg/mL）</td></tr><tr><td>紧凑型激光合束器</td><td>OMICRON</td><td>LightHUB-2</td><td>515 nm（80 mW）和638 nm（100 mW）激光器</td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>VWR</td><td>630-2742</td><td>厚度：0.17 &amp;plusmn; 0.01 mm，长×宽：22×22 mm</td></tr><tr><td>Cy3B</td><td>Cytiva</td><td>PA63101</td><td>1 mg，PA63100（5 mg），PA96106（25 mg）</td></tr><tr><td>FRETBursts Python 软件包</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>用于自由扩散单分子FRET数据突发分析的开源Python软件包：https://fretbursts.readthedocs.io</td></tr><tr><td>成像缓冲液</td><td>N/A</td><td></td><td>依赖系统；含5 mM NaCl、20 mM MgCl₂、5 mM Tris（pH 7.5）和0.1 mg/mL BSA</td></tr><tr><td>浸油</td><td>Olympus</td><td>IMMOIL-F30CC</td><td></td></tr><tr><td>Jupyter Notebook</td><td>Project Jupyter</td><td>N/A</td><td>开源Web应用程序，用于创建和共享包含实时代码、方程、可视化图表和文本的文档；smfBox的数据分析Notebook可在支持信息（SI）中找到</td></tr><tr><td>镜头纸</td><td>ThorLabs</td><td>MC-5</td><td>MC-50E为同种产品的批量包装</td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Merck</td><td>M2670</td><td>依赖系统；成像缓冲液组分（缓冲液中浓度为20 mM）</td></tr><tr><td>MilliQ/超纯水</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>纳米定位器</td><td>Piezoconcept</td><td>FOC300</td><td>用于精确调节显微镜物镜位置的纳米定位装置</td></tr><tr><td>NHS-酯修饰的ATTO-550</td><td>ATTO-TEC</td><td>AD 550-31</td><td>1 mg，AD 550-35（5 mg）</td></tr><tr><td>NHS-酯修饰的ATTO-647N</td><td>ATTO-TEC</td><td>AD 647N-31</td><td>1 mg，AD 647N-35（5 mg）</td></tr><tr><td>物镜</td><td>Olympus</td><td>N1480700</td><td>原始smfBox所用Olympus物镜系列已停产，由N5702300替代</td></tr><tr><td>OMICRON控制中心（OCC）—激光控制中心</td><td>OMICRON</td><td>N/A</td><td>v3.5.34 — OMICRON激光驱动软件</td></tr><tr><td>按压密封硅胶隔离器</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>664201</td><td>&amp;nbsp;直径8-9 mm × 深度1.7 mm</td></tr><tr><td>smOTTER</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Craggs实验室smfBox的开源采集软件：https://github.com/craggslab/smOTTER</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Merck</td><td>S7653</td><td>依赖系统；成像缓冲液组分（缓冲液中浓度为5 mM）</td></tr><tr><td>Tris碱</td><td>Merck</td><td>93362</td><td>依赖系统；成像缓冲液组分（缓冲液中浓度为5 mM，pH 7.5）</td></tr><tr><td>I型超纯水</td><td>Merck</td><td>ZIQ7000T0</td><td>Milli-Q&amp;reg; IQ 7000超纯水系统</td></tr></tbody></table>

使用开源 smfbox 进行精确且准确的单分子 fret 测量

Making Precise and Accurate Single-Molecule FRET Measurements using the Open-Source smfBox

smfBox 是一种近期开发的低成本、开源的单分子荧光共振能量转移（smFRET）仪器，可使对自由扩散生物分子的测量更加便捷。本概述包含使用该仪器对双链 DNA 样品进行精确 FRET 效率测量的分步操作方案，涵盖样品制备、仪器设置与校准、数据采集以及完整的分析流程。本方案基于 FRET 研究社区近期广泛的合作成果，旨在建立标准化的实验流程与分析方法，其中详细介绍了如何确定准确 FRET 距离测量所需的所有校正因子。该方案可轻松适用于多种生物分子体系，进一步推动 smFRET 技术在更广泛科学群体中的普及化。

该方案在设置过程中需要对实验条件进行关键性评估（参见方案步骤4.8）。此阶段获得的初步结果将决定实验的成败。阳性结果表现为每秒出现五到一次爆发（参见 图2B,C）。阴性结果则表现为数量过多（图2A）或爆发次数过少（图 2D在此时间范围内仍有可能纠正这些错误：浓度过高的样品只需稀释即可；若浓度过低，则可能需要重新制备样品（判断依据是在该低浓度下是否仍能在合理的时间范围内收集到数据）。
<img alt="时间相关单光子计数、衰减曲线、荧光实验、发射分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62378/62378fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：实验设置过程中实时轨迹的屏幕截图，显示不同浓度的双标记双链DNA样品。（A）浓度过高，（B）可接受上限，（C）目标浓度，（D）浓度过低。三个检测通道中的光子计数（1 ms 时间窗口）分别为：供体激发后的供体发射（DD）、供体激发后的受体发射（DA）以及受体激发后的受体发射（AA）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62378/62378fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
静态单物种系统通常需要30至60分钟的测量时间，以获得可靠数据分析所需的约1,000次爆发事件。当涉及多个物种或动态系统时，所需的时间和爆发事件数量将增加。数据采集和分析完成后，图示将从Jupyter笔记本中导出。交替图（图3A）应与实验装置的ALEX周期相符。时间轨迹图（图3B）用于定性评估样品浓度是否合理。背景图（图3C）显示光子间延迟时间的分布情况，并对较长时间段进行线性拟合以估算背景速率26。背景轨迹图（图3D）可用于识别实验过程中样品是否发生变化；这种变化主要可能源于长时间采集过程中的溶液蒸发。对所有光子（图3E）和双标记物种（图3F）生成ES直方图。最后，生成包含爆发数据高斯拟合的一维E直方图（图3G）。
<img alt="单分子FRET分析；示意图与图谱；供体-受体相互作用；荧光数据。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62378/62378fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3：由Jupyter Notebook生成的分析数据示例图。 （A）交替图，（B）时间轨迹图，（C）背景信号测定，（D）背景计数率，（E）所有光子的ES直方图，（F）双通道ES直方图，以及（G）一维E直方图。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62378/62378fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>名称</td>
			<td>序列</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">1a</td>
			<td>5’- GAG CTG AAA GTG TCG AGT TTG TTT GAG TGT TTG TCT GG - 3’</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3’- CTC GAC TTT CAC AGC TCA AAC AAA CTC ACA AAC AGA CC - 5’</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">1b</td>
			<td>5’- GAG CTG AAA GTG TCG AGT TTG TTT GAG TGT TTG TCT GG - 3’</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3’- CTC GAC TTT CAC AGC TCA AAC AAA CTC ACA AAC AGA CC - 5’</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">1c</td>
			<td>5’- GAG CTG AAA GTG TCG AGT TTG TTT GAG TGT TTG TCT GG - 3’</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3’- CTC GAC TTT CAC AGC TCA AAC AAA CTC ACA AAC AGA CC - 5’</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：本实验方案中使用的DNA序列。核苷酸中以蓝色和红色高亮显示的部分分别代表用Atto-550和Atto-647N标记的C2氨基修饰的胸腺嘧啶残基。
校正因子查找器 Alpha-Delta： <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62378/Correction%20Factor%20Finder%20Alpha-Delta.ipynb" target="_blank">请点击此处下载此文件。</a>
校正因子查找器 伽马-贝塔： <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62378/Correction%20Factor%20Finder%20Gamma-Beta.ipynb" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
FRET 分析 1.4 修正版： <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62378/FRET%20Analysis%201.4%20Corrected.ipynb" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
FRET 分析 1.4 未校正版本： <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62378/FRET%20Analysis%201.4%20Uncorrected.ipynb" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本文提供了使用开源、低成本的 smfBox 对单个自由扩散的生物分子进行完全校正且精确的 FRET 测量的分步操作指南，内容涵盖从开机、光路校准与聚焦，到数据采集与分析的全过程。

使用开源 smfBox 进行精确且准确的单分子 FRET 测量

smfBox 是一种近期开发的经济高效的开源单分子荧光共振能量转移（smFRET）仪器，可实现……

本方案使任何人能够使用廉价、坚固且开源的仪器 smfBox 开展单分子 FRET 实验，以测量生物大分子内精确的绝对距离。单分子 FRET 技术使您能够逐个观察分子，而非数十亿分子的平均状态，从而表征它们所采取的不同构象。该方法的优势在于可用于揭示多种生物分子系统的结构与动态特性。例如，蛋白质折叠、蛋白质与DNA的相互作用以及DNA的别构效应。在开始分析之前，启动激光控制中心，并确认已选择连续波交替恒流模式。打开两台激光器的电源。启动 smOTTER 采集软件，并确认每台仪器均已正确配置。为校准发射光路，将一滴浸油滴加到物镜上，然后小心地将一块干净的盖玻片放置在物镜镜头上，以一定角度缓慢放下，使盖玻片与物镜之间的油层避免产生气泡。随后，在盖玻片中央加入 10 µL 浓度为 100 nmol/L 的 Cy3B 染料。在激光占空比面板中，将供体激光设置为 0 关、45 开、55 关。将受体激光设置为 50 关、45 开、5 关。将交替激光激发（ALEX）周期设置为 100 微秒。打开Z轴对焦选项卡。在采集面板中，将激光切换为实时模式并启动相机。调节曝光时间，使明亮的光斑位于中央，并被黑色背景包围。从较低的 Z 位置开始，逐渐升高高度，直至光斑达到最小尺寸。然后继续升高最多 20 微米，使激光聚焦于油和盖玻片上方的样品中。当样品清晰对焦后，停止相机采集。在Omicron控制中心，一边监测smOTTER软件对准选项卡中的y轴刻度，一边降低绿色激光功率，直至在两个探测器中均观察到信号读数，必要时调整刻度。然后拧下smfBox前端的四个螺丝，取下前面板。为对准针孔，观察对准选项卡上的信号，同时调节针孔定位器上的X旋钮，以增强绿色和红色信号。转动 Y 调节旋钮，将针孔对准另一个方向，然后返回 X 调节旋钮，检查信号是否进一步增强。为对准针孔透镜，先沿某一方向转动透镜的 X 旋钮以降低信号，然后沿相同方向转动针孔的 X 旋钮，使信号恢复至原始水平。如果新的最大信号高于之前，则继续沿该方向迭代调节针孔和透镜的旋钮。如果信号低于之前水平，需反复将旋钮向相反方向调节，然后使用针孔和透镜 Y 轴旋钮重复对准过程。对于雪崩光电二极管透镜的对准，从绿色雪崩光电二极管开始，调节 X 轴旋钮直至绿色信号达到最大值。随后对 Y 轴旋钮重复进行信号调节。返回 X 旋钮，前后调节以找到信号开始下降的阈值点，将信号保持在两个阈值点中间的位置。找到 Y 旋钮的中间位置，并对红色雪崩光电二极管重复上述对准步骤。在分析第一个样品之前，使用浸有甲醇的镜头清洁纸擦拭载物台，从一端到另一端轻轻擦拭物镜，并在物镜中心滴加三至四滴浸油。取10微升一级超纯水滴加到洁净盖玻片的中心，观察水迹以确认无荧光信号出现。然后使用橡胶头镊子小心移除盖玻片，必要时补充浸油。为确保获得单分子数据，在稀释样品后，选择在实时轨迹面板中每秒观察到一至五个爆发事件的浓度。确定合适浓度后，将直径为8至9毫米的硅胶隔离器压在新的盖玻片中央，小心地将10微升样品加至中心位置，避免接触硅胶。然后将第二块盖玻片牢固地放置在隔离器上，直至形成密封。检查实时的化学计量比与FRET效率直方图，以观察样品行为是否符合预期。在保存设置面板中，输入样品名称及相关信息、供体和受体标记物、缓冲液、供体和受体的激发波长、检测波长及激光功率、最终用户及用户所属单位。在采集面板中，输入实验时长（分钟），并选择合适的保存间隔，以防止出现错误时造成潜在的数据丢失。如有需要，选择保存激光功率，然后单击“开始”以开始采集数据。在阳性结果中，每秒可获得一到五个脉冲信号。在阴性结果中，在相同时间范围内会观察到过多或过少的脉冲信号。收集和分析完成后，交替图应与实验装置的ALEX周期相匹配。时间轨迹用于定性评估样品浓度是否合理。背景图显示了光子间延迟时间的分布情况，并对较长延迟时间部分进行线性拟合，以估算背景速率。可通过背景轨迹来判断在实验持续时间内样品是否发生了变化。生成化学计量比与FRET效率的直方图，并分别针对所有物种及双标记物种进行筛选。通过数据的高斯拟合生成一维FRET效率直方图。因此，样品的浓度非常关键。如果浓度过高，就不再属于单分子实验；而如果浓度过低，则需要过长时间才能获得数据。该技术实现了对动态生物大分子结构的测定，而这些结构是核磁共振（NMR）或晶体学等其他方法无法测定的。

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单分子水平高精度FRET用于生物大分子结构测定

我们描述了使用原子力显微镜测量单个蛋白质分子力学性质及其机械解折叠路径的详细步骤与策略。同时，我们展示了代表性结果，以作为筛选和判断高质量单个蛋白质分子记录的参考依据。...

使用原子力显微镜对单个蛋白质分子进行力谱分析

本文介绍了一种利用单分子荧光共振能量转移（smFRET）研究Holliday连接体（HJ）解离的实验方案。通过双色交替激发法测定解离常数，随后在实时切割实验中应用单色时间序列smFRET，以获得HJ解离前的停留时间分布。...

单分子Förster共振能量转移方法实时研究GEN1对Holliday连接体的解析

本文介绍了一种利用宽场荧光显微镜对基于移动单分子荧光共振能量转移（smFRET）探针进行时空分析的方法。新开发的软件工具包能够确定运动探针的smFRET时间轨迹，包括随时间变化的准确FRET效率和分子位置。...

自动化二维时空分析可移动单分子FRET探针

本文介绍了在共聚焦显微镜模式下，利用单分子时间分辨荧光各向异性研究生物大分子局部柔韧性和动力学特性的实验方案。...

单分子时间分辨荧光各向异性用于表征生物大分子局部柔性

学习使用开源smfBox进行单分子FRET实验，精确测量生物分子内的绝对距离。本方案涵盖仪器校准、样本制备、数据采集与分析，适用于DNA双链等体系，助力研究人员以低成本开展高质量单分子荧光共振能量转移研究。

使用开源 smfBox 进行精确且准确的单分子 FRET 测量

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