基于单个细菌中氘掺入的受激拉曼散射成像的快速抗菌药物敏感性测试

在尿液和血液样本中，可在2.5小时内获得快速的抗菌药物敏感性检测结果，相较于传统的肉汤微量稀释法，分析时间显著缩短。该方法能够在全血等复杂环境中监测细菌的代谢活性。首先，使用分光光度计在600纳米波长下测定样品的光密度，以确认细菌浓度。

为了达到每毫升8 × 10⁵菌落形成单位（CFU）的最终细胞浓度，使用不含氘的普通MHB培养基稀释细菌溶液。将细菌细胞通过涡旋混匀后，取300微升等份的细菌溶液分别加入七个1.5毫升微量离心管中，并取600微升等份的细菌溶液加入另一个1.5毫升微量离心管中。然后，向含有600微升细菌溶液的微量离心管中加入4.8微升抗生素储备液，以获得8微克/毫升的最终抗生素浓度。

取300微升含抗生素的细菌溶液，加入至一份300微升不含抗生素的细菌溶液中，制成两倍稀释的溶液，最终抗生素浓度为4微克/毫升。对测试抗生素进行两倍倍比稀释，直至达到最低浓度0.25微克/毫升。从最后一个微量离心管中弃去300微升溶液。

将一管不加抗生素但含氘的样品作为阳性对照，另一管不加氘的作为阴性对照。将细菌等分试样与含有抗生素的MHB培养基在37°C下孵育一小时。同时，用含100%氘的MHB培养基制备抗生素的系列稀释液，其浓度梯度与之前所述相同。

孵育1小时后，向300微升已用抗生素预处理的细菌中加入700微升用含100%氘的MHB培养基进行系列稀释的抗生素，抗生素浓度与预处理时相同。通过反复吹打数次使混合物混匀。作为阳性对照，向300微升未加抗生素的细菌中加入700微升不含抗生素但含100%氘的MHB培养基。

加入 700 微升不含抗生素且含 0% 氘的 MHB 培养基至 300 微升不含抗生素的细菌中，作为阴性对照。将所有微量离心管在 37 摄氏度、每分钟 200 转的条件下孵育 30 分钟。孵育结束后，在 4 摄氏度下以 6,200 × g 离心力离心 1 毫升经抗生素和氘处理的细菌样品 5 分钟。

然后用纯化水将沉淀洗涤两次。用体积分数为10%的福尔马林溶液固定样品，并在4摄氏度下保存。通过分光光度计在600纳米波长下测定新制备细菌样品的光密度，以检测大肠杆菌（Escherichia coli）的浓度。

为了模拟临床尿路感染样本，将大肠杆菌（Escherichia coli）样本加入10毫升去标识的尿液样本中，使其终浓度达到每毫升10⁶ CFU。使用5微米滤膜过滤含大肠杆菌的尿液，并将过滤后的细菌溶液分装为七份，每份300微升，置于1.5毫升微量离心管中，另取一份600微升置于一个1.5毫升微量离心管中。按照先前所述方法，在抗生素存在条件下进行氘代标记处理。

为了模拟临床血流感染样本，将铜绿假单胞菌加入1毫升去识别的人类血液中，使其终浓度达到每毫升10的6次方菌落形成单位（CFU/mL）。为裂解血液，加入9毫升无菌纯化水。使用5微米滤膜过滤含有铜绿假单胞菌的加标血液。

然后，将过滤后的样品在4°C条件下以6,200 × g离心5分钟，收集细菌至1毫升体积。离心后，将添加了铜绿假单胞菌的血液溶液分装为每份300微升，分别加入七个1.5毫升微量离心管中，并将600微升的菌液加入一个1.5毫升微量离心管中，在抗生素存在下进行氘代标记处理，处理方法同前。样品制备时，用纯化水洗涤1毫升固定后的细菌溶液，然后将洗涤后的细菌溶液在4°C条件下以6,200 × g离心5分钟。

吸去上清液，并用无菌水将细菌溶液浓缩至约20微升。将细菌溶液滴加到聚-L-赖氨酸包被的盖玻片上，再用另一张盖玻片夹紧并密封样品。在受激拉曼散射（SRS）显微镜中，一台可调谐的飞秒激光器以80兆赫的重复频率提供泵浦光和斯托克斯激发激光。

斯托克斯光束通过声光调制器以2.4兆赫进行调制。两束光通过二向色镜共线合并。随后，泵浦光束和斯托克斯光束被导入一个自制的激光扫描显微镜，利用二维振镜实现激光扫描。

60倍水镜将激光聚焦到样品上，油镜聚光镜收集来自样品的信号。使用两个滤光片滤除斯托克斯光束，而泵浦光束由光电二极管检测，随后通过锁相放大器提取受激拉曼信号。使用控制软件，将泵浦波长输入并调谐至852纳米。

使用SRS显微镜对细菌成像时，将C到D的振动频率调整至2,168波数。使用功率计测量激光功率。通过调节激光输出端前的半波片，将样品处的泵浦激光功率设为八毫瓦，样品处的斯托克斯激光功率设为50毫瓦。

将标准样品DMSO-d6置于样品台上，使用60倍水浸物镜将泵浦激光和斯托克斯激光聚焦到样品上。通过调节反射镜的螺丝，对泵浦光束和斯托克斯光束进行空间准直，并将两束光导入配备有二维振镜系统的直立显微镜，用于激光扫描。在软件控制面板中，设置每幅SRS图像包含200×200个像素，像素驻留时间为30微秒。

单幅图像的总采集时间约为1.2秒。将步长设置为150纳米，从而使图像尺寸约为30乘以30平方微米。系统优化完成后，取出标准样品，将细菌样品置于60倍水浸物镜下的样品载物台上。

开始对细菌样品进行受激拉曼散射（SRS）成像。每份样品至少成像三个视野。通过在CD和CH区域的自发拉曼微光谱法，测量孵育时间对氘掺入的影响。

单个细菌在氘代孵育时间内CD与CH强度比值图显示，随着孵育时间从0分钟延长至180分钟，CD与CH的强度比逐渐升高。对铜绿假单胞菌在含有庆大霉素和70%氘代培养基中孵育后进行受激拉曼散射（SRS）成像。进一步的定量统计分析表明，当庆大霉素浓度达到每毫升2微克或更高时，细菌的CD信号显著低于未使用庆大霉素处理的样本。

在0.60的截止强度阈值下，得出结论：当庆大霉素浓度达到每毫升2微克及以上时，铜绿假单胞菌的代谢活动受到抑制。在标准MHB培养基中，铜绿假单胞菌对庆大霉素的SC-MIC被确定为每毫升2微克，与通过肉汤微量稀释法测定的每毫升4微克的MIC相比，差异在1倍范围内。采用SRS成像技术对掺入大肠杆菌的尿液样本进行了快速抗菌药物敏感性试验（AST）。

大肠杆菌污染尿液样本对阿莫西林的SC-MIC测定结果为每毫升4微克，与常规肉汤稀释法在标准MHB培养基中测定纯大肠杆菌的MIC（每毫升8微克）具有相同的敏感性读数。通过受激拉曼散射（SRS）成像研究了铜绿假单胞菌污染人血样本的快速药敏试验适用性。在波数为2,168 cm⁻¹处的SRS图像中，圆二色性（CD）强度主要来源于活细菌代谢掺入氘所产生的细菌信号。

铜绿假单胞菌在血液中的SC-MIC被确定为每毫升2微克，与铜绿假单胞菌在常规培养基中的标准MIC结果高度一致。用于抗菌药物敏感性试验的细菌细胞数量保持在约每毫升5×10⁵个菌落形成单位，符合临床与实验室标准协会的推荐。较高的细菌浓度可能导致最低抑菌浓度升高。

将原位病原体鉴定与快速抗菌药物敏感性检测诊断相结合，在临床转化方面具有巨大潜力，可实现适时鉴定合适的抗菌药物，从而进行精准治疗。