Name: 通过受激拉曼散射成像对氘掺入单个细菌进行快速抗菌药敏试验 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-14T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: 了解利用受激拉曼散射成像技术对氘掺入单个细菌进行快速抗菌药敏试验的方法。该技术可在2.5小时内完成尿液和血液样本的药敏检测，为临床精准抗感染治疗提供及时依据。

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本工作获得了美国国立卫生研究院（NIH）R01AI141439（资助对象：J.-X.C 和 M.S）和 R35GM136223（资助对象：J.-X.C）的资助。

使用人血标本符合波士顿大学机构审查委员会（IRB）和美国国立卫生研究院（NIH）的指导方针。具体而言，这些标本来源于血库，且已完全去标识化。根据机构审查委员会（IRB）的判定，此类标本不被视为人类受试者。&#160;波士顿大学办公室
1. 细菌和抗生素储备液的制备
<ol>
	<li>在1.5 mL离心管中，用无菌1×磷酸盐缓冲液（PBS）或二甲基亚砜（DMSO）溶剂配制抗生素（硫酸庆大霉素或阿莫西林）储备液，浓度为1 mg/mL。将硫酸庆大霉素溶解于&#160;无菌PBS溶液中，阿莫西林溶解于无菌DMSO溶剂中。随后，按照建议将抗生素溶液储存于2–8 °C。</li>
	<li>为制备含D2O的阳离子调节穆勒-欣顿肉汤（MHB）培养基，将220 mg MHB肉汤基础成分加入10 mL D2O中，以制备含100% D2O的培养基。使用孔径为200 nm的滤器过滤溶液以实现灭菌。 
	注意：在后续步骤中配制和灭菌培养基溶液时，请始终采用本方案。</li>
	<li>为准备用于SRS成像的细菌样品，向无菌圆底培养管中加入2 mL不含氘的普通MHB培养基，并在37 °C下预热。</li>
	<li>使用无菌接种环从胰蛋白胨大豆琼脂平板上的新鲜培养物中挑取单个细菌菌落（Escherichia coli BW 25113 或 Pseudomonas aeruginosa ATCC 47085），然后将其悬浮于预热的培养基中，轻轻涡旋混匀以制备细菌悬液。</li>
	<li>将细菌在37 °C、200转/分钟（rpm）的摇床中孵育，直至达到对数生长期。</li>
</ol>
2. 在抗生素存在下进行D2O掺入处理（图2a）
<ol>
	<li>使用分光光度计在600 nm波长下测量光密度（OD），检测细菌浓度。</li>
	<li>使用不含氘的普通MHB培养基稀释细菌溶液，使最终细胞浓度达到8 × 105 CFU/mL。轻轻涡旋以混匀细菌细胞。</li>
	<li>将细菌溶液分别分装为每管300 µL，共七管，放入1.5 mL微量离心管中；另取一管分装600 µL细菌溶液。</li>
	<li>向含有600 µL细菌溶液的微量离心管中加入4.8 µL抗生素（庆大霉素或阿莫西林）储备液（1 mg/mL），使最终抗生素浓度为8 µg/mL。</li>
	<li>从含8 µg/mL抗生素的细菌溶液中取出300 µL，加入另一管含300 µL细菌溶液的管中，配制出抗生素浓度为4 µg/mL的两倍稀释溶液。</li>
	<li>对测试抗生素（庆大霉素或阿莫西林）进行连续两倍梯度稀释，直至达到最低浓度（0.25 µg/mL）的微量离心管，并从中弃去300 µL。庆大霉素和阿莫西林的系列浓度范围均为0.25 µg/mL – 8 µg/mL。
	<ol>
		<li>保留一管不加抗生素作为空白对照。该管作为阳性对照，用于检测在无抗生素处理但有D2O处理条件下的细菌代谢活性。</li>
		<li>保留一管既不加抗生素也不含&#160;D2O，作为阴性对照。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将细菌分装液与含特定抗生素（庆大霉素或阿莫西林）的MHB培养基在37 °C下孵育1小时。</li>
	<li>在孵育期间，使用含100% D2O的培养基，按照步骤2.6中制备的相同抗生素浓度梯度，准备抗生素的系列稀释液。庆大霉素和阿莫西林的系列浓度范围均为0.25 µg/mL – 8 µg/mL。</li>
	<li>抗生素处理1小时后，将梯度稀释的抗生素与含100% D2O的MHB培养基各700 µL，分别加入300 µL经相应浓度抗生素预处理的细菌溶液中（该溶液在步骤&#160;2.6中已制备）。
	<ol>
		<li>例如，向经8 µg/mL抗生素预处理的300 µL细菌溶液中加入700 µL含8 µg/mL抗生素的100% D2O-MHB培养基。以相同方式依次向对应浓度的各管转移，并通过反复吹打混匀。</li>
		<li>向300 µL不含抗生素的细菌溶液（步骤2.6.1中制备）中加入700 µL不含抗生素的100% D2O-MHB培养基，作为空白对照。</li>
		<li>在37 °C、200 rpm的摇床中继续孵育30分钟。 
		注：此步骤中，测试体系中D2O的最终浓度为70%。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>首先将1 mL经抗生素和D2O处理的细菌样品在4 °C下以6200 × g离心5分钟，然后用纯化水洗涤两次。最后将样品固定于10%福尔马林溶液中，并在4 °C下保存。</li>
</ol>
3. 尿液环境中细菌的制备（图2b）
<ol>
	<li>为制备处于对数生长期的 E. coli BW 25113，请按照步骤 1.4 和 1.5 进行操作。</li>
	<li>使用分光光度计在 600 nm 波长下测定 OD&#160;，以检测细菌浓度。</li>
	<li>为模拟临床尿路感染（UTI）样本14,18,41，将 E. coli 溶液加入 10 mL 去标识尿液中，使最终细胞浓度达到 106 CFU/mL。</li>
	<li>使用 5 µm 滤膜过滤接种了 E. coli 的尿液，然后将菌液分装为每管 300 μL，共七管，另取一管分装 600 µL 菌液至 1.5 mL 微量离心管中。</li>
	<li>在抗生素存在条件下进行 D2O 掺入处理，并按照之前 2.4 至 2.10 步骤所述进行样品采集&#160;。</li>
</ol>
4. 血液环境中细菌的制备（图2c）
<ol>
	<li>为制备处于对数生长期的Pseudomonas aeruginosa ATCC 47085，请按照步骤1.4和1.5进行操作。</li>
	<li>为模拟临床血流感染样本42,43，将P. aeruginosa接种至1 mL去标识人血中，使其浓度达到&#160;107 CFU/mL。</li>
	<li>加入9 mL无菌纯化水以裂解血液。</li>
	<li>使用5 µm滤膜过滤接种了P. aeruginosa的血液样本，然后在4 °C下以6200 × g离心5分钟，将细菌收集至1 mL体积。向细菌悬液中加入9 mL预温的普通MHB培养基，并轻轻涡旋混匀，最终细菌浓度为106 CFU/mL。&#160;</li>
	<li>将接种了P. aeruginosa的血液样本按每份300 μL分装至7个1.5 mL微量离心管中，将细菌悬液按每份600 µL分装至1个1.5 mL微量离心管中。</li>
	<li>按照之前2.4至2.10步骤所述，进行D2O掺入处理，在抗生素存在条件下进行处理并收集样本。</li>
</ol>
5. 单个细菌中D2O代谢掺入的SRS成像
<ol>
	<li>取1 mL固定后的细菌溶液，用纯化水洗涤，然后在4 °C下以6200 × g 离心5分钟。弃去上清液，将细菌溶液浓缩至约20 µL。</li>
	<li>将细菌溶液滴加到预先涂有聚-L-赖氨酸的盖玻片上，夹片并封片，用于SRS成像。</li>
	<li>使用SRS显微镜在C-D振动频率2168 cm-1处对细菌进行成像。
	<ol>
		<li>通过计算机上的控制软件输入并调节泵浦激光波长至852 nm。</li>
		<li>使用功率计测量激光功率，通过调节激光输出端前的半波片，将样品处的泵浦激光功率设为约8 mW，斯托克斯激光功率设为约40 mW。 
		注意：在SRS显微镜中，一台重复频率为80 MHz的可调谐飞秒激光器提供泵浦光（680 至 1300 nm）和斯托克斯光（1045 nm）激发光源。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过调节反射镜上的螺丝，对泵浦光束和斯托克斯光束进行空间准直，并将两束光导入配备二维振镜扫描系统的正置显微镜中。
	<ol>
		<li>使用60倍水浸物镜将泵浦激光和斯托克斯激光聚焦到样品上。</li>
		<li>使用油浸聚光镜从前向收集样品发出的信号。</li>
		<li>在信号进入光电二极管之前，使用带通滤光片滤除斯托克斯激光。</li>
		<li>通过锁相放大器提取受激拉曼信号，并由光电二极管检测信号。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在软件控制面板中设置每幅SRS图像为200 × 200像素，像素驻留时间为30 µs，单幅图像总采集时间约为1.2秒。将步进距离设为150 nm，使图像尺寸约为30 × 30 µm2。每份样品至少采集三个不同视野。</li>
</ol>
6. 图像处理与数据分析（&#160;图3）
<ol>
	<li>为获得平均的C-D信号强度，使用ImageJ软件打开并处理SRS图像。</li>
	<li>首先，在ImageJ软件中点击图像 | 类型 | 8位，将SRS图像转换为8位图像，并通过点击编辑 | 反转按钮实现颜色反转。</li>
	<li>然后，点击处理 | 滤波 | 高斯模糊对图像进行高斯模糊滤波，并将标准差（半径）设置为1。</li>
	<li>使用图像阈值调整来选择细菌区域。点击图像 | 调整 | 阈值，确保所选细菌的大小与原始SRS图像中的一致。通过调整大小阈值以排除微小颗粒，点击应用。</li>
	<li>点击分析 | 颗粒分析按钮，对细菌进行标记并确定其面积。</li>
	<li>在ROI管理器中点击显示全部按钮，将其应用于原始未处理的SRS图像，标记相同的细菌区域，并在ROI管理器中点击测量按钮，确定每个数据点的平均强度。</li>
	<li>在原始SRS图像中圈出背景区域并测量其平均强度。每个细菌的平均C-D强度通过减去背景信号强度获得。</li>
</ol>
7. 通过 SC-MIC 定量测定抗菌敏感性
注意：根据细菌在不同药物浓度暴露下代谢活跃状态与代谢受抑制状态的SRS C-D强度的统计学分析，确定以0.60作为判断SC-MIC的截断值40。抗生素敏感组和耐药组的C-D强度均符合正态分布。
<ol>
	<li>绘制受试者工作特征（ROC）曲线，并在0.60处评估截断阈值。基于该截断值，可将SC-MIC定义为抗生素疗效的指标，用于区分代谢失活组与代谢活跃组。</li>
	<li>为定量分析SRS成像数据，绘制经系列稀释抗生素浓度处理后各细菌组的C-D信号强度直方图。彩色数据点代表&#160;不同单个细菌。</li>
	<li>将经抗生素处理组的C-D强度归一化至未接受抗生素处理对照组的平均强度。通过在C-D区域量化不同抗生素浓度下的SRS信号强度，并采用0.60作为截断值，确定不同细菌与抗生素组合的SC-MIC结果。</li>
	<li>将SC-MIC检测结果与采用传统肉汤微量稀释法测定的MIC进行验证和比较。</li>
	<li>根据美国临床和实验室标准协会（CLSI）标准，基于SRS代谢成像结果，对每种测试菌株的敏感性类别判定为&#34;敏感&#34;、&#34;耐药&#34;或&#34;中介&#34;。</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

通过单细胞SRS代谢成像，在2.5小时内从样本获取快速药敏试验（AST）结果，即测定细菌代谢活性对抗生素处理的响应，从而获得单细胞最低抑制浓度（SC-MIC）。通过监测细菌对氘代化合物（D）的代谢掺入，可检测细菌代谢活性的响应及抗菌药物敏感性。2利用C-D键的SRS成像进行生物分子合成的O研究。由于水在活细胞中普遍存在，SRS代谢成像为快速药敏试验（AST）提供了一种通用方法。该快速AST方法可用于在复杂的生物环境（如尿液或全血）中单细菌水平检测细菌。在尿液和血液中培养细菌1.5小时后即可确定单细胞MIC（SC-MIC），这一进展被认为将彻底改变尿路感染（UTI）和血流感染（BSI）的诊断模式，从耗时的依赖培养的方法转变为不依赖培养的新范式。 原位 因此，与传统的肉汤微量稀释法相比，该方法显著缩短了诊断时间，为临床转化铺平了道路，有助于及时确定合适的抗菌药物，实现精准治疗。
本文所述的抗生素处理方案遵循 CLSI 指南，其中推荐的 MHB 培养基通常可用于多种微生物的培养。一个关键参数是，用于抗菌药物敏感性试验的细菌细胞数量应保持在约 5 ×...

抗菌药物耐药性（AMR）对传染病的有效治疗构成了日益严重的全球性威胁1据预测，若不采取行动应对耐药菌，到2050年，抗菌素耐药性（AMR）每年将额外导致1000万人死亡，并造成全球经济损失100万亿美元。1,2这强调了对快速且创新的诊断方法的迫切需求 &#65279;传染病细菌的抗生素敏感性试验（AST），以减缓耐药细菌的出现并降低相关死亡率3为确保最佳临床治疗效果，必须在24小时内启动有效治疗。然而，目前的金标准方法（如纸片扩散法或肉汤稀释法）通常需要至少24小时的临床样本预培养过程，以及额外16至24小时以获得最低抑菌浓度（MIC）结果。总体而言，这些方法耗时过长，无法为临床感染性疾病的即时治疗决策提供指导，从而导致抗菌药物耐药性的出现与传播4.
基因型AST方法（如基于聚合酶链式反应（PCR）的技术）5已用于快速检测。此类技术通过检测特定的耐药基因序列来提供快速的AST结果。它们不依赖于耗时的细胞培养；然而，仅能检测已知的特定耐药基因序列。因此，其应用范围局限于特定种类的细菌或特定的耐药机制。此外，这些方法无法提供用于治疗决策的MIC结果6,7。此外，为克服这些局限性，多种新型表型快速AST方法正在研发中8，包括微流控装置9,10,11,12,13、光学设备14,15,16、定量核酸拷贝数的表型AST方法17,18，以及拉曼光谱技术19,20,21,22,23,24。这些方法缩短了获得AST结果所需的时间，但大多数仅适用于细菌分离株，不能直接用于临床标本，且仍需要长时间的预培养。
在本研究中，我们提出了一种通过SRS成像监测细胞代谢活性，快速测定尿液和全血中细菌敏感性的方法。水（H2O）参与了活细胞中绝大多数重要的生物分子合成过程。作为水的一种同位素体，通过NADPH中的氧化还原活性氢原子与D₂O中的D原子之间的酶催化H/D交换反应，D₂O可被引入细胞代谢产物中。2氧，氘可以掺入细胞内的生物量中25,26. 氘标记的NADPH介导了氘代脂肪酸的合成反应。D2氨基酸（AAs）反应中O的掺入导致氘化蛋白质的生成26 (图1通过这种方法，单个微生物细胞中新合成的含碳-氘键（C-D）的生物分子可作为通用的代谢活性标志物进行检测。为了读取 从头合成 合成的C-D键，拉曼光谱作为一种提供生物分子特异性与定量化学信息的多功能分析工具，被广泛用于测定抗菌药物敏感性，并可将检测时间显著缩短至数小时内27,28,29,30然而，由于拉曼散射过程本身效率较低，自发拉曼光谱的检测灵敏度较低，因此使用自发拉曼光谱获取实时成像结果具有挑战性。相干拉曼散射（CRS），包括相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）和受激拉曼散射（SRS），由于利用相干光场产生比自发拉曼光谱高数个数量级的信号，因而实现了高灵敏度检测，从而能够实现高速、特异性的 &#65279;单细胞水平的定量化学成像31,32,33,34,35,36,37,38,39.
本文基于我们最近的研究40，介绍了一种通过飞秒受激拉曼散射（SRS）C-D成像技术，在单细胞水平上快速测定细菌在常规培养基、尿液及全血环境中掺入重水（D2O）后的代谢活性和抗菌药物敏感性的实验方案。飞秒SRS成像技术可在2.5小时内实现对抗生素作用下单个细菌代谢失活浓度（SC-MIC）的监测。SC-MIC结果通过标准的肉汤微量稀释法MIC试验进行了验证。与传统方法相比，本方法显著缩短了检测时间，适用于尿路感染（UTI）和血流感染（BSI）病原菌的抗菌药物敏感性测定，为临床中实现单细胞水平的快速表型抗菌药物敏感性试验提供了新的可能。

<table><tbody><tr><td>声光调制</td><td>Gooch&amp;Housego</td><td>R15180-1.06-LTD</td><td>调制斯托克斯激光束</td></tr><tr><td>氨苄西林</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8523-5G</td><td></td></tr><tr><td>带通滤光片</td><td>Chroma</td><td>HQ825/150m</td><td>在光电二极管前阻断斯托克斯激光束</td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1016-100G</td><td>阳离子调节</td></tr><tr><td>阳离子调节的穆勒-欣顿肉汤</td><td>Fisher Scientific</td><td>B12322</td><td>通过肉汤稀释法进行微生物的抗菌药物敏感性试验</td></tr><tr><td>离心机</td><td>Thermo Scientific</td><td>75002542</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>VWR</td><td>16004-318</td><td></td></tr><tr><td>带卡扣盖的培养管</td><td>Fisher brand</td><td>149569B</td><td></td></tr><tr><td>达托霉素</td><td>Acros</td><td>A0386346</td><td></td></tr><tr><td>重水</td><td></td><td>151882</td><td>用于溶解抗生素的有机溶剂</td></tr><tr><td>氘代重水（d6）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>156914</td><td>作为标准品用于校准受激拉曼散射（SRS）成像系统</td></tr><tr><td>大肠杆菌 BW 25113</td><td>大肠杆菌遗传保藏中心</td><td>7636</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 聚丙烯微量离心管 1.5 mL</td><td>Fisher brand</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>硫酸庆大霉素</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G4918</td><td></td></tr><tr><td>亲水性聚偏二氟乙烯滤膜</td><td>Millipore-Sigma</td><td>SLSV025NB</td><td>孔径 5 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>ImageJ 软件</td><td>NIH</td><td>版本：2.0.0-rc-69/1.52t</td><td>图像处理与分析</td></tr><tr><td>设定为 37 &amp;deg;C 的恒温振荡培养摇床</td><td>VWR</td><td>97009-890</td><td></td></tr><tr><td>接种环</td><td>Sigma</td><td>BR452201-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>InSight DeepSee 飞秒脉冲激光器</td><td>Spectra-Physics</td><td>型号：insight X3</td><td>可调谐激光源及固定于 1045 nm 的激光源，用于 SRS 成像</td></tr><tr><td>锁相放大器</td><td>Zurich Instrument</td><td>HF2LI</td><td>解调 SRS 信号</td></tr><tr><td>油浸聚光镜</td><td>Olympus</td><td>U-AAC</td><td>数值孔径 1.4</td></tr><tr><td>铜绿假单胞菌 ATCC 47085 (PAO1)</td><td>美国模式培养物集存库</td><td>ATCC 47085</td><td></td></tr><tr><td>光电二极管</td><td>Hamamatsu</td><td>S3994-01</td><td>探测器</td></tr><tr><td>聚丙烯圆锥形离心管 15 mL</td><td>Falcon</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>聚丙烯滤膜</td><td>Thermo Scientific</td><td>726-2520</td><td>孔径 0.2 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>无菌培养皿</td><td>Corning</td><td>07-202-031</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 注射器</td><td>Fisher brand</td><td>14955459</td><td></td></tr><tr><td>紫外/可见光分光光度计</td><td>Beckman Coulter</td><td>型号：DU 530</td><td>在 600 nm 波长下测量光密度</td></tr><tr><td>涡旋混合器</td><td>VWR</td><td>97043-562</td><td></td></tr><tr><td>水镜物镜</td><td>Olympus</td><td>UPLANAPO/IR</td><td>60&amp;times;，数值孔径 1.2</td></tr></tbody></table>

基于单个细菌中氘掺入的受激拉曼散射成像的快速抗菌药物敏感性测试

Rapid Antimicrobial Susceptibility Testing by Stimulated Raman Scattering Imaging of Deuterium Incorporation in a Single Bacterium

为减缓并防止耐药性感染的传播，迫切需要快速的抗菌药物敏感性试验（AST）以 &#65279;定量确定 &#65279;病原体的抗菌效应 &#65279;传统方法依赖长时间培养，通常需要数天才能完成抗菌药物敏感性试验，且无法直接用于临床样本。本文报道了一种快速的抗菌药物敏感性试验方法 &#65279;由重水（D2O）刺激拉曼散射（SRS）成像技术实现的方法2O)代谢掺入。通过SRS成像监测单个细菌水平下D₂O向生物量中的代谢掺入及其在抗生素作用下的代谢活性抑制情况。2O进入生物量以及单个细菌在接触抗生素后代谢活性受到抑制的情况，通过受激拉曼散射（SRS）成像进行监测。&#65279; 细菌在接触抗生素后，经过总计2.5小时的样品制备与检测，即可获得单细胞代谢失活浓度（SC-MIC）。此外，该快速AST方法可直接应用于复杂生物环境中的细菌样本，如尿液或全血。氘掺入的SRS代谢成像对临床快速单细胞表型AST具有变革意义。

通过自发拉曼微光谱在 C-D（2070 至 2250 cm-1）和 C-H（2,800 至 3,100 cm-1）区域测量孵育时间对氘掺入的影响（图 4a）。在含 70% D2O 培养基中培养的P. aeruginosa单细胞随时间变化的拉曼光谱显示，随着孵育时间从 0 延长至 180 分钟，CD/CH 峰强度逐渐增强（图 4b）。单个微生物细胞中 C-D 丰度的增加表明 D2O 已被掺入细胞内生成的氘标记生物分子中。
在23小时的孵育期间，D2O标记浓度超过50%会显著影响细菌代谢27。我们观察到，在25小时孵育期间，当D2O标记浓度高于70%时，细菌生长受到抑制（图S1）。我们采用金标准肉汤稀释法进行了最低抑菌浓度（MIC）测定，并...

本方案通过单细胞刺激拉曼散射成像检测D2O代谢，可在2.5小时内完成快速抗菌药物敏感性试验（AST）。该方法适用于尿液或全血环境中的细菌，对临床快速单细胞表型抗菌药物敏感性试验具有变革意义。

为减缓并防止耐药性感染的传播，迫切需要快速的抗菌药物敏感性试验（AST）以……

在尿液和血液样本中，可在2.5小时内获得快速的抗菌药物敏感性检测结果，相较于传统的肉汤微量稀释法，分析时间显著缩短。该方法能够在全血等复杂环境中监测细菌的代谢活性。首先，使用分光光度计在600纳米波长下测定样品的光密度，以确认细菌浓度。为了达到每毫升8 × 10⁵菌落形成单位（CFU）的最终细胞浓度，使用不含氘的普通MHB培养基稀释细菌溶液。将细菌细胞通过涡旋混匀后，取300微升等份的细菌溶液分别加入七个1.5毫升微量离心管中，并取600微升等份的细菌溶液加入另一个1.5毫升微量离心管中。然后，向含有600微升细菌溶液的微量离心管中加入4.8微升抗生素储备液，以获得8微克/毫升的最终抗生素浓度。取300微升含抗生素的细菌溶液，加入至一份300微升不含抗生素的细菌溶液中，制成两倍稀释的溶液，最终抗生素浓度为4微克/毫升。对测试抗生素进行两倍倍比稀释，直至达到最低浓度0.25微克/毫升。从最后一个微量离心管中弃去300微升溶液。将一管不加抗生素但含氘的样品作为阳性对照，另一管不加氘的作为阴性对照。将细菌等分试样与含有抗生素的MHB培养基在37°C下孵育一小时。同时，用含100%氘的MHB培养基制备抗生素的系列稀释液，其浓度梯度与之前所述相同。孵育1小时后，向300微升已用抗生素预处理的细菌中加入700微升用含100%氘的MHB培养基进行系列稀释的抗生素，抗生素浓度与预处理时相同。通过反复吹打数次使混合物混匀。作为阳性对照，向300微升未加抗生素的细菌中加入700微升不含抗生素但含100%氘的MHB培养基。加入 700 微升不含抗生素且含 0% 氘的 MHB 培养基至 300 微升不含抗生素的细菌中，作为阴性对照。将所有微量离心管在 37 摄氏度、每分钟 200 转的条件下孵育 30 分钟。孵育结束后，在 4 摄氏度下以 6,200 × g 离心力离心 1 毫升经抗生素和氘处理的细菌样品 5 分钟。然后用纯化水将沉淀洗涤两次。用体积分数为10%的福尔马林溶液固定样品，并在4摄氏度下保存。通过分光光度计在600纳米波长下测定新制备细菌样品的光密度，以检测大肠杆菌（Escherichia coli）的浓度。为了模拟临床尿路感染样本，将大肠杆菌（Escherichia coli）样本加入10毫升去标识的尿液样本中，使其终浓度达到每毫升10⁶ CFU。使用5微米滤膜过滤含大肠杆菌的尿液，并将过滤后的细菌溶液分装为七份，每份300微升，置于1.5毫升微量离心管中，另取一份600微升置于一个1.5毫升微量离心管中。按照先前所述方法，在抗生素存在条件下进行氘代标记处理。为了模拟临床血流感染样本，将铜绿假单胞菌加入1毫升去识别的人类血液中，使其终浓度达到每毫升10的6次方菌落形成单位（CFU/mL）。为裂解血液，加入9毫升无菌纯化水。使用5微米滤膜过滤含有铜绿假单胞菌的加标血液。然后，将过滤后的样品在4°C条件下以6,200 × g离心5分钟，收集细菌至1毫升体积。离心后，将添加了铜绿假单胞菌的血液溶液分装为每份300微升，分别加入七个1.5毫升微量离心管中，并将600微升的菌液加入一个1.5毫升微量离心管中，在抗生素存在下进行氘代标记处理，处理方法同前。样品制备时，用纯化水洗涤1毫升固定后的细菌溶液，然后将洗涤后的细菌溶液在4°C条件下以6,200 × g离心5分钟。吸去上清液，并用无菌水将细菌溶液浓缩至约20微升。将细菌溶液滴加到聚-L-赖氨酸包被的盖玻片上，再用另一张盖玻片夹紧并密封样品。在受激拉曼散射（SRS）显微镜中，一台可调谐的飞秒激光器以80兆赫的重复频率提供泵浦光和斯托克斯激发激光。斯托克斯光束通过声光调制器以2.4兆赫进行调制。两束光通过二向色镜共线合并。随后，泵浦光束和斯托克斯光束被导入一个自制的激光扫描显微镜，利用二维振镜实现激光扫描。60倍水镜将激光聚焦到样品上，油镜聚光镜收集来自样品的信号。使用两个滤光片滤除斯托克斯光束，而泵浦光束由光电二极管检测，随后通过锁相放大器提取受激拉曼信号。使用控制软件，将泵浦波长输入并调谐至852纳米。使用SRS显微镜对细菌成像时，将C到D的振动频率调整至2,168波数。使用功率计测量激光功率。通过调节激光输出端前的半波片，将样品处的泵浦激光功率设为八毫瓦，样品处的斯托克斯激光功率设为50毫瓦。将标准样品DMSO-d6置于样品台上，使用60倍水浸物镜将泵浦激光和斯托克斯激光聚焦到样品上。通过调节反射镜的螺丝，对泵浦光束和斯托克斯光束进行空间准直，并将两束光导入配备有二维振镜系统的直立显微镜，用于激光扫描。在软件控制面板中，设置每幅SRS图像包含200×200个像素，像素驻留时间为30微秒。单幅图像的总采集时间约为1.2秒。将步长设置为150纳米，从而使图像尺寸约为30乘以30平方微米。系统优化完成后，取出标准样品，将细菌样品置于60倍水浸物镜下的样品载物台上。开始对细菌样品进行受激拉曼散射（SRS）成像。每份样品至少成像三个视野。通过在CD和CH区域的自发拉曼微光谱法，测量孵育时间对氘掺入的影响。单个细菌在氘代孵育时间内CD与CH强度比值图显示，随着孵育时间从0分钟延长至180分钟，CD与CH的强度比逐渐升高。对铜绿假单胞菌在含有庆大霉素和70%氘代培养基中孵育后进行受激拉曼散射（SRS）成像。进一步的定量统计分析表明，当庆大霉素浓度达到每毫升2微克或更高时，细菌的CD信号显著低于未使用庆大霉素处理的样本。在0.60的截止强度阈值下，得出结论：当庆大霉素浓度达到每毫升2微克及以上时，铜绿假单胞菌的代谢活动受到抑制。在标准MHB培养基中，铜绿假单胞菌对庆大霉素的SC-MIC被确定为每毫升2微克，与通过肉汤微量稀释法测定的每毫升4微克的MIC相比，差异在1倍范围内。采用SRS成像技术对掺入大肠杆菌的尿液样本进行了快速抗菌药物敏感性试验（AST）。大肠杆菌污染尿液样本对阿莫西林的SC-MIC测定结果为每毫升4微克，与常规肉汤稀释法在标准MHB培养基中测定纯大肠杆菌的MIC（每毫升8微克）具有相同的敏感性读数。通过受激拉曼散射（SRS）成像研究了铜绿假单胞菌污染人血样本的快速药敏试验适用性。在波数为2,168 cm⁻¹处的SRS图像中，圆二色性（CD）强度主要来源于活细菌代谢掺入氘所产生的细菌信号。铜绿假单胞菌在血液中的SC-MIC被确定为每毫升2微克，与铜绿假单胞菌在常规培养基中的标准MIC结果高度一致。用于抗菌药物敏感性试验的细菌细胞数量保持在约每毫升5×10⁵个菌落形成单位，符合临床与实验室标准协会的推荐。较高的细菌浓度可能导致最低抑菌浓度升高。将原位病原体鉴定与快速抗菌药物敏感性检测诊断相结合，在临床转化方面具有巨大潜力，可实现适时鉴定合适的抗菌药物，从而进行精准治疗。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

通过受激拉曼散射成像对氘掺入单个细菌进行快速抗菌药敏试验

来源：Zhang, M. 等，通过受激拉曼散射成像检测单个细菌中氘掺入实现快速抗菌药物敏感性测试。J. Vis. Exp.

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原子力显微镜-红外光谱法（AFM-IR）为细菌研究提供了强大的平台，能够实现纳米级分辨率。该技术可在单细胞水平上对细菌进行亚细胞结构变化的成像（例如细胞分裂过程中）以及化学成分的比较研究（例如由药物耐药性引起的差异）。...

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基于重组酶聚合酶扩增/Cas12a系统的Acinetobacter baumannii感染快速特异性检测

了解利用受激拉曼散射成像技术对氘掺入单个细菌进行快速抗菌药敏试验的方法。该技术可在2.5小时内完成尿液和血液样本的药敏检测，为临床精准抗感染治疗提供及时依据。

基于单个细菌中氘掺入的受激拉曼散射成像的快速抗菌药物敏感性测试

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