用于骨髓源性肥大细胞培养的结晶纳米纤维素包埋琼脂糖生物材料墨水的制备

该协议提供了一种简单快速的方法来筛选候选生物材料油墨，以便在复杂的3D生物打印实验之前对敏感的原代细胞和免疫细胞产生潜在的细胞毒性作用。在生物材料墨水构建体上孵育免疫细胞后，可以通过温和洗涤来轻松从构建体中检索细胞，以进行下游细胞毒性或生物标志物分析。该协议与组织工程直接相关，其中用于移植的生物打印组织必须由原代细胞和生物相容性生物材料油墨构建。

首先，准备一个生物墨盒以安装到INKREDIBLE + 3D生物打印机上。首先，从三毫升生物材料墨盒上取下蓝色端盖，并将无菌的22号锥形生物打印喷嘴固定在生物墨盒的Luer锁定端。将打印头一或PH1的气压供应管连接到墨盒的另一端，并将墨盒及其连接的锥形生物打印喷嘴插入PH1的垂直插槽中。

接下来，将墨盒牢固地固定在PH1中，锥形生物打印喷嘴延伸到打印头下方。顺时针拧紧PH1上的螺钉，直到手指拧紧以将生物墨盒锁定到位。请注意，3D生物打印可以在PH2留空的情况下执行。

打开生物打印机电源，并通过 USB 2.0 电缆在连接到 3D 生物打印机的 PC 上启动生物打印机软件。在软件中，单击连接按钮将其与3D生物打印机同步。观察3D生物打印机主控制菜单中的三个选项。

首先，准备生物打印。第二，实用菜单。第三，状态屏幕。

选择"准备生物打印"选项，然后向下滚动到并选择"主轴"选项。成功校准XYZ轴后，打印床的高度将略微降低，打印头将重新定位到打印床中心点上方。要继续进行24孔板中生物打印的起点校准，请从其密封的塑料包装中取出无菌的24孔培养板，并在板底侧的孔D1中心点上用永久标记标记点。

取下印版盖，将24孔培养板放在打印床上，D1孔位于打印床的左前角。在主控制菜单上，选择实用程序菜单，然后选择移动轴。沿 X 轴和 Y 轴以 1 毫米为增量移动打印头，直到 PH1 的锥形生物打印喷嘴直接位于孔 D1 下方标记的点上。如有必要，通过以0.1毫米为增量移动打印头来微调锥形生物打印喷嘴在点上的位置。

当直接在3D生物打印机的控制面板屏幕中指示的D1井中心上方时，记录锥形生物打印喷嘴的X和Y坐标，并标记坐标。接下来，以一毫米为增量抬起打印床，直到孔D1的底部几乎接触到安装在打印头一中的锥形生物打印喷嘴。如有必要，以 0.1 毫米为增量微调打印床的移动。

从实用程序菜单中，选择 Z 轴校准选项，然后进一步选择并确认存储 Z 校准选项。返回主菜单，然后选择准备生物打印选项。向下滚动到并选择校准 Z 选项。

使用正确的起始点坐标更新 24 孔板几何代码或 G 代码。在生物打印软件上打开提供的24孔G代码文件。使用在前面的步骤中获得的值更新第一行上的 X 和 Y 坐标，并以新名称保存文件。

确保气动泵与 INKREDIBLE+3D 生物打印机的后进气口紧密连接，然后将其打开。拉出位于 INKREDIBLE+3D 生物打印机右侧的前控制旋钮。确保位于生物打印机正面的PH1和PH2数字压力表的读数均接近零千帕斯卡。

顺时针缓慢旋转前向控制旋钮，直到左侧 PH1 仪表上指示的压力达到 12 千帕斯卡。将折叠的薄纸或一块防水密封膜放在已安装墨盒的打印喷嘴下方，注意不要接触打印喷嘴。从 3D 生物打印机的主控制菜单中，选择准备生物打印机。

导航到并选择打开 PH1。请注意，生物墨水开始从打印喷嘴挤出。如有必要，通过顺时针旋转控制旋钮来增加挤出压力，直到生物墨水在连续长丝中挤出并记录新的压力设置。

选择关闭PH1以停止生物墨水的挤出。从打印床上取出含有挤出生物墨水的薄纸或薄膜，然后关闭生物打印机门。要以24孔板格式对直线水凝胶基板进行3D生物打印，请从主控制菜单中选择实用程序菜单，然后选择禁用SD打印，这将允许生物打印机软件将G代码文件传输到3D生物打印机进行打印。

单击生物打印机软件中的加载按钮，然后选择更新的24孔板G代码文件。在软件右侧控制面板中，选择打印预览选项卡，然后单击打印按钮以开始在D1井中进行生物打印。完成直线结构的生物打印后，用盖子盖住24孔板，并将其移至II类生物安全柜中。将每个直线结构浸入两滴无菌的50毫摩尔氯化钙溶液中，并在室温下孵育五分钟。

小心地从每个孔结构中吸出氯化钙溶液，并在一毫升1X PBS中冲洗一次，以除去多余的氯化钙。为了防止生物打印的水凝胶构建体脱水，将3D生物打印的直线构建体保持在新鲜的1X PBS中，直到骨髓来源的肥大细胞准备好接种到构建体上。基于流式细胞术分析的BMMC的前向和侧向散射参数，观察到与在没有CNC琼脂糖D-甘露醇水凝胶底物的情况下培养的BMMC相比，具有最高CNC浓度的水凝胶底物没有改变BMMC的天然尺寸或粒度。

对BMMC对碘化丙啶的渗透性的流式细胞术分析表明，测试的CNC浓度均未对BMMC的活力产生任何不利影响。CNC琼脂糖底物在CNC浓度大于或等于2.5%时增加了肥大细胞生物标志物的表达，然而，这些受体的表达水平在2.5%至12.5%CNC之间保持相对一致，这表明其效果与CNC浓度无关。XTT测定表明，在所有测试的时间点，在3D生物打印水凝胶支架上培养的BMMC的代谢活性在约100%时保持相对一致。

同样，LDH释放和PI染料排除测定显示BMMC的生存能力没有显着变化。仔细注意打印喷嘴量规的选择，3D生物打印机轴的校准以及挤出压力设置将确保高质量3D构建体的可重复打印。肥大细胞的检索很容易，这使得它们可以通过广泛的生物测定进行探测，以进一步研究其细胞功能的任何方面。