Name: 用于骨髓源性肥大细胞培养的结晶纳米纤维素包埋琼脂糖生物材料墨水的制备 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: 了解用于评估水凝胶生物材料墨水生物相容性的快速筛选方法，使用小鼠骨髓源性肥大细胞进行细胞活力和生物标志物表达分析。该方案支持3D生物打印和组织工程应用中的材料选择。

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感谢阿尔伯塔创新基金会（Alberta Innovates）提供纤维素纳米晶体（CNC），并感谢Ken Harris和Jae-Young Cho在制备CNC/琼脂糖/D-甘露醇基质过程中提供的技术指导。我们还感谢Ben Hoffman、Heather Winchell和Nicole Diamantides在INKREDIBLE+ 3D生物打印机的安装与校准过程中提供的技术建议与支持。

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</ol>

本工作由加拿大国家研究委员会和阿尔伯塔创新基金会资助。

3D 生物仿生组织的制备需要将模拟细胞外基质成分的生物墨水与细胞组分成功结合，以构建生理性的类似结构 体内 组织。因此，在构建生理性的仿生组织时，必须使用原代细胞而非永生化细胞。然而，原代免疫细胞（如肥大细胞）特别容易受到生物墨水基质本身可能引发的细胞毒性效应和表型变化的影响，这是不希望出现的情况。因此，在进行包含多种嵌入生物墨水基质中细胞类型的复杂组织3D生物打印之前，能够快速评估候选生物材料墨水对肥大细胞活力和表型（表面受体表达）的影响具有显著优势，尤其是在该过程成本高且耗时的情况下。
本实验方案的关键在于将骨髓来源的肥大细胞（BMMC）——一种原代肥大细胞——培养在预先制备的候选水凝胶生物墨水基质表面（含1–12.5%纳米纤维素晶体的琼脂糖），从而便于后续高效回收BMMC，并通过流式细胞术分析细胞活力及细胞表面受体的表达。从小鼠股骨和胫骨中分离骨髓时，由于这些骨骼较为脆弱且体积较小，操作过程需要精确并注重细节。成功分离骨髓并将其接种至细胞培养基后，必须持续使用30 ng/mL小鼠重组IL-3培养4周，以持续刺激造血祖细胞分化为同时表达Kit（CD117）和F...

近年来，人们对三维培养系统和三维生物打印的兴趣日益增长，这使得水凝胶及水凝胶复合材料受到广泛关注。这些复合材料具有黏性且多孔的仿生特性，按重量计可含有高达99%的水分，与生物组织的含水量相当。1,2,3这些水凝胶复合材料的特性因而能够在不影响细胞活力和功能的前提下促进细胞生长。其中一种复合材料是结晶纳米纤维素（CNC），已被用作水凝胶复合材料中的增强材料、生物材料植入物开发中的细胞支架，以及二维（2D）和三维（3D）结构中的组分 体外 细胞培养4,5由CNC组成的基质对人角膜上皮细胞大多不表现出明显的细胞毒性6肠上皮细胞7人骨髓来源的间充质干细胞8或类神经元细胞9然而，人类骨髓来源的间充质干细胞的代谢活性和增殖能力随着木质纳米纤维素复合材料黏度的增加而降低，表明必须仔细测试基质成分对细胞功能的不利影响。8.
类似地，CNC 在被巨噬细胞内化后可诱导炎症反应，这在三维免疫细胞培养系统中可能产生严重后果10,11事实上，目前关于CNC如何影响其他免疫细胞反应的数据非常有限，尤其是由肥大细胞启动的过敏性炎症反应。肥大细胞是一类表达高亲和力IgE受体FceRI的颗粒性白细胞，该受体负责介导针对过敏原的炎症反应激活。肥大细胞的增殖与分化依赖于干细胞因子（SCF），后者可结合酪氨酸激酶受体Kit。肥大细胞起源于骨髓中的前体细胞，这些前体细胞进入血液循环后，进一步向外周迁移，广泛分布于人体所有组织中12由于肥大细胞在三维组织环境中发挥作用，因此它们是研究免疫学过程的理想免疫细胞候选者 体外 三维组织模型。然而，迄今为止，尚无可行的 体外 含有肥大细胞的三维组织模型
由于肥大细胞具有高度敏感性，并且容易对外部刺激产生促炎反应，因此在将肥大细胞引入三维支架时，必须仔细考虑三维基质的组成成分以及生物打印方法，下文将进一步讨论。组织构建物可由两大类生物材料制备而成，即生物墨水和生物材料墨水。两者的区别在于：根据 Groll 等人13,14的定义，生物墨水是含有细胞的水凝胶复合物，而生物材料墨水则是不含细胞的水凝胶复合物。因此，使用生物墨水打印的三维构建物包含预先包埋于水凝胶基质中的细胞，而使用生物材料墨水打印的三维构建物则需在打印后接种细胞。基于水凝胶的生物墨水/生物材料墨水进行培养支架的生物制造，最常采用挤出式三维生物打印机实现，该设备通过气动或机械驱动的活塞施加压力，将生物墨水/生物材料墨水经微尺度喷嘴挤出14。挤出式生物打印机采用“自下而上”的方式，通过逐层堆叠二维截面图案来沉积生物墨水，从而构建三维支架。
为了适用于挤出式生物打印，基于水凝胶的生物墨水/生物材料墨水必须具备触变性（剪切稀化）特性，即当生物墨水/生物材料墨水中的水凝胶聚合物在受到剪切应力作用时，能够像流体一样通过微通道喷嘴流动，而在剪切应力移除后迅速恢复为黏稠的凝胶状状态15。由于水凝胶基生物墨水/生物材料墨水含水量高，其聚合物必须通过物理或共价交联方式形成网络结构，以维持三维生物打印结构的形态和结构完整性。对于含细胞的生物墨水，细胞在交联过程中会直接暴露于化学应力之下。此外，在将细胞包埋于生物墨水水凝胶基质中进行挤出打印的过程中，细胞还会受到剪切应力的影响，可能导致细胞活力下降甚至死亡。一旦完成三维组织模型的生物打印，便难以区分细胞毒性究竟来源于水凝胶基质本身，还是源于挤出过程或交联过程。这一问题在三维支架体系中尤为突出，因为细胞在打印前已预先嵌入水凝胶基质中，难以将其完整分离用于后续分析，而此类操作可能严重损害肥大细胞的存活能力。
一种更温和的生成含肥大细胞三维组织构建物的方法，是将细胞从细胞培养悬浮液中接种至预先打印的多孔生物材料墨水三维支架中，该方法利用了肥大细胞从循环系统迁移至外周组织的天然能力。这种细胞接种方法具有双重优势：（i）肥大细胞不会受到挤出和交联过程分别带来的剪切力和化学应力；（ii）在暴露处理后，可通过轻柔冲洗将细胞从三维支架中轻松回收用于分析，且不会对细胞活力产生不利影响。相较于二维水凝胶圆片，在三维生物打印的多孔水凝胶支架上接种肥大细胞并分析其细胞活力的额外优势在于，此类三维生物打印水凝胶支架能够模拟天然组织的微尺度拓扑结构特征 体内 组织，而这些结构在传统的二维平面水凝胶圆片中并不存在。该方法是一种合适、快速且经济有效的手段，可在投入昂贵的三维组织工程实验之前，评估候选生物墨水水凝胶基质对肥大细胞及其他免疫细胞可能产生的灾难性细胞毒性效应。

<table><tbody><tr><td>&lt;强&gt;A&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>冰醋酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>AX0074-6</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖（OmniPur）</td><td>EMD Millipore 公司</td><td>2125-500GM</td><td></td></tr><tr><td>中国台湾仓鼠IgG同型对照，APC（克隆：eBio299Arm）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>17-4888-82</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;B&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>β-巯基乙醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>O3446I-100</td><td></td></tr><tr><td>β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸钠盐（NAD）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N0632-5G</td><td></td></tr><tr><td>BD 5 mL 注射器（鲁尔锁扣接头）</td><td>BD</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>BD PrecisionGlide 针头 26G × 1/2 英寸</td><td>BD</td><td>305111</td><td></td></tr><tr><td>BioLite 24 孔多孔培养皿</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>930-186</td><td></td></tr><tr><td>BioLite 96 孔多孔培养皿</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>130-188</td><td></td></tr><tr><td>BioLite 175 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; 通风瓶塞</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>130-191</td><td></td></tr><tr><td>II级生物安全柜</td><td>Microzone Corp.，加拿大</td><td>BK-2-6-B3</td><td></td></tr><tr><td>BSA，第五组分（OmniPur）</td><td>EMD Millipore 公司</td><td>2930-100GM</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;C&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6小鼠</td><td>杰克逊实验室</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>CD117（c-Kit）单克隆抗体，PE（克隆号：2B8）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>12-1171-82</td><td></td></tr><tr><td>CELLINK 生物墨水（3 x 3 mL 筒装）</td><td>CELLINK LLC</td><td>IK1020000303</td><td></td></tr><tr><td>CELLINK CaCl₂ 交联剂 - 无菌瓶装 1 x 60 mL</td><td>CELLINK LLC</td><td>CL1010006001</td><td></td></tr><tr><td>CELLINK 3 cc 空 cartridges，带末端和尖端帽</td><td>CELLINK LLC</td><td>CSC0103000102</td><td></td></tr><tr><td>CELLINK HeartWare 用于 PC</td><td>CELLINK LLC</td><td>2.4.1 版本</td><td></td></tr><tr><td>CELLINK INKREDIBLE+ 3D 生物打印机</td><td>CELLINK LLC</td><td>S-10003-001</td><td></td></tr><tr><td>CELLINK 无菌标准锥形生物打印喷嘴 22G</td><td>CELLINK LLC</td><td>NZ4220005001</td><td></td></tr><tr><td>CELLINK 无菌标准锥形生物打印喷嘴 25G</td><td>CELLINK LLC</td><td>NZ4250005001</td><td></td></tr><tr><td>CELLINK 无菌标准锥形生物打印喷嘴 27G</td><td>CELLINK LLC</td><td>NZ4270005001</td><td></td></tr><tr><td>细胞增殖检测试剂盒II（XTT）（Roche）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11465015001</td><td></td></tr><tr><td>离心机（台式）</td><td>Eppendorf</td><td>5804R</td><td></td></tr><tr><td>康宁科斯特&amp;nbsp;96孔透明平底未处理PS微孔板</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS3370</td><td></td></tr><tr><td>CO2 培养箱</td><td>Binder GmbH，德国</td><td>9040-0113</td><td></td></tr><tr><td>CytoFLEX 流式细胞仪</td><td>贝克曼库尔特</td><td>A00-1-1102</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;D&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-甘露醇（MilliporeSigma Calbiochem）</td><td>Fisher Scientific</td><td>44-390-7100GM</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;F&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Falcon 15 mL 聚苯乙烯圆锥形管，无菌</td><td>Corning</td><td>352095</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 mL 聚苯乙烯圆锥形管，无菌</td><td>康宁</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>FceR1α 单克隆抗体，APC标记（克隆：MAR-1）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>17-5898-82</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS），经鉴定，热灭活</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>12484028</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo 软件</td><td>Becton Dickinson &amp;amp; Co. USA</td><td>版本 10.6.2</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;G&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>GraphPad Software, LLC</td><td>版本 8.4.3</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;H&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板（改进型Neubauer，0.1 mm深度Levy型）</td><td>VWR</td><td>15170-208</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 钠盐</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP410-500</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;我&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>碘硝基四唑氯化物（INT）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I10406-5G</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;L&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺 200 mM（Gibco）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>L-乳酸锂</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L2250-100G</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;M&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MEM非必需氨基酸 100 mL 100倍浓度（Gibco）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>1-甲氧基-5-甲基吩嗪甲基硫酸盐（MPMS）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8640</td><td></td></tr><tr><td>微型离心管（1.7 mL，透明）</td><td>Axygen</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>微型离心管（2.0 mL，透明）</td><td>Axygen</td><td>MCT-200-C</td><td></td></tr><tr><td>MilliQ Academic（用于制备MilliQ超纯水）</td><td>默克密理博</td><td>ZMQS60001</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;N&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Rapid-Flow 90 mm 滤器单元（0.2 mm 孔径，500 mL）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>566-0020</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene 注射器滤器（0.2 mm PES，25 mm）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>725-2520</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;P&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液 100 mL（Gibco）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7.4，无钙/镁，500 mL（Gibco）&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>碘化丙啶，1.0 mg/mL（Invitrogen）&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>P3566</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;R&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>大鼠IgG2b κ同型对照，PE（克隆：eB149/10H5）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>12-4031-82</td><td></td></tr><tr><td>重组小鼠IL-3</td><td>PeproTech, Inc.&amp;nbsp;</td><td>213-13</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 培养基 1× + 2.05 mM L-谷氨酰胺（HyClone）</td><td>GE Healthcare</td><td>SH30027.01</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;S&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sarstedt 96孔圆底聚苯乙烯透明微量检测板（82.1582.001）</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9913213</td><td></td></tr><tr><td>叠氮化钠，500 g</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP922I-500</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠（100 mM）100倍溶液（Gibco）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;T&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris碱（2-氨基-2-(羟甲基)-1,3-丙二醇）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>252859</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝溶液（0.4%，用于显微镜检查）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>93595</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;V&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>VARIOSKAN LUX 微孔板分光光度计（型号：3020）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>VLBL00D0</td><td></td></tr></tbody></table>

用于骨髓来源肥大细胞培养的结晶纳米纤维素嵌入琼脂糖生物材料油墨的制备

Fabrication of a Crystalline Nanocellulose Embedded Agarose Biomaterial Ink for Bone Marrow-Derived Mast Cell Culture

三维（3D）生物打印技术利用基于水凝胶的复合材料（或称生物材料墨水），按特定图案沉积，形成可接种细胞的基质。由于许多生物材料墨水可能对原代细胞具有潜在的细胞毒性，因此在将其用于成本较高的3D组织工程过程之前，有必要确定这些水凝胶复合材料的生物相容性。一些3D培养方法（包括生物打印）要求将细胞包埋于3D基质中，这使得在不造成机械损伤的情况下难以提取和分析细胞的存活率及生物标志物表达变化。本方案以概念验证为目的，描述了一种方法，用于评估嵌入结晶纳米纤维素（CNC）的琼脂糖复合材料的生物相容性；该复合材料被制备成24孔培养系统，并利用流式细胞术检测小鼠骨髓来源肥大细胞（BMMCs）的细胞活力和生物标志物表达水平。
暴露于CNC/琼脂糖/D-甘露醇基质18小时后，通过碘化丙啶（PI）通透性测定，BMMC的活力未发生改变。然而，培养在CNC/琼脂糖/D-甘露醇基底上的BMMC似乎略微上调了高亲和力IgE受体（FcεRI）和干细胞因子受体（Kit；CD117）的表达，尽管这种变化似乎不依赖于生物墨水复合物中CNC的含量。BMMC的活力还通过时间过程实验进行了评估，即将其暴露于由纤维状纳米纤维素（FNC）和海藻酸钠组成的商用生物材料墨水经3D挤出式生物打印机制造的水凝胶支架中。在6至48小时的时间范围内，通过流式细胞术以及微量滴定法（XTT和乳酸脱氢酶检测）测定，FNC/海藻酸钠基底未对BMMC的活力产生不利影响。本方案描述了一种高效的方法，可用于快速筛选候选生物材料墨水在作为肥大细胞接种用3D支架时的生化相容性。

一种成功的生物材料油墨或培养基质最关键的特性之一是生物相容性。首要的是，该基质不得诱导细胞死亡。目前有多种基于微孔板和流式细胞术的方法可用于定量细胞活力与坏死情况；然而，这些方法不适用于分析嵌入水凝胶基质中的细胞。在本实验方案中，通过将骨髓来源的间充质细胞（BMMCs）接种于水凝胶基质或生物打印支架上，从而规避了上述限制。经过特定的孵育时间（本研究中为6–48小时）后，可通过微量移液器轻松收获BMMCs，无需对水凝胶基质或生物打印支架进行机械破坏或水解处理，避免对细胞造成物理损伤。随后，利用碘化丙啶（PI）通透性方法结合流式细胞术快速分析BMMCs的存活率。PI是一种膜不通透性染料，无法进入细胞膜完整的活细胞，仅在插入DNA碱基对之间时产生荧光16。
因此，只有细胞膜受损的细胞才对PI具有通透性，因而会产生荧光。PI通透性分析表明，当BMMC在CNC/琼脂糖/D-甘露醇基质上培养时，其活力未发生改变。事实上，与未在CNC/琼脂糖/D-甘露醇水凝胶基质中培养的BMMC相比，所测试的所有CNC浓度（最高达12.5% w/v）均未对BMMC...

本方案重点介绍了一种快速评估结晶纳米纤维素（CNC）/琼脂糖复合水凝胶生物材料油墨与小鼠骨髓来源肥大细胞生物相容性的方法，主要考察细胞活力以及细胞表面受体Kit（CD117）和高亲和力IgE受体（FcεRI）的表型表达。

三维（3D）生物打印利用基于水凝胶的复合材料（或称生物材料墨水），按照特定图案进行沉积，形成一种基质，用于……

本方案提供了一种简便快速的方法，可在进行复杂的3D生物打印实验之前，针对敏感的原代细胞和免疫细胞，筛选候选生物材料墨水潜在的细胞毒性效应。将免疫细胞在生物材料墨水构建物上孵育后，可通过轻柔洗涤轻松回收细胞，以进行后续的细胞毒性或生物标志物分析。本方案与组织工程直接相关，因为用于移植的生物打印组织必须由原代细胞和生物相容性生物材料墨水构建而成。首先，准备一个生物墨水 cartridge，用于安装到 INKREDIBLE+3D 生物打印机上。取出三毫升生物材料墨水 cartridge 两端的蓝色封帽，并在生物墨水 cartridge 的鲁尔锁（Luer lock）端安装一个无菌的 22 号锥形生物打印喷嘴。将打印头一（PH1）的气压供气管连接到 cartridge 的另一端，然后将带有已安装锥形生物打印喷嘴的 cartridge 插入 PH1 的垂直插槽中。接下来，将墨盒牢固地安装到 PH1 中，并使锥形生物打印喷嘴延伸至打印头下方。顺时针拧紧 PH1 上的螺丝，直至手指拧不动为止，以固定生物墨盒。请注意，3D 生物打印可在 PH2 保持空置的情况下进行。打开生物打印机电源，并在通过 USB 2.0 电缆连接至 3D 生物打印机的计算机上启动生物打印机软件。在软件中，单击连接按钮以与 3D 生物打印机同步。观察 3D 生物打印机主控制菜单中的三个选项。首先，准备生物打印。其次，工具菜单。第三，状态界面。选择“准备生物打印”选项，然后向下滚动并选择“归位坐标轴”选项。在成功校准 XYZ 轴后，打印床的高度将略微下降，打印头将移动至打印床中心点的上方。为了继续进行24孔板生物打印的起始点校准，请从密封的塑料包装中取出一个无菌的24孔细胞培养板，并用永久性记号笔在板底部 D1 孔的中心位置标记一个点。取下培养板盖，将24孔培养板放置在打印平台上，使D1孔位于打印平台的左前角。在主控制菜单中，选择“工具”菜单，然后选择“移动轴”。沿X轴和Y轴以1毫米为步长移动打印头，直到PH1的锥形生物打印喷嘴正对D1孔下方标记的圆点。如有必要，可将打印头以0.1毫米为步长进行微调，使锥形生物打印喷嘴精确对准圆点。当锥形生物打印喷嘴正对D1孔中心时，记录3D生物打印机控制面板屏幕上显示的X和Y坐标，并记下该坐标值。接着，以1毫米为增量逐步升高打印平台，直至D1孔底部接近安装在一号打印头上的锥形生物打印喷嘴。如有必要，可进一步以0.1毫米为增量微调打印平台的位置。从工具菜单中选择 Z 轴校准选项，然后进一步选择并确认存储 Z 校准选项。返回主菜单并选择准备生物打印选项。向下滚动并选择 Z 轴校准选项。使用正确的起始点坐标更新24孔板的几何代码（G代码）。在生物打印软件中打开提供的24孔G代码文件。将第一行中的X和Y坐标更新为前几步获得的数值，并将文件另存为新名称。确保气动泵已牢固连接至 INKREDIBLE+3D 生物打印机后部的进气口，并打开电源。拉出位于 INKREDIBLE+3D 生物打印机右侧的前进控制旋钮。确保位于生物打印机前方的 PH1 和 PH2 数字压力计读数均接近零千帕。顺时针缓慢旋转前进控制旋钮，直至 PH1 左侧压力表显示的压力达到 12 千帕。在已安装墨盒的打印喷嘴下方放置一张折叠的纸巾或一片防水密封膜，注意不要触碰打印喷嘴。在 3D 生物打印机的主控制菜单中，选择准备生物打印。导航并选择开启 PH1。注意观察生物墨水开始从打印喷嘴挤出。如有必要，顺时针旋转控制旋钮以增加挤出压力，直至生物墨水以连续丝状形式挤出，并记录新的压力设定值。选择关闭 PH1 以停止生物墨水的挤出。从打印平台取下带有挤出生物墨水的纸巾或薄膜，并关闭生物打印机门。若要在 24 孔板中进行直角线性水凝胶基底的 3D 生物打印，请从主控制菜单中选择“工具”菜单，然后选择“禁用 SD 打印”，这将允许生物打印机软件向 3D 生物打印机传输 G 代码文件以进行打印。单击生物打印机软件中的加载按钮，选择更新后的24孔板G代码文件。在软件右侧的控制面板中，选择打印预览选项卡，然后单击打印按钮，开始在D1孔中进行生物打印。完成直角结构的生物打印后，盖上24孔板的盖子，并将其转移至II级生物安全柜中。将每个直角结构浸入两滴无菌的50毫摩尔氯化钙溶液中，在室温下孵育五分钟。小心吸出每个孔中构建物的氯化钙溶液，并用一毫升 1X PBS 冲洗一次，以去除多余的氯化钙。为防止生物打印的水凝胶构建物脱水，在骨髓来源的肥大细胞准备接种到构建物上之前，需将 3D 生物打印的直线型构建物保存在新鲜的 1X PBS 中。根据流式细胞术分析 BMMCs 的前向散射和侧向散射参数结果，观察到与未培养在 CNC 琼脂糖 D-甘露醇水凝胶基质中的 BMMCs 相比，含有最高 CNC 浓度的水凝胶基质并未改变 BMMCs 固有的细胞大小或颗粒度。通过流式细胞术分析BMMCs对碘化丙啶的通透性表明，所测试的任何CNC浓度均未对BMMCs的活力产生不良影响。当CNC浓度大于或等于2.5%时，CNC琼脂糖基质可上调肥大细胞生物标志物的表达。然而，这些受体的表达水平在2.5%至12.5%的CNC浓度范围内保持相对一致，提示该效应与CNC浓度无关。XTT检测显示，在三维生物打印水凝胶支架上培养的BMMCs，其代谢活性在所有测试时间点均保持在约100%的相对稳定水平。类似地，LDH 释放实验和 PI 染料排斥实验均显示 BMMC 的活力未发生显著变化。仔细选择打印喷嘴规格、校准 3D 生物打印机的轴系以及设定挤出压力，将确保高质量 3D 结构的可重复打印。肥大细胞易于回收的特性使其可适用于多种生物学检测方法，从而进一步研究其细胞功能的各个方面。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

用于骨髓源性肥大细胞培养的结晶纳米纤维素包埋琼脂糖生物材料墨水的制备

来源： Arias, S. L., et al．利用氧化铁纳米颗粒制备功能化磁性细菌纳米纤维素． J. Vis. Exp.

由产纤维素细菌制备细菌纳米纤维素膜

在此，我们介绍一种用于受损血管重建应用的细菌纤维素（BNC）磁性化制备方案。该BNC由 G. xylinus 菌株。另一方面，BNC 的磁化是通过 原位 Fe沉淀2+ 和 Fe3+ BNC 网格内部的亚铁离子。...

利用氧化铁纳米颗粒制备功能化磁性细菌纤维素

使用基于纳米纤维素-海藻酸盐的生物墨水对软骨和皮肤类似物进行生物打印。打印前通过单步被动混合装置对生物墨水进行细胞接种。结果显示，所构建的组织结构细胞分布均匀，细胞活力高，并表现出良好的分化标志物。...

利用新型被动混合单元技术实现生物墨水预细胞化的软骨与皮肤组织类似物生物打印

本方案描述了一种利用定制的3D打印塑料模具制备不同尺寸自组装组织环的平台。将PDMS倒入3D打印模具中固化形成阴模，然后将琼脂糖注入固化的PDMS阴模中成型。将细胞接种至所得的琼脂糖孔中，细胞在其中聚集形成组织环。...

使用3D打印模具制备定制琼脂糖孔用于细胞接种和组织环自组装

本方案的三个关键步骤是：i）开发出具有合适组分和一致性的纤维素水凝胶油墨，ii）将支架3D打印成具有优良形状保真度和尺寸精度的不同孔隙结构，iii）在模拟体内条件下验证其用于软骨再生的力学性能。...

3D打印多孔纤维素纳米复合水凝胶支架

本文介绍了一种明胶甲基丙烯酰胺的3D生物打印方法。...

基于明胶甲基丙烯酰胺水凝胶生物墨水的3D生物打印方案

本文报道了一种3D生物打印小鼠皮层星形胶质细胞的方法，用于构建类神经组织，以研究星形胶质细胞在中枢神经系统中的功能，以及胶质细胞在神经系统疾病及其治疗机制中的作用。...

利用小鼠皮层星形胶质细胞进行类神经组织工程的3D生物打印

本方案描述了一种3D打印技术，通过在明胶基颗粒支撑材料中沉积磷酸钙墨水来制备类似骨组织的结构。所打印的骨类似物可实现自由成形，并具有灵活性，既可直接取出打印产物，也可在含活细胞的基质中进行交联，以构建多相复合结构。...

在含细胞悬浮液中进行陶瓷全向生物打印以生成骨类似物

水凝胶形成过程中的剪切处理可产生微凝胶悬浮液，该悬浮液具有剪切变稀特性，但在去除剪切力后能迅速重构。此类材料已被用作生物打印复杂、含细胞结构的支撑基质。本文描述了用于制备支撑床及相容性生物墨水的方法。...

通过凝胶化过程中剪切处理形成琼脂糖流体凝胶用于悬浮3D生物打印

本研究描述了一种在自愈性可退火颗粒-细胞外基质复合材料内进行神经干细胞自由成型嵌入式3D打印的实验方案。该方案能够高保真地程序化构建相互连接的人类神经组织结构。...

微凝胶-细胞外基质复合支撑材料用于人源神经组织嵌入式三维打印

了解用于评估水凝胶生物材料墨水生物相容性的快速筛选方法，使用小鼠骨髓源性肥大细胞进行细胞活力和生物标志物表达分析。该方案支持3D生物打印和组织工程应用中的材料选择。

用于骨髓来源肥大细胞培养的结晶纳米纤维素嵌入琼脂糖生物材料油墨的制备

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