Name: 使用单分子定位显微镜绘制细胞核中绝对 DNA 密度 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-11-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: 了解如何使用单分子定位显微镜结合Voronoi镶嵌技术，在贴壁细胞核中测量绝对DNA密度。该方法以碱基对每平方微米为单位量化染色质空间结构，为研究基因组组织与表观遗传修饰的关系提供精确工具。

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我们感谢 Sandra Ritz 博士允许我们使用 IMB 成像核心设施，感谢 Shih-Ya Chen 博士允许我们使用她自行搭建的单分子定位显微镜，感谢 Leonard Kubben 博士（IMB）提供人成纤维细胞，感谢 Christof Niehrs 博士（IMB）提供 C3H10T1/2 细胞系，以及感谢 Jan Neumann 博士提供的 MATLAB 脚本，我们已针对本研究对其进行了修改。我们还要感谢 Marion Cremer 博士、Thomas Cremer 博士和 Christoph Cremer 博士富有成效的讨论。

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作者声明无利益冲突。

本文概述了如何利用单分子定位显微镜（SMLM）测量哺乳动物细胞核中的绝对DNA密度。此外，我们还展示了如何确定培养细胞的细胞周期阶段，并利用该信息估算光學超薄切片中所含DNA的量。文中还详细描述了贴壁细胞用于fBALM SMLM显微成像的制备方法，以及如何处理SMLM数据以生成细胞核内基因组DNA的超分辨率显微图像。最后，该实验方案展示了如何将SMLM数据的Voronoi图分割与成像光學切片的DNA含量估算相结合，以计算细胞核内的绝对DNA密度。
定位显微镜技术近年来作为一种研究细胞核结构的有力工具而日益受到关注，最近已被用于探讨一些重要的科学问题，例如黏连蛋白（cohesin）和BRD2对基因组可及性及其聚集倾向的影响29，以及组蛋白乙酰化在软骨迁移细胞基因组可塑性中的作用30。fBALM是一种依赖于荧光染料可逆插入DNA的成像方法，其效果高度依赖于缓冲液的pH值。因此，本实验所用成像缓冲液包含葡萄糖（作为底物）以及两种酶：葡萄糖氧化酶（可将β-D-葡萄糖和氧气代谢为D-葡萄糖酸-1,...

自细胞生物学发展初期以来，作为遗传信息中心的细胞核一直令生物学家着迷。1928年，Emil Heitz 在应用了自行开发的细胞学染色方法后，发现细胞核内存在染色程度不同的、着色较深的区域1。他将染色更深、更致密的区域称为&#34;异染色质&#34;，而将染色较浅、密度较低的区域命名为&#34;常染色质&#34;。随着时间推移，人们逐渐认识到，活跃的基因主要位于常染色质中，而更致密的区域则富含重复序列元件和沉默基因。尽管“异染色质”和“常染色质”这两个术语沿用至今，但其定义已从结构特征转变为分子特性（见下文）。如今我们了解到，细胞核可分为两个主要相态：一种是液态的染色质间区室，包含核体、剪接区室以及核质；另一种是固态、类水凝胶性质的染色质区室，包括染色体领地和核仁2。在与染色质间区室交界处，染色质密度较低，此处主要发生基因活性相关的过程，如转录、复制和修复3,4,5；而在核纤层附近、核仁周围以及着丝粒邻近区域，染色质高度压缩，通常转录活性较低6。
在分子水平上，染色质由DNA缠绕在核小体（组蛋白核心蛋白的八聚体）上构成。组蛋白具有内在无序的尾部结构域，可通过翻译后修饰添加多种化学基团（甲基、乙酰基、磷酸基、生物素）、氨基酸（精氨酸）甚至蛋白质（SUMO、泛素）进行修饰。7这些修饰可以被识别并招募其他蛋白质（例如，染色质重塑复合物、HP1、修复蛋白、RNA），从而在不直接改变DNA序列的情况下决定其生理状态（转录许可性/限制性）。&#160;（因此“epi”&#34;遗传的7特定序列周围的修饰类型和数量在不同细胞类型之间可能存在显著差异，&#160;可逆的，并可在发育、衰老和疾病过程中发生改变8,9,10组蛋白尾部存在某些修饰在转录活跃区域更为常见，而另一些修饰则主要富集于基因组中转录活性较低或无转录活性的区域。
例如，富含&#160;H3K4修饰或组蛋白尾部发生乙酰化的高转录区域通常被称为常染色质，而富含抑制性组蛋白修饰（如H3K9me3、H3K27me3或H4K20me3）的区域则被称为异染色质，后者可进一步分为组成型异染色质（在所有细胞中均无转录活性，例如H4K20me3）和兼性异染色质（根据细胞类型不同而沉默的染色质，例如H3K27me3）6。尽管生物化学和分子生物学方法非常适合在序列水平上检测化学变化，但利用这些方法对介观尺度上的空间特性进行分析则具有较大挑战性。
例如，已有研究尝试利用 Hi-C 实验的邻近信息来重建基因组的空间模型，Hi-C 实验可检测并绘制序列区域之间 DNA 的近距离关系11。然而，与高分辨率的光学显微镜和电子显微镜图像直接比较表明，这种方法仅在有限程度上可行（图1）。尽管 Hi-C12 等方法能够正确地将分裂间期细胞中的染色体区域识别为独立的结构，但这些模型较为&#34;近视&#34;，因为仅依赖 DNA 序列的邻近性无法反映基因组中相距较远区域之间的空间关系，因此并不十分适用于精确的三维基因组重建。因此，接触频率信息也无法准确反映密度差异。这导致了细胞核内基因组呈现出&#34;意大利面条化&#34;的结构（见图1B），看起来像是一个由可自由接触的环状结构组成的毛线球状团块。
为了建立一个整合性的、更接近真实的细胞核图像，将生化信息与生物物理和结构数据相结合，需要开发能够获取有关细胞核组织不同方面数据的方法。直到最近，从成像&#160;数据中确定细胞核内绝对DNA密度仍然&#160;十分困难。造成这一困难的原因包括传统光学显微镜的分辨率有限、电子显微镜中特异性染色DNA存在的问题，以及电子显微镜观察体积较小。
传统荧光显微镜的分辨率受到光衍射的限制。由于衍射极限的存在，点光源的图像会发生扩散，这一现象可用点扩散函数（PSF）来描述。根据点扩散函数，一个荧光分子的图像——在良好近似下可视为点光源——会占据其原始位置（荧光分子）周围一定大小的空间体积13。当多个荧光分子之间的距离远小于其衍射极限下图像的尺寸并被同时激发时，它们的成像强度分布会相互叠加，导致单个荧光分子的位置无法被分辨。通过荧光分子依次随机发光（闪烁），可实现单个分子的光学分离，从而通过确定其信号的强度重心来精确定位各个分子的位置。
通过累积大量记录图像中的荧光分子定位数据，可用于重建样品的结构信息。该方法通常被称为单分子定位显微镜技术（SMLM）（更多详细信息参见14）。荧光分子在其“开启时间”内发射的光子越多，其光强重心的定位就越精确。光路中的散光透镜可将位于光学焦平面之上或之下的荧光分子信号转化为椭圆形，从而用于确定其沿光轴方向的位置。来自焦平面下方荧光信号所产生的椭圆其长轴方向与焦平面上方荧光分子产生的椭圆长轴方向相差90°。此外，这些椭圆的轴长比可用于确定分子相对于焦平面沿光轴方向的位置，定位范围可达±300 nm15。
通过随机闪烁事件重建生成的超分辨率图像质量在很大程度上取决于标记密度以及闪烁事件的数量。后者又依赖于荧光染料的光稳定性及其在最终失活前发生的闪烁次数（即“开/关”循环次数）。本文所述用于获取细胞核内DNA分布超分辨率图像的方法称为fBALM（DNA结构波动辅助结合激活定位显微镜）。该方法基于能够瞬时插入核酸内部的荧光染料，这些染料仅在结合DNA后才产生荧光信号16,17。由于DNA的磷酸二酯骨架带有负电荷，因此DNA是一种高度带负电的聚合物。在活细胞中，互补DNA链的稳定需要通过带正电荷的蛋白质（例如组蛋白）和离子来中和电荷。通过降低pH值，可减弱碱基互补配对的稳定性，从而使插入型染料能够自由地进出DNA双螺旋结构16,17。
根据所使用的嵌入型荧光染料，该状态可在特定pH范围内达到。诸如YoYo-1和SYTOX Orange等荧光染料仅在与DNA结合时才会发出荧光，而由于嵌入型染料（与结合DNA小沟的染料如Hoechst和4',6-二脒基-2-苯基吲哚[DAPI]不同）通常以序列非特异性方式结合，因此非常适合通过定位显微镜来绘制细胞核内DNA分布图。
Voronoi 镶嵌是一种基于点位置将空间划分为不同区域的数学方法。在二维空间中，所生成图形单元的大小反映了点密度的倒数18由于定位显微镜将图像重构为一组代表荧光分子位置的点，因此 Voronoi 镶嵌可用于帮助确定&#160;定位信号的密度（图2因此，使用DNA特异性染料作为荧光染料可实现对DNA密度的测定。
先验的 了解DNA含量（碱基对数量）和细胞核空间尺寸，可将相对DNA密度转换为绝对DNA密度。以下方案展示了利用超分辨率单分子定位显微镜（SMLM）在贴壁细胞中以极高分辨率绘制绝对DNA密度图的方法，并表明这些密度存在显著变异。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;细胞培养&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;micro;-Dish 35 mm, high Grid-500 玻璃底培养皿</td><td>Ibidi</td><td>81168</td><td></td></tr><tr><td>C3H 10T1/2</td><td>IMB (Niehrs 实验室)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>12320032</td><td></td></tr><tr><td>dPBS</td><td>ThermoFisher</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>HeLa</td><td>显微成像核心设施 (IMB)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HFB</td><td>IMB (Kubben 实验室)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>用于 HFB 的非必需氨基酸和维生素</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>S8636</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;样品制备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>过氧化氢酶</td><td>Merck</td><td>2593710</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>ThermoFisher</td><td>241922500</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖氧化酶</td><td>Merck</td><td>49180</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>RNase 混合酶</td><td>ThermoFisher</td><td>AM2286</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Orange</td><td>ThermoFisher</td><td>S11368</td><td></td></tr><tr><td>TetraSpeck 荧光微球样品试剂盒</td><td>ThermoFisher</td><td>T7284</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>ThermoFisher</td><td>327372500</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;软件&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioFormats</td><td>OpenMicroscopy.org</td><td></td><td>开源软件 https://www.openmicroscopy.org/bio-formats/</td></tr><tr><td>CellProfiler v4.2.1</td><td>CellProfiler.org</td><td></td><td>开源软件 https://cellprofiler.org</td></tr><tr><td>FiJI</td><td>nih.gov</td><td></td><td>开源软件 https://imagej.net/software/fiji/?Downloads</td></tr><tr><td>LAND</td><td>nih.gov</td><td></td><td>开源软件 https://github.com/Jan-NM/LAND</td></tr><tr><td>MatLab 2021</td><td>Math Works</td><td></td><td>商业软件 - 需要 &quot;图像处理工具箱&quot;</td></tr><tr><td>R v.4.0.3</td><td>r-project.org</td><td></td><td>开源软件 https://www.r-project.org</td></tr><tr><td>ThunderSTORM v1.3</td><td></td><td></td><td>开源软件 https://zitmen.github.io/thunderstorm/</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;显微镜：&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AF 7000</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica GSD</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SMLM 显微镜</td><td>Cremer 实验室</td><td></td><td>由陈思远博士定制搭建</td></tr></tbody></table>

使用单分子定位显微镜绘制细胞核中dna的绝对密度图

Mapping Absolute DNA Density in Cell Nuclei using Single-molecule Localization Microscopy

在细胞核内，沉默基因通常位于称为异染色质的高密度染色质区域，而活性基因则主要分布于染色质与染色质间间隙的交界区域，即常染色质。目前，对常染色质和异染色质的鉴定主要基于表观遗传修饰&#160;DNA序列上的组蛋白蛋白分布已有研究，但关于细胞核内绝对DNA密度及其功能意义的信息仍然有限。仅基于生化数据和染色质作为聚合物性质假设的细胞核模型，与高分辨率显微镜生成的成像数据存在根本性差异，这表明目前仍缺少重要的结构相关信息。我们认为空间限制可能参与基因调控，因此开发了一种方法，通过将超分辨率定位数据经由Voronoi镶嵌转换为真实比例的密度图，实现对哺乳动物细胞核内绝对DNA密度的测量。

所示的 HeLa 细胞核 图5 从第3节中由CellProfiler 4.2.1生成的表格中选择，其积分荧光强度接近直方图中第一个峰 图5 代表处于G期的细胞核1 期。由于其体积较小且内部结构明显，它很可能是早期G1 有丝分裂后染色质仍处于去凝集过程中的细胞核。处于G期1 意味着DNA含量为3N（约9 × 109 bp）可用于计算（参见 补充图 S1). 由 50,000 帧组成的 fBALM 测量结果为 2.68 × 106 在100 nm厚的光学中段检测到的定位图 5A）。重建图像的定位精度为10 nm。本节中的定位点代表了高度为2.8 µm的细胞核中约0.036倍的全基因组（约321 Mbp）。这使得用于计算Voronoi细胞绝对密度的MATLAB脚本的转换系数为265。
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本实验方案描述了一种利用单分子定位显微镜数据、已知体积、基因组大小和细胞周期阶段，通过沃罗诺伊图（Voronoi tessellation）测定贴壁细胞核内绝对DNA密度的方法。

使用单分子定位显微镜绘制细胞核中DNA的绝对密度图

在细胞核内，沉默基因通常位于称为异染色质的高密度染色质区域，而活跃基因则主要位于常染色质区域。

本方法可对细胞核内的DNA绝对密度进行测量，以研究染色质结构中的空间限制，而这些信息通常仅能通过翻译后组蛋白修饰来表征。结合SMLM的Voronoi图分割技术能够以每平方微米碱基对的数量来估算DNA的绝对密度。所需唯一的先验知识是所测细胞核的总DNA含量。在未来的实验中，研究绝对密度差异是否与其他方法提供的生物学信息相关将十分有意义，例如表观遗传修饰的免疫荧光或 Hi-C 数据。首先，通过拼接预先记录的单张图像来重建扫描区域。打开 CellProfiler，然后加载管道文件 cellcycleanalysis.cpproj。在流程的第一步中，拖放图像，包括参考图像。接下来，定义参考图像的存储位置。然后单击“启动测试模式”图标，接着单击“运行”。当显示待分析图像中细胞核的直方图后，确定 G1、S 和 G2 期的荧光强度区间，并确保这些区间已输入至后续的滤波对象步骤中，且这些步骤处于激活状态。然后再次点击“运行”按钮，以继续执行流程的后半部分。观察三幅分别代表不同细胞周期阶段（G1、S 或 G2）的叠加图像，选择处于 G1 或 G2 期的细胞核进行进一步成像，从而获知该图像中细胞核 DNA 的碱基对数量。将细胞转移至单分子定位显微镜下，并确保FPALM过程中的荧光蛋白正常闪烁。首先，仅使用每层500帧对选定的细胞核进行三维层扫成像。这一步有助于确定中段DNA的相对含量，后续将对该区域用更多帧数成像，以揭示其超微结构。使用50毫秒的曝光时间开始图像序列采集，获得约每秒20帧的帧率。以200纳米的步进间隔对细胞核进行Z轴层扫，每个光学切片仅采集500帧。完成Z轴层扫后，返回初始的Z轴位置，并以相同的50毫秒曝光时间采集主数据集，共50,000帧。在 ImageJ 中打开 FPALM 数据集。为了优化闪烁信号的检测设置，请点击 ThunderSTORM，然后运行分析。接着，选择相机设置。输入图像数据的正确像素尺寸、A/D 计数、所用相机的量子效率、基底水平和 EM 增益，然后点击确定。选择通过拟合闪烁信号来确定定位坐标的算法。在图像滤波部分，使用 B-Spline 小波滤波器，B-Spline 阶数为 3，B-Spline 尺度为 2。然后，将分子近似定位方法设置为局部最大值，将峰值强度阈值和连通性设置为 8-邻域。在分子亚像素定位部分，方法选择PSF积分高斯法，将拟合半径（px）设为3，拟合方法选择最大似然法，并将初始σ值设为1.6。然后点击“确定”以开始信号检测和图像重建。如果采集数据被划分为不同的图像堆栈，请在ThunderSTORM中拼接定位表。为此，请在弹出窗口中点击“导入”。确保已启用“追加到当前表格”选项，并使用正确的起始编号，以避免覆盖表格中的定位信息。然后选择文件路径，点击“确定”以逐个导入文件。为防止在连续帧之间重复计数信号，使用 20 纳米的最大距离、1 帧最大关闭帧数以及每分子 0 最大帧数来合并定位数据，然后点击“合并”。为通过交叉相关数据子部分来测量并校正漂移，请打开漂移校正菜单并点击箭头。添加 3 个区间，并将放大倍数设置为 5。然后点击“应用”，将出现显示 x 和 y 方向漂移的窗口。为了确定每个切片中与 DNA 含量成比例的信号量（该信号来自预先记录的三维图像堆栈，每个切片包含 500 帧），依次选择“插件”、“ThunderSTORM”，然后选择“导入/导出”，并导入该图像堆栈第一个切片的结果表格。为避免来自三维堆栈其他图像平面的信号被重复计数，需要去除切片之间 z 方向上超出 200 纳米步长间隔的信号。点击“绘制直方图”，在打开的“分布”对话框中选择 z，然后点击“确定”。确定峰值位置，并使用筛选字段选择光学校准步长为 200 纳米的信号。点击“可视化”，选择“直方图”选项，然后点击“确定”。将生成的图像以 TIFF 格式保存到文件夹中。打开所有切片，然后依次选择“图像”、“堆栈”和“图像合成为堆栈”将其合并。选择整个图像区域后，进入“分析”菜单，点击“工具”，然后选择“ROI 管理器”。点击“添加”，接着点击“分析”，选择“设置测量”，并勾选“积分密度”。随后，选择“更多”选项，点击“多重复测量”，并勾选“测量所有层面”以及“每层单独一行”。单击“确定”，结果将显示出来。所有切片强度的总和与整个细胞核的DNA含量成正比，正如各个切片的强度与其在全基因组中所占比例成正比一样。打开包含50,000帧信号的中心平面的结果表后，将其过滤至100纳米的厚度。创建所得信号的直方图（方法如前所述），并测量中心区域的积分密度。通过运行 MATLAB 脚本 TS2orte.m，将包含中心区域超微结构信息的大型 ThunderSTORM 定位表从 csv 格式转换为 ORTE 格式，该脚本会将定位表转换为 MATLAB 矩阵并以 mat 格式保存。进入 LAND-voronoi 文件夹，在 coreAlgorithm 子文件夹中打开文件 voronoicluster.m，并根据所使用的细胞类型和细胞周期阶段，调整用于绝对密度计算的 DNA 含量、整个细胞核中观察到的中心区域的 DNA 分数以及定位点数量，以及转换因子。编辑启动分析的脚本 voronoi.m。调整文件路径以指向 orte 定位数据以及结果文件的输出文件夹。指定定义镶嵌区域的坐标。可在同一输入数据集中定义多个区域进行计算。运行脚本后，在输出文件夹中查找显示绝对DNA密度的图像，以及其他包含面积分布直方图的图表文件，以及一个包含每个计算出的Voronoi单元密度的densities.m文件。由50,000帧组成的FPALM测量在100纳米厚的中段截面内检测到2.68×10⁶个定位点。重建图像的定位精度为10纳米。大量的定位点使得在显示绝对DNA密度的同时实现超分辨率成像成为可能。显然，测得的DNA密度在细胞核内并非均匀分布，且覆盖了广泛的动态范围。细胞核内区域的高倍放大图像显示，较大的 Voronoi 单元表示较低的 DNA 密度，而较小的单元则表示较高的 DNA 密度。在 G1C3H10T 细胞半核中测得的 DNA 密度反映了不同类型和物种细胞核内的绝对 DNA 密度分布。尽管其基本结构类似于早期 G1 期 HeLa 细胞核，但它还额外含有组成型的着丝粒旁异染色质簇。尽管G2期细胞核的大小略有增加，但其核结构未观察到显著的形态学变化。经TSA处理的HeLa细胞核在核拓扑结构和DNA密度方面表现出显著差异。除显示较高DNA密度岛状区域的周边异染色质外，其余染色质呈现出更加均一且去凝集的状态。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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