Name: 工程人造血干细胞和祖细胞中的致癌杂合功能获得突变 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-10T14:50:00.000+00:00
Duration: 12 min 4 s
Description: 了解利用CRISPR/Cas9和双rAAV供体转导技术在人造血干细胞和祖细胞中精确建模致癌杂合功能获得突变的方法。该技术结合荧光报告基因，实现纯合突变细胞群体的识别、富集和追踪，为研究白血病转化机制提供可靠工具。

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本工作获得了奥地利科学基金（FWF；项目编号 P32783 和 I5021）向 A.R. 提供的资助。此外，A.R. 还获得了奥地利内科学会（Joseph Skoda 研究奖学金）、奥地利血液学与肿瘤学学会（OeGHO；临床研究资助）以及 MEFOgraz 的额外资助。&#160;T.K. 是白血病研究会的特聘研究员 &amp;#38; 淋巴瘤协会

作者无任何利益冲突需要披露。

对人类原代造血干细胞和祖细胞（HSPCs）进行高效而精确的遗传操作，为探索和理解影响正常造血过程以及最重要的是造血细胞白血病转化的机制提供了重要机遇。
本方案描述了一种高效改造人HSPC以表达常见杂合型功能获得性突变的策略。该方法利用CRISPR/Cas9技术，并以rAAV6载体作为DNA模板供体，将野生型和突变型DNA序列精确插入其内源性基因位点。通过将改造后的cDNA（野生型和突变型）与独立的荧光报告蛋白偶联，可实现对明确处于杂合状态的细胞进行富集和追踪。
与常用的慢病毒（LV）载体方法相比，该策略具有多项优势。其中一个主要优势在于，基于CRISPR/Cas9的系统能够对内源性基因位点进行精确编辑，从而保留内源性启动子和调控元件。这使得编辑基因在细胞中的表达具有高度均一性，而使用慢病毒载体方法则难以实现这一目标。慢病毒载体介导的基因转移会导致基因以半随机方式整合，且倾向于插入转录活跃区域34。这可能导致转移基因的过表达以及编辑细胞之间的异质性，最终给突变功能和基因相互作用的研究与分析带来困难。第二个优势是，该系统作为一种位点特异性编辑系统，可消除插入突变所带来的风险35。
双荧光报告基因策略可实现对两个等位基因均成功编辑的细胞进行精确富集与追踪，其中一个等位基因整合了野生型cDNA，另一个等位基因整合了突变型cDNA序列。仅表达单一报告基因的细胞，可能代表仅发生单等位基因整合，或两个等位基因均整合了携带相同荧光报告基因的HDR模板。上述两种情况只有在获得单细胞来源的克隆并进行 individually 分析时，才能被精确区分。然而，造血干细胞和祖细胞（HSPCs）的增殖能力有限 体外，并且在长期培养过程中，造血干细胞和祖细胞（HSPCs）会开始分化为更成熟的子代细胞，从而失去自我更新和移植能力。这使得筛选并扩增携带目标杂合突变的单细胞克隆变得不可行。采用双荧光蛋白策略并结合流式细胞术对携带杂合突变的细胞进行富集，可克服长期培养所引发的上述问题 体外 培养。
在此特定示例中，成功证明了可以对造血干细胞和祖细胞（HSPCs）进行高效改造和分选，从而获得携带杂合型CALRDEL/WT&#160;突变的纯HSPC群体。
然而，该系统不仅限于构建杂合的移码突变，还可轻松用于创建其他类型的突变，包括错义突变和无义突变。通过使用包含野生型（WT）或突变序列并搭配不同荧光报告蛋白的腺相关病毒（AAV）组合，该系统还可用于引入纯合突变（同时转导两种均携带突变cDNA但带有不同荧光报告蛋白的重组AAV）或甚至修复突变（同时转导两种均携带野生型cDNA但带有不同荧光报告蛋白的AAV）。此外，需要指出的是，该策略不仅限于引入致癌的获得功能（GOF）突变。事实上，本方案所述的方法可用于多种替代策略，包括基因敲除、基因替换36,37、外源基因的靶向敲入（例如嵌合抗原受体）38，以及致病突变的修复11,39。
将CRISPR/Cas9与AAV6及多种荧光报告基因相结合的策略，已被证明适用于多种其他细胞类型，包括T细胞、浆细胞样树突状细胞、诱导性多能干细胞、神经干细胞以及气道干细胞24,38,40,41,42,43,44。该策略可用于制备性能更优的嵌合抗原受体（CAR）T细胞。例如，最近有研究报道，在CAR T细胞中通过CRISPR/Cas9介导敲除TGFBR2基因，可显著增强其在富含TGF-β的免疫抑制性肿瘤微环境中的功能45。此类方法可提供一种一步式方案，既实现T细胞的CAR表达工程化改造，又通过在TGFBR2基因的两个等位基因中特异性插入CAR来实现该基因的敲除。此外，该方法还可通过将CAR整合至T细胞受体α恒定区（TRAC）基因，用于生成通用型CAR T细胞46,47。
为了提高实验的可重复性并确保细胞编辑的高效性，需要注意一些关键因素。成功实现细胞编辑的主要关键点包括：(i) sgRNA 的选择，(ii) HDR 模板的设计，以及 (iii) rAAV6 的制备。
选择高效能的sgRNA至关重要，因为它将决定HDR模板能够整合到的等位基因的最大数量。由于目前已有多种可用的软件，候选sgRNA的筛选已大大简化。通过选定目标区域，软件可提供一系列候选sgRNA，并附带“靶上得分”和“脱靶得分”，分别表示在目标位点和非目标位点进行编辑的可能性。这些得分基于已发表的评分模型计算得出48,49。尽管这为选择高效能sgRNA提供了良好的起点，但仍需实验验证sgRNA的实际表现，因为其在计算机预测（in silico）中的性能并不总能反映其在体外（in vitro）的实际编辑效率。因此，强烈建议设计并测试至少三个sgRNA，以提高找到最优sgRNA的概率。一旦确定了真正高效能的sgRNA，即可进一步开展HDR模板的设计工作。
设计HDR模板时应考虑以下注意事项。左侧和右侧同源臂（LHA和RHA）应分别覆盖sgRNA切割位点上下游各400 bp的序列，因为较短的同源臂可能导致HDR频率降低。可引入的cDNA大小 通过 HDR 依赖于 AAV 的包装能力，其容量约为 4.7 kb。由于 HDR 模板中必须包含多个元件（LHA、RHA、SA、PolyA、启动子和荧光报告基因序列），可用于插入突变或野生型 cDNA 的空间十分有限。若目标突变位于基因的 3' 端附近，或目标基因的编码序列（CDS）整体较短，则此限制不构成问题。然而，当突变位于长 CDS 基因的转录起始位点（TSS）附近，且 CDS 长度超过 AAV 剩余包装容量时，上述方法可能不可行。为克服这一问题，Bak 及其同事近期开发了一种策略，即将 HDR 模板拆分至两个 AAV 载体中。该策略依赖于两次独立的 HDR 介导整合，以实现大片段基因的最终无缝整合50.
病毒的质量及其滴度是影响细胞基因组编辑成功与否的另外两个关键因素。为了获得最佳产量，在培养过程中应避免 HEK293T 细胞达到完全汇合。理想情况下，当 HEK293T 细胞汇合度达到 70%–80% 时即应进行传代。此外，不应将 HEK293T 细胞长期培养，因为这会降低其产生病毒的能力。HEK293T 细胞在传代 20 次后需重新复苏新的细胞。获得高病毒滴度对于提高实验的效率和可重复性至关重要。病毒滴度过低将导致转导造血干细胞和祖细胞（HSPCs）时需要使用大量重组腺相关病毒（rAAV）溶液。一般原则是，加入电转染细胞的 rAAV 溶液体积不应超过 HSPC 维持培养基总体积的 20%。过高的 AAV 溶液体积可能导致细胞死亡增加、增殖能力下降以及转导效率降低。因此，若病毒滴度较低，建议进一步浓缩病毒。
综上所述，本实验方案通过同时使用CRISPR/Cas9系统和rAAV6供体质粒，并结合双荧光报告系统，提供了一种可重复、精确且高效操控人类造血干细胞和祖细胞（HSPCs）的方法。该方法已被证实是研究正常造血干细胞生物学特性以及突变在白血病发生过程中作用的有力工具。

随着成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/Cas9 技术的发展，科学家的研究工具箱中增添了一种全新且极为强大的工具。该技术可实现基因组的精确编辑，不仅在科研领域被证明极为有用（详见 Hsu 等人综述1），而且近年来已成功应用于临床环境2,3,4。CRISPR/Cas9 编辑策略依赖于 Cas9 蛋白和单导向 RNA（sgRNA）的共同作用5,6,7。在宿主细胞中，Cas9 蛋白被引导至与 sgRNA 序列互补的 DNA 特定位点，并在此处引发 DNA 双链断裂（DSB）。一旦产生 DSB，细胞将启动两种主要且相互竞争的修复机制：非同源末端连接（NHEJ）和同源定向修复（HDR）。NHEJ 是一种易出错的修复机制，为主要使用的修复途径，常导致插入或缺失（indels）；而 HDR 则利用姐妹染色单体作为修复模板，具有高度精确性，但仅限于细胞周期的 S 期或 G2 期发生8。在基因组编辑中，可通过提供一个两侧带有与 Cas9 诱导的 DSB 两端 DNA 序列相同的同源臂的供体模板，利用 HDR 实现 DNA 的靶向修饰（图 1）。用于 HDR 的供体模板类型会显著影响编辑效率。在人类造血干细胞和祖细胞（HSPCs）的基因工程中，近期研究表明腺相关病毒 6 型（AAV6）是递送单链 DNA 模板的优良载体9,10。
CRISPR/Cas9基因组编辑可用于治疗性纠正有害突变11 但也可用于将致病性突变引入DNA，以模拟癌症的发生发展12血液癌症，例如白血病，会发展 通过 健康造血干细胞中体细胞突变的有序获得13,14早期遗传事件导致克隆性增殖优势，进而引发意义未明的克隆性造血（clonal hematopoiesis of indeterminate potential, CHIP）15,16进一步获得的突变最终将导致白血病转化和疾病的发生。在调控自我更新、存活、增殖和分化的基因中均可发现体细胞突变。17.
引入单个突变 通过 将基因组编辑技术应用于健康的造血干细胞和祖细胞（HSPCs），可精确模拟这一逐步发生的白血病发生过程。在急性髓系白血病（AML）等髓系肿瘤中，仅发现有限数量的反复出现的突变18,19 这使得该疾病特别适合利用基因组编辑工具进行模拟。
体细胞突变可能仅发生在一个等位基因上（单等位基因/杂合突变）或同时发生在两个等位基因上（双等位基因/纯合突变），并对基因功能产生显著影响，可能导致功能丧失（LOF）或功能获得（GOF）。当一个等位基因受影响时，LOF突变导致基因功能部分丧失；当两个等位基因均受影响时，则导致基因功能完全丧失；而GOF突变则导致基因活性增强或获得新功能。GOF突变通常为杂合型20。
重要的是，基因型（杂合与纯合）对准确模拟突变具有重大影响；因此，为了构建杂合的热点功能获得性突变，必须对基因的单个等位基因进行靶向操作。易错的非同源末端连接（NHEJ）会导致不同长度的插入或缺失（indels）。21 可能导致不同且不可预测的生物学后果。然而，由于NHEJ是细胞在产生DNA双链断裂后主要采用的修复途径，目前大多数用于操控HSPC的CRISPR/Cas9平台均无法精确预测其遗传结果22,23相比之下，利用CRISPR/Cas9介导的双链断裂（DSBs），并结合以重组腺相关病毒（rAAV）载体为基础的DNA供体模板进行基因组编辑 通过 HDR 可实现人类 HSPC 中等位基因特异性的突变插入11,24将突变序列与野生型（WT）序列同时整合，并在各自的等位基因上连接不同的荧光报告基因，可用于筛选杂合基因型图2该策略可作为一种强大工具，用于精确表征复发性白血病相关杂合型功能获得性热点突变对造血干细胞和祖细胞功能、疾病起始及进展的影响。
本文提供了一种高效构建在原代人造血干细胞和祖细胞（HSPC）中反复出现的杂合型功能获得性（GOF）突变的详细实验方案。该策略结合使用CRISPR/Cas9系统与双AAV6转导，分别提供野生型（WT）和突变型DNA供体模板，以实现目标杂合GOF突变的构建。以钙网蛋白（CALR）基因中反复出现的1型突变（52 bp缺失）为例进行说明25。在CALR基因第9外显子中的杂合GOF突变常见于骨髓增殖性肿瘤，如原发性血小板增多症（ET）和原发性骨髓纤维化（PMF）26。CALR是一种定位于内质网的蛋白质，主要在新合成蛋白质的折叠过程中发挥质量控制功能。其结构可分为三个主要结构域：氨基端（N端）结构域和富含脯氨酸的P结构域，参与蛋白质的分子伴侣功能；C结构域则参与钙离子的储存与调控27,28。CALR突变导致+1移码，从而转录产生一个新的延长的C末端，并丢失内质网（ER）滞留信号（KDEL）。研究表明，突变型CALR能够结合血小板生成素（TPO）受体，引发不依赖TPO的信号传导，导致细胞增殖增强29。
<img alt="图1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64558/64558fig01v2.jpg" /> 
图1：NHEJ 与 HDR 修复。 DNA 发生双链断裂后，NHEJ 和 HDR 修复机制的简化示意图。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64558/64558fig01largev2.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="图2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64558/64558fig02.jpg" /> 
图2：双等位基因HDR编辑策略的示意图。 示意图显示了供体模板整合到靶向等位基因中，随后翻译成功能性mRNA的过程。橙色虚线框表示对应于左侧同源臂（LHA）和右侧同源臂（RHA）的区域，理想的同源臂长度为每个400 bp。绿色虚线框表示对应于SA序列的区域，SA的长度为150 bp。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64558/64558fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>175 cm²细胞培养瓶，带透气盖，经组织培养处理</td><td>康宁</td><td>431080</td><td></td></tr><tr><td>150 mm × 25 mm 培养皿</td><td>康宁</td><td>430599</td><td></td></tr><tr><td>293T</td><td>DSMZ</td><td>ACC 635</td><td>https://www.dsmz.de/collection/catalogue/details/culture/ACC-635</td></tr><tr><td>4D Nucleofector 核心单元</td><td>Lonza</td><td>-</td><td>对于人HSPC的核转染，使用DZ-100程序。</td></tr><tr><td>4D Nucleofector X单元</td><td>Lonza</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>500 ml 离心管</td><td>康宁</td><td>431123</td><td></td></tr><tr><td>7-AAD</td><td>BD 生物科学</td><td>559925</td><td></td></tr><tr><td>AAVpro 纯化试剂盒</td><td>Takara</td><td>6666</td><td></td></tr><tr><td>Alt-R S.p. Cas9 核酸酶 V3</td><td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td><td>1081058</td><td></td></tr><tr><td>Avanti JXN-30 超速离心机</td><td>贝克曼库尔特</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Benchling sgRNA 设计工具</td><td></td><td></td><td>用于sgRNA设计的在线工具：http://www.benchling.com/crispr</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906-100G</td><td></td></tr><tr><td>C1000 Touch 梯度PCR仪</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>化学修饰的合成sgRNA</td><td>Synthego</td><td></td><td>网站：https://www.synthego.com/products/crispr-kits/synthetic-sgrna 
靶向 CALR 第7内含子的 sgRNA 序列：5&amp;rsquo;-CGCCTGTAATCCTCGCCCAG-3&amp;rsquo;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 将80个核苷酸的SpCas9支架序列添加到20个核苷酸的RNA序列上，以完成sgRNA的构建。在首尾3个碱基处添加2'-O-甲基化学修饰，并在前3个和最后2个碱基处添加3'硫代磷酸酯键。&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 或者，可从 IDT（https://eu.idtdna.com/site/order/oligoentry/index/crispr）和 Trilink（https://www.trilinkbiotech.com/custom-oligos）获取化学修饰的合成 sgRNA</td></tr><tr><td>CHOPCHOP sgRNA 设计工具</td><td></td><td></td><td>用于sgRNA设计的在线工具：http://chopchop.cbu.uib.no</td></tr><tr><td>Costar 24孔透明TC处理多孔板</td><td>康宁</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>CRISPick sgRNA 设计工具</td><td></td><td></td><td>用于sgRNA设计的在线工具：https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public</td></tr><tr><td>CRISPOR sgRNA 设计工具</td><td></td><td></td><td>用于sgRNA设计的在线工具：http://crispor.tefor.net</td></tr><tr><td>ddPCR 96孔板</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>12001925</td><td></td></tr><tr><td>探针法ddPCR超级混合液（不含dUTP）</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>1863024</td><td></td></tr><tr><td>DG8磁珠试剂盒（适用于QX200/QX100微滴生成仪）&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1864008</td><td></td></tr><tr><td>DG8 QX200/QX100 微滴生成仪用垫圈&amp;nbsp;</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>1863009</td><td></td></tr><tr><td>DreamTaq Green PCR Master Mix (2X)</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>K1081</td><td></td></tr><tr><td>探针用液滴生成油</td><td>Bio-Rad</td><td>1863005</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科&amp;rsquo;高糖 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6429-6X500ML</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科&amp;rsquo;磷酸盐缓冲液（DPBS）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537-500ML</td><td></td></tr><tr><td>FACSAria Fusion</td><td>BD 生物科学</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 5 mL 圆底管</td><td>康宁</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）Good Forte（热灭活），500 ml</td><td>Pan Biotech</td><td>P40-47500</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo 10.8.0</td><td>BD 生物科学&amp;nbsp;</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>GenAgarose L.E.</td><td>Inno-train</td><td>GX04090</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>SM0321</td><td></td></tr><tr><td>Gibson Assembly Master Mix</td><td>New England Biolabs Inc. (NEB)</td><td>E2611L</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES 溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887-100ML</td><td></td></tr><tr><td>ICE</td><td>Synthego</td><td></td><td>https://ice.synthego.com</td></tr><tr><td>IDT 密码子优化工具</td><td>IDT</td><td></td><td>https://www.idtdna.com/pages/tools/codon-optimization-tool</td></tr><tr><td>IDT sgRNA 设计工具</td><td></td><td></td><td>用于sgRNA设计的在线工具：https://www.idtdna.com/site/order/designtool/index/CRISPR_CUSTOM</td></tr><tr><td>LB肉汤（Lennox）EZMix粉末微生物培养基</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L7658-1KG</td><td></td></tr><tr><td>LB 肉汤加琼脂（Lennox）EZMix 粉末微生物培养基</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L7533-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Midori Green Advance</td><td>Nippon Genetics</td><td>MG04</td><td></td></tr><tr><td>Monarch 质粒小提试剂盒</td><td>NEB</td><td>T1010L</td><td></td></tr><tr><td>Monarch DNA 胶回收试剂盒</td><td>NEB</td><td>T1020L</td><td></td></tr><tr><td>NEB 5-alpha 感受态大肠杆菌（高效率）</td><td>NEB</td><td>C2987U</td><td></td></tr><tr><td>无核酸酶水，5×100 ml</td><td>Ambion</td><td>AM9939</td><td></td></tr><tr><td>NucleoBond Xtra Midi</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740410</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM 低血清培养基，500 ml</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>P3 原代细胞 4D-核转染器&amp;nbsp; X Kit L</td><td>Lonza</td><td>V4XP-3024</td><td>Lonza P3 原代细胞溶液提供为 2.25 mL P3 原代细胞核转染溶液和 0.5 mL 补充剂 1。重组时，将补充剂 1 加入 P3 原代细胞核转染溶液中并混匀。</td></tr><tr><td>pAAV-MCS2</td><td>Addgene</td><td>46954</td><td></td></tr><tr><td>可穿刺PCR板热封膜</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>1814040</td><td></td></tr><tr><td>pDGM6</td><td>Addgene</td><td>110660</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（P/S）</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯亚胺（PEI）</td><td>Polysciences</td><td>23966</td><td>将50 mg PEI加入离心管中，加入50 mL pH 4.5的PBS（用HCl配制）。将离心管置于70℃水浴中溶解&amp;deg;C水浴中，每10分钟涡旋一次，直至溶液完全溶解。待溶液升至室温后，经0.22 μm滤膜过滤除菌 &amp;mu;m 滤膜，制备 1120 &amp;mu;L 等分试样，于 -80 保存&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>聚苯乙烯试管，带卡扣盖</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>引物&amp;nbsp;</td><td>Eurofins</td><td>-</td><td>引物由 Eurofins（eurofinsgenomics.eu）合成，为未经修饰、无盐的定制寡核苷酸。引物设计采用 PRIMER-Blast（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）完成。&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 引物1 正向：&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; AAGTGATCCGTTCGCCATGAC&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 引物2 逆转录 CALR 野生型特异性：ACGTCCTCTTCCTCGTCCTC；&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 引物2 逆转录 CALR 缺失特异性：CCAACCCTGGAGACACGCTTC</td></tr><tr><td>PrimeTime qPCR 引物检测</td><td>IDT</td><td>-</td><td>PrimeTime qPCR 探针检测（1 条探针/2 条引物）&amp;nbsp; 可从 IDT 公司订购（https://eu.idtdna.com/site/order/qpcr/assayentry）。规格：标准品 - qPCR 检测试剂盒，500 次反应；引物 1 正向引物（5'-3'）：GGAACCCCTAGTGATGGAGTT；引物 2 反向引物（5'-3'）：CGGCCTCAGTGAGCGA；探针（5'-3'）：CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG；5' 端荧光染料/3' 端淬灭剂：FAM/ZEN/IBFQ；引物与探针比例：3.6</td></tr><tr><td>PX1 PCR板封膜机</td><td>Bio-Rad</td><td>1814000</td><td></td></tr><tr><td>QuantaSoft 软件</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quick Extract DNA提取溶液</td><td>Lucigen</td><td>QE0905T</td><td></td></tr><tr><td>QX200 微滴生成仪&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1864002</td><td></td></tr><tr><td>QX200 微滴读取仪</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>重组人 Flt3-配体</td><td>Peprotech</td><td>300-19</td><td></td></tr><tr><td>重组人 IL-6</td><td>Peprotech</td><td>200-06</td><td></td></tr><tr><td>重组人 SCF</td><td>Peprotech</td><td>300-07</td><td></td></tr><tr><td>重组人TPO</td><td>Peprotech</td><td>300-18</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758-6X500ML</td><td></td></tr><tr><td>SnapGene</td><td>Dotmatics</td><td></td><td>分子克隆软件 https://www.snapgene.com *也可使用 Benchling (https://www.benchling.com) 和 Geneious (https://www.geneious.com)。</td></tr><tr><td>Soc 出芽培养基</td><td>NEB</td><td>B9020S</td><td></td></tr><tr><td>丁酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B5887-1G</td><td></td></tr><tr><td>Stem Regenin 1 (SR1)</td><td>Biogems</td><td>1224999</td><td></td></tr><tr><td>StemSpan SFEM II</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>9655</td><td></td></tr><tr><td>TAE 缓冲液（Tris-乙酸-EDTA）50X</td><td>赛默飞世尔科技&amp;nbsp;</td><td>B49</td><td></td></tr><tr><td>TIDE</td><td></td><td></td><td>http://shinyapps.datacurators.nl/tide/</td></tr><tr><td>0.4% 台盼蓝</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154-100ML</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE（含酚红），500 ml</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>16605-028</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0.5：EDTA，pH 8.0，100 ml</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>UM171</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72914</td><td></td></tr><tr><td>Vector Builder 密码子优化工具</td><td>载体构建</td><td></td><td>https://en.vectorbuilder.com/tool/codon-optimization.html</td></tr></tbody></table>

在人类造血干细胞和祖细胞中构建致癌性杂合功能获得突变

Engineering Oncogenic Heterozygous Gain-of-Function Mutations in Human Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

在个体整个生命周期中，造血干细胞和祖细胞（HSPCs）会积累体细胞突变。其中一些突变会改变HSPCs的增殖和分化等生物学功能，从而促进血液系统恶性肿瘤的发生。为了建模、表征并深入理解这些反复出现的体细胞突变所导致的功能性后果，需要对HSPCs进行高效且精确的遗传操作。突变可能对基因产生有害影响，导致基因功能丧失（loss-of-function, LOF）；而与此截然相反的是，某些突变可能增强基因功能，甚至赋予其新的特性，称为功能获得（gain-of-function, GOF）。与LOF突变不同，GOF突变几乎总是以杂合状态存在。目前的基因组编辑技术尚无法实现对单个等位基因的选择性靶向，因而限制了对杂合GOF突变的建模能力。本文提供了一种详细的实验方案，通过结合CRISPR/Cas9介导的同源定向修复（HDR）与重组腺相关病毒6型（AAV6）技术高效递送DNA供体模板，实现对人类HSPCs中杂合GOF热点突变的精准构建。尤为重要的是，该策略采用双荧光报告系统，可实现对成功完成杂合编辑的HSPCs进行追踪与纯化。该方法可用于精确研究GOF突变如何影响HSPCs的功能及其向血液系统恶性肿瘤发展的进程。

通过应用上述方案，可获得杂合型1类 CALR 在脐带血来源的HSPCs中可重复地引入突变。该突变包含外显子9（该基因最后一个外显子）中的52 bp缺失 CALR），导致发生+1移码，从而翻译出一个新的带正电荷的C末端结构域26,33. 为了介绍 CALR 在内源基因位点引入突变时，采用了位于第9外显子上游的内含子靶向策略，因为该策略可在Cas9诱导的双链断裂未被修复的情况下，避免编码序列发生意外改变 通过 HDR 机制。在此特定情况下，由于第7内含子区域具有较高的靶向特异性序列、较低的脱靶序列，并且同源臂设计理想（无序列重复），因此针对该区域设计了 sgRNA。 图 5A).
随后设计了两种供体模板，并将其包装到AAV6载体中。为了实现从内源性外显子到整合cDNA的正确剪接，供体模板包含以下元件：(i) 一个SA序列，包括3'剪接位点、分支点和多嘧啶 tract；(ii) 外显子8-9的密码子优化cDNA序列，该序列包含野生型（CALRWT）或突变型（CALRDEL）序列，并带有终止密码子；(iii) 猴病毒40（SV40）polyA信号；(iv) 在独立的内部启动子——脾灶形成病毒（SFFV）启动子控制下，编码一种荧光蛋白的序列；随后是(v) 牛生长激素（bGH）polyA信号。包含CALRWT cDNA的供体模板设计为携带GFP表达盒，而包含CALRDEL cDNA序列的供体模板则设计为携带BFP表达盒。整个构建片段两侧分别带有左、右同源臂（图5A）。
在使用RNP复合物转染并用rAAV6病毒感染细胞两天后，通过流式细胞术对细胞进行分析。可检测到四个主要细胞群：（i）既不表达GFP也不表达BFP的细胞，代表未发生基于HDR的基因组编辑的细胞；（ii）仅GFP阳性的细胞，代表仅整合了野生型（WT）构建体的细胞；（iii）仅BFP阳性的细胞，代表仅整合了突变型构建体的细胞；以及（iv）GFP和BFP双阳性细胞，代表同时整合了野生型和突变型序列的细胞（图5B）。为了获得携带杂合型1型CALR突变的纯HSPC细胞群，通过流式细胞术对双阳性细胞进行分选。将两个野生型序列均敲入的HSPC用作对照细胞（GFP+ mCherry+；图5B）。另一种有效的对照细胞选择是荧光蛋白在安全位点（如AAVS1位点）发生双等位基因整合的HSPC（未展示）。经台盼蓝染色排除法对分选后的HSPC进行细胞计数，结果显示超过90%的细胞具有活性。
通过应用“内外”PCR策略，确认了构建体在靶位点的无缝整合（图6A）。在本实验中，我们分别进行了两次独立的“内外”PCR，一次用于检测敲入的CALRWT序列（图6A中凝胶电泳的第1泳道），另一次用于检测敲入的CALRDEL序列（图6A中凝胶电泳的第2泳道）。对从凝胶条带中提取的DNA进行Sanger测序，证实了野生型（WT）和突变型序列已正确插入至CALRDEL/WT&#160;HSPC中（图6B）。
<img alt="图5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64558/64558fig05.jpg" /> 
图5：携带杂合型 CALR 突变的造血干细胞和祖细胞（HSPC）的生成。（A）代表性示意图，展示插入杂合型 CALR 突变的基因编辑策略。RNP 复合物靶向 CALR 基因第7外显子与第8外显子之间的内含子区域。两个腺相关病毒（AAV）分别携带突变型第8-9外显子及BFP标记，以及野生型（WT）第8-9外显子及GFP标记，作为供体修复模板，促进突变序列在一个等位基因中的整合，同时野生型序列在另一等位基因中的整合。（B）代表性流式细胞术图谱，显示在对HSPCs进行转染和转导后48小时，GFP与BFP或GFP与mCherry的表达情况。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64558/64558fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64558/64558fig06.jpg" /> 
图6：HSPC中成功实现CALR杂合突变的验证。 （A）对从AAV对照、CALRWT/WT和CALRDEL/WT中提取的基因组DNA进行“in-out”PCR后，PCR产物的凝胶电泳结果。使用了100 bp DNA Marker。缩写：NTC = 无模板对照。（B）对CALRDEL/WT样本进行“in-out”PCR后获得的Sanger测序结果，证实了野生型和突变序列的成功整合。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64558/64558fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

为了更深入地研究造血干细胞生物学及血液系统恶性肿瘤，有必要建立能够真实模拟造血干细胞和祖细胞（HSPCs）中体细胞突变的新型策略。本文介绍了一种结合使用CRISPR/Cas9与双rAAV供体转导技术，在HSPCs中模拟杂合功能获得性突变的实验方案。

在其整个生命周期中，造血干细胞和祖细胞（HSPCs）会积累体细胞突变。其中部分突变会改变HSPC的功能……

该方法可对原代人造血干细胞和祖细胞中的复发性白血病驱动功能获得性突变进行精确建模，从而研究其在白血病转化中的作用。该技术的主要优势在于，基于CRISPR-Cas9的突变构建与荧光报告基因的引入相结合，从而能够唯一地识别、富集并追踪纯合的杂合突变细胞群体。本实验操作将由我实验室的博士后研究员 Tommaso Sconocchia 演示。首先，使用在线 Benchling 设计工具设计单导向 RNA：选择“plus create”选项，然后点击“DNA sequence”，接着选择“import DNA sequences”和“import from databases”选项。然后输入目标基因，并选择“human”作为物种。点击“search”选项，选择正确的转录本导入。选择要引入双链断裂的感兴趣区域。然后在屏幕右侧选择 CRISPR 选项，接着选择设计和分析向导。接下来选择单向导 RNA，并将向导序列长度保持为 20 个碱基对，PAM 序列为 SP-Cas9 编辑所用序列。选择一个靶上得分高且脱靶得分高的向导，从商业供应商处订购经过化学修饰的合成单向导 RNA。设计HDR模板时，将基因组序列和编码序列导入分子克隆软件。从基因组序列文件中，通过在双链断裂位点的5'端选择约400个碱基对来设计左侧同源臂，并将该序列粘贴至新文件中。从基因组序列文件中，通过选取目标内含子的最后150个碱基对作为剪接受体序列，并将其粘贴至左侧同源臂之后。从编码序列文件中选择目标 cDNA。对 cDNA 进行密码子优化，并将其插入剪接受体序列之后。在目标 cDNA 的下游，于荧光蛋白的启动子序列之后插入一个 3' 端多聚腺苷酸化信号。然后，插入荧光蛋白的序列以及第二个但不同的多聚腺苷酸化信号。从基因组序列文件中，通过在双链断裂的三端选择理想长度为400个碱基对的序列来设计右侧同源臂，并将该序列插入到第二个多聚腺苷酸化信号之后。接着，创建整个模板的一个拷贝，并修饰目标cDNA，使其包含所需突变的序列。将荧光蛋白替换为另一种荧光蛋白。将HDR模板构建并克隆至AAV表达载体中。为制备重组AAV6，准备10个直径150毫米的培养皿，每个培养皿中含有1100万个HEK293T细胞，培养基为20毫升DMEM，添加10% FBS、1%青霉素-链霉素和25毫摩尔HEPES。然后，将培养皿放入37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中培养24小时。小心弃去旧培养基后，加入20毫升不含抗生素的DMEM培养基，该培养基需添加10% FBS、25毫摩尔HEPES和1毫摩尔丁酸钠。接着，准备两个15毫升离心管，分别标记为管一和管二。向第一管中加入 5 毫升低血清培养基、60 微克重组 AAV6 突变 HDR 质粒和 220 微克 PDGM6 辅助质粒。向第二管中加入 5 毫升低血清培养基和 1120 微升浓度为 1 毫克/毫升的聚乙烯亚胺溶液。将第二管中的内容物加入第一管后，涡旋振荡 30 秒，然后在室温下孵育 15 分钟。将1.1毫升溶液逐滴小心加入每皿中，并通过轻柔旋转混匀。将培养皿置于37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中孵育48小时。然后向每皿中加入250微升0.5摩尔EDTA，并将培养皿放入培养箱中孵育10分钟。通过将细胞从培养皿上冲洗下来收集细胞，并转移至500毫升离心管中。在4摄氏度下以2000 ×g离心10分钟，弃去上清液。通过涡旋振荡使沉淀松散，然后使用AAV纯化试剂盒提取病毒。将纯化的病毒分装后，于-80摄氏度保存。解冻CD34阳性造血干细胞和祖细胞后，将细胞转移至10毫升预热的含1%青霉素-链霉素的RPMI培养基中。在室温下以350 × g离心10分钟。将细胞悬浮于造血干细胞和祖细胞保留培养基中，调整细胞浓度至每毫升250,000个细胞，在37摄氏度及5%二氧化碳条件下孵育72小时。随后，将细胞收集至15毫升离心管中，通过台盼蓝排斥法进行细胞计数并检测细胞活力。为制备核糖核蛋白复合物，取15微克Cas9和8微克单链向导RNA加入1.5毫升离心管中，在加热块中25摄氏度孵育10分钟。在核糖核蛋白复合物孵育的同时，将细胞在350 ×g离心5分钟，并弃去上清液。用100微升核转染溶液重悬细胞后，将细胞与核糖核蛋白复合物混合，并转移至电转杯中。轻轻敲击比色皿以去除任何残留的气泡，然后将比色皿插入转染系统的电穿孔仪样品槽中，对细胞进行电穿孔。电穿孔后立即加入400 µL预热的不含青霉素-链霉素的造血干细胞与祖细胞维持培养基，并用细口移液器将细胞转移至含有预热的不含青霉素-链霉素的造血干细胞与祖细胞维持培养基的培养板中。随后将培养板放入培养箱中。 将含有冷冻重组AAV的冻存管置于冰上解冻，并通过移液器将每种重组AAV6的最佳用量加入细胞悬液中进行转导。用移液器轻轻混匀细胞悬液后，将转导后的细胞在37°C和5%二氧化碳条件下孵育6至8小时。孵育6至8小时后，将细胞收集至离心管中，在室温下以350 G离心5分钟。弃去上清液，加入新鲜的预热造血干细胞和祖细胞维持培养基（含青霉素-链霉素），并将细胞转移至细胞培养板中。于37°C及5%二氧化碳条件下培养48小时。为了分选携带杂合功能获得性突变的工程化细胞，将细胞收集至15毫升离心管中，于室温下以350 ×g离心5分钟，操作如前所述。弃去上清液，将细胞重悬于 1 毫升含 0.1% PSA 的 DPBS 中，于室温下以 350 ×g 离心 5 分钟。弃去上清液后，根据细胞数量，将细胞重悬于适量体积的含 0.1% BSA 的 DPBS 中，操作方法如前所述。将细胞转移至配有盖子的无菌 FACS 管中，并向细胞悬液中加入 7 µL AAD 或其他活/死细胞染料，用于排除死细胞。将表达两种荧光报告蛋白的活细胞分选至含有200微升造血干细胞与祖细胞保存培养基的收集管中。参照之前的方法，将分选后的细胞在室温下以350 ×g离心5分钟，重悬至浓度为250,000个细胞/毫升，用于后续培养扩增或直接用于功能检测。在使用核糖核蛋白复合物进行转染并用重组AAV6病毒转导后的第2天，通过流式细胞术对细胞进行分析。检测到四个主要细胞群体，包括未发生基于HDR的基因组编辑、且不表达GFP或BFP的细胞；仅表达GFP、且仅整合了野生型构建体的细胞；仅表达BFP、且仅整合了突变型构建体的细胞；以及同时表达GFP和BFP的双阳性细胞，后者整合了野生型和突变型序列。为验证杂合型钙网蛋白突变的成功敲入，对仅与AAV共孵育的细胞以及与核糖核蛋白复合物和携带敲入序列的AAV共孵育的细胞中提取的基因组DNA进行了“敲入/敲出”PCR分析。在DNA提取前，根据两种荧光报告基因的同时表达对细胞进行了分选。凝胶电泳后，从凝胶中切下目标条带，并提取DNA用于后续的Sanger测序。测序结果证实了野生型和突变序列在杂合型钙网蛋白突变造血干细胞和祖细胞中成功实现了无缝整合。进行该实验时最重要的是要仔细筛选表现最佳的单导向RNA，因为这将决定整体的HDR效率，从而影响杂合突变成功敲入的频率。通过该程序，经基因工程改造的细胞可用于功能性体外和体内实验，例如集落形成单位检测、分化检测以及移植到免疫缺陷小鼠体内。

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