激光消融与活体显微成像技术研究肠道重塑

损伤模型对于在体内研究再生过程至关重要，然而，研究肠道再生已被证明是一项技术上的挑战。由于缺乏纵向成像方案，人们难以深入理解调控肠道再生的细胞和组织尺度上的动态过程。在本方案中，我们描述了一种活体显微镜方法，可在单个隐窝尺度上局部诱导组织损伤，并以时空可控的方式，在活体小鼠中追踪肠上皮对基于光子的激光消融损伤（无论是单个隐窝还是更大范围的肠区）所产生的再生反应。

后续的长期重复活体成像能够随时间推移追踪损伤区域，并可在数周时间内监测组织修复过程中的隐窝动态变化。在手术前4至6周，通过注射溶解于葵花籽油中的他莫昔芬诱导小鼠。实施镇痛处理，在手术前30分钟皮下注射200微升布托啡诺。

术前24小时在饮水中给予卡洛芬。将经高压灭菌的无菌手术器械放入生物危害柜中。打开加热垫，并将温度设置为37摄氏度。

在成像前至少四个小时开启显微镜的温控培养室。保持培养室内温度稳定在37摄氏度。打开双光子显微镜、扫描仪和激光器。

启动成像软件。将激光波长调节至 960 纳米，并打开快门。使用 2% 至 3% 异氟烷麻醉小鼠，并将其放置在覆盖无菌布的加热垫上。

通过评估小鼠每秒一次的呼吸频率和呼吸质量，并检查小鼠的反射来确认麻醉深度。用眼药膏覆盖小鼠的眼睛。皮下注射200 µL预热的无菌生理盐水。

剃除腹部毛发并清除毛发。更换手术区域的无菌布。插入直肠探针以监测小鼠体温。

温度应保持在约37摄氏度。戴上一副新的无菌手套。用消毒液以环形方式擦拭手术区域，随后用80%乙醇擦拭，重复三次。

用无菌手术巾覆盖小鼠。检查小鼠的反射。使用无菌手术刀通过皮肤做一条10毫米的垂直正中切口。

使用剪刀切开腹白线，分离腹直肌以打开腹腔。用浸有预热无菌生理盐水的无菌棉签寻找小鼠的盲肠，并以此作为解剖定位的参考点。取一块纱布，在其上剪一小口，用预热的无菌生理盐水浸湿后，覆盖于切口上方。

用浸有预热无菌生理盐水的无菌棉签取出肠道。通过添加灭菌的预热生理盐水保持肠道湿润。将小鼠转移至预热的无菌成像盒中。

将肠道置于无菌玻璃片上。将小鼠头部放入成像盒的吸入管中。如有必要，使用无菌柔性薄膜和胶带固定小鼠。

将装有小鼠的成像盒放入显微镜腔室中。通过每15分钟检查一次呼吸频率和深度，以及通过直肠探针监测体温来在成像过程中监控小鼠状态。异氟烷浓度应保持在1%至2%之间。使用显微镜的IPs找到肠道中的目标区域。

使用显微镜的内置相机获取目标区域的宽视野图像。利用多光子显微镜的960纳米激光对目标区域进行成像。根据实验中使用的荧光染料调整激光功率和波长。

在此示例中，隐窝表达的膜呈红色荧光蛋白，通过低剂量他莫昔芬诱导后，随机标记绿色荧光蛋白。对感兴趣区域采集10至20步、每步3微米的Z轴层扫图像。从先前的平铺图像中选择单个或多个位置。

根据目标损伤大小，使用成像软件在32倍放大倍数下，以124 × 124像素分辨率和400赫兹扫描速度，结合双向扫描模式进行3至10秒的击穿点校准。隐窝区域损伤的起始可通过绿色和红色通道中自发荧光的增强来识别。消融后，采集损伤区域的Z轴层扫图像，以确认损伤的位置和范围。

在同一小鼠的多个区域重复上述两个步骤。将仍处于麻醉状态的小鼠置于无菌缝合区域，并用无菌布单覆盖。使用浸有预热无菌生理盐水的无菌棉签，将暴露的肠管重新送回腹腔内。

使用可吸收缝线通过单纯连续缝合法缝合白线。用外科结扎法封闭缝线的两端。对皮肤层重复相同的步骤。

关闭异氟烷工作站，清洁并灭菌成像箱及内衬。将小鼠置于加热垫上的笼子中，使其术后恢复一小时。术后6至12小时，皮下注射200 µL布托啡诺。

术后72小时内通过饮用水给予卡洛芬。术后每周每天称量小鼠体重并监测其健康状况。在第一次成像至少一周后的第二个时间点，重复手术和活体成像。

利用血管的分布模式，在第一个时间点的图像上重新定位相同的感兴趣区域。如果无需在其他时间点对小鼠进行成像，则在麻醉下通过颈椎脱臼法处死小鼠。否则，继续进行手术部位的缝合及术后护理。

在手术及首次成像前4至6周，对K19-Cre ERT mTmG小鼠注射他莫昔芬，以诱导细胞随机表达GFP标记。手术暴露小鼠肠道后，采集目标区域的明场及荧光图像，随后利用多光子激光的击穿点设置消融隐窝。损伤的起始可通过绿色和红色通道中自发荧光的增强来识别。

一个月后重复相同的操作，利用血管系统作为解剖标志，重新定位到同一区域。使用 Lgr5-eGFP confetti 模型，可通过不同颜色标记的隐窝追踪其随时间的变化，从而绘制出恢复过程的动态图谱。在此示例中，绿色隐窝表达 Lgr5 Cre，而一个品红色隐窝则被标记为 confetti 颜色。

激光消融后两周可观察到不同的再生模式。某些区域保持不变，而其他区域则表现出隐窝分裂（即一个隐窝分裂为两个）、隐窝融合（即两个隐窝合并为一个）或隐窝消失等形态的重塑。激光消融结合活体显微成像技术可将损伤限制在特定的目标区域。

这使我们能够控制损伤的位置以及损伤的范围。通过调节损伤的严重程度，可以选择性地消融隐窝或整个肠区，从而帮助我们了解隐窝尺度上的再生反应。除了空间控制外，激光消融还能精确定义损伤发生的时间，并可在同一小鼠中对同一器官在稳态和再生状态下的情况进行连续成像，因而其精确性超过了以往的损伤模型。

激光消融与重复活体成像技术的应用可作为多种研究问题和不同科学领域的研究平台，涵盖再生、免疫学以及癌症研究等领域。