Name: 激光消融和活体显微镜研究肠道重塑 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-09T14:55:00.000+00:00
Description: 学习利用激光消融和活体显微镜技术在小鼠模型中研究肠道再生机制。该方法可在单隐窝水平精确诱导组织损伤，并通过长期重复成像追踪肠道上皮组织的修复动态，为再生生物学和组织工程研究提供重要见解。

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本研究由荷兰科学研究组织NWO（Vici项目资助号09150182110004，授予J.v.R.；Veni项目资助号09150161910151，授予H.A.M）、OCENW.GROOT.2019.085（授予J.v.R）以及欧洲分子生物学组织（EMBO）博士后奖学金（资助号ALTF 452-2019，授予H.A.M）支持。

本研究中描述的所有动物实验均按照荷兰癌症研究所（NKI）动物福利委员会（AWB）的指南和批准进行。
注意：在进行任何动物实验之前，请咨询所在机构的动物伦理委员会。
1. 手术与活体成像的准备工作
<ol>
	<li>术前处理
	<ol>
		<li>在手术前 4-6 周，通过腹腔注射将他莫昔芬溶于葵花籽油中，诱导 8-12 周龄的 K19-CreERT237: Rosa26-mTmG38 和 Lgr5eGFP-IRES-CreERT218: Rosa26-Confetti39 小鼠（图 1）。</li>
		<li>实施镇痛。手术前 30 分钟，按每 30 g 小鼠皮下注射 200 µL 用 0.9% NaCl 稀释的丁丙诺啡（0.1 mg/kg 体重）。在含有 125 mL 未酸化灭菌饮用水的瓶子中加入卡洛芬（0.067 mg/mL），于手术前 24 小时给予。或者，在手术开始前 30 分钟皮下注射卡洛芬（5 mg/kg）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>手术准备
	<ol>
		<li>将灭菌的手术器械放入生物安全柜中。</li>
		<li>打开加热垫并将温度设定为 37 °C。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>活体成像准备
	<ol>
		<li>在成像前至少 4 小时开启显微镜的温控腔室，以确保有足够的时间达到温度稳定。 
		注意：所需时间可能因所用设备而异。</li>
		<li>保持气候腔室内的温度稳定在 37 °C。</li>
		<li>开启双光子显微镜、扫描仪和激光器。</li>
		<li>启动成像软件。</li>
		<li>将激光波长调节至 960 nm 并打开快门。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 手术与活体成像
<ol>
	<li>肠道的手术暴露
	<ol>
		<li>使用2%-3%异氟烷麻醉小鼠，并将其置于加热垫上，表面覆盖无菌布。通过观察呼吸频率和质量（每秒一次呼吸）以及检测小鼠的反射来评估麻醉深度。</li>
		<li>用眼药膏覆盖小鼠的眼睛。</li>
		<li>皮下注射200 µL预热的无菌生理盐水。</li>
		<li>剃除腹部毛发并清除毛发。更换手术区域的无菌布。</li>
		<li>插入直肠探针以监测小鼠体温。 
		注意：温度应约为 37 °C。</li>
		<li>戴上一副新的无菌手套。</li>
		<li>以圆形方式对术区进行清洁，交替使用消毒液和80%乙醇各擦拭三次。用无菌棉签去除多余的乙醇。 
		注意：此时必须密切监测小鼠是否出现低体温。</li>
		<li>用无菌手术巾覆盖小鼠。</li>
		<li>检查小鼠的反射。</li>
		<li>使用无菌手术刀在皮肤上做一个约10毫米的垂直正中切口。</li>
		<li>使用剪刀切开腹白线，分离腹直肌以打开腹腔。</li>
		<li>使用浸有无菌预热生理盐水的无菌棉签寻找小鼠的盲肠，并以其作为参考点。</li>
		<li>在一块无菌纱布上剪一个小口，将其浸入预热的无菌生理盐水中润湿，然后覆盖于切口上方。</li>
		<li>用浸有预热无菌生理盐水的无菌棉签取出肠道。通过添加无菌预热生理盐水保持肠道湿润。</li>
		<li>将一个无菌的定制成像室放置在小鼠旁边。</li>
		<li>将小鼠转移至预热的无菌成像盒中。</li>
		<li>将肠道置于成像盒的无菌玻璃上。将小鼠头部放入成像盒的吸入管内，如图所示 图1.</li>
		<li>如有必要，使用无菌柔性薄膜和胶带固定小鼠。</li>
		<li>将装有小鼠的成像箱放入显微镜腔室中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>活体成像
	<ol>
		<li>成像过程中通过监测小鼠的呼吸频率、呼吸深度和体温来观察其状态 通过 每15分钟使用一次直肠探头。异氟烷的百分比应保持在1%至2%之间，必要时进行调整。</li>
		<li>使用显微镜的目镜在肠道中找到一个区域。</li>
		<li>使用显微镜内置相机获取目标区域的宽场视野图像，如图所示 图2A.</li>
		<li>使用多光子显微镜的960 nm激光对感兴趣区域进行成像。根据实验中使用的荧光染料调整激光功率和波长。</li>
		<li>获取目标区域10-20步、每步3 µm的z轴层扫图像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>激光消融
	<ol>
		<li>从先前成像的图块中选择单个位置或多个位置。</li>
		<li>使用成像软件的漂白点校准功能，在32倍放大倍数、124 × 124像素分辨率、扫描速度400 Hz条件下，采用双向扫描模式，持续3–10秒，具体时间根据预期损伤大小而定。隐窝区域损伤的起始可通过绿色和红色通道中自发荧光的增强来识别。</li>
		<li>在同一小鼠的多个区域重复上述两个步骤。</li>
		<li>消融后，获取损伤区域的z轴层扫图像，以确认损伤位置和范围。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>手术部位的关闭
	<ol>
		<li>将仍处于麻醉状态的小鼠置于无菌缝合区域。</li>
		<li>使用浸有预热无菌生理盐水的无菌棉签，将暴露的肠管复位至腹腔内。</li>
		<li>使用可吸收的5-0缝线连续缝合腹白线。以手术结结扎缝线的起始和末端。</li>
		<li>对皮肤层重复相同的步骤。</li>
		<li>关闭异氟烷工作站，并对成像箱及其内衬进行清洁和灭菌。</li>
		<li>使用外科器械清洁剂、酶清洁剂和外科器械润滑剂清洁手术工具。待干燥后，将手术工具与手术箱一同放入高压灭菌器中进行灭菌。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>术后护理
	<ol>
		<li>让小鼠在手术后恢复，期间将鼠笼置于加热垫上约1小时。 
		注意：如果可能，将小鼠与其他笼内同伴一起饲养。单独饲养并非恢复所必需。</li>
		<li>每15分钟检查一次小鼠的体温。</li>
		<li>注射 200 µL&#160;皮下注射生理盐水稀释的丁丙诺啡（0.1 mg/kg 体重），每30 g小鼠在术后6–12 h给药。</li>
		<li>术后72小时内，在含有125 mL非酸化高压灭菌饮用水的瓶子中加入卡洛芬（carprofen，0.067 mg/mL）供动物自由饮用。</li>
		<li>术后每周每天称量小鼠体重并监测其健康状况。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 重复手术与活体成像
<ol>
	<li>手术
	<ol>
		<li>在第二次时间点（首次成像至少一周后），重复步骤 1.1.2、1.2、1.3 和 2.1。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>活体成像
	<ol>
		<li>重复步骤 2.2.1–2.2.3。</li>
		<li>利用血管分布模式，定位在第一次时间点成像的相同感兴趣区域。</li>
		<li>重复步骤 2.2.4 和 2.2.5。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>手术部位关闭
	<ol>
		<li>重复步骤 2.4.1。</li>
		<li>如果小鼠无需在后续时间点进行成像，则在终末麻醉下通过颈椎脱位法处死小鼠；否则，继续下一步。 
		注：根据欧盟指令 2010/63/EU 附录 IV 的指南，颈椎脱位是一种可接受的方法。</li>
		<li>重复步骤 2.4.2–2.4.6。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>术后护理
	<ol>
		<li>重复步骤 2.5.1–2.5.5。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intestinal+crypt%2C+a+prototype+stem+cell+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The intestinal crypt, a prototype stem cell compartment.</a> Cell. 154 (2), 274-284 (2013).</li>
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<li>Ritsma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+crypt+homeostasis+revealed+at+single-stem-cell+level+by+in+vivo+live+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Intestinal crypt homeostasis revealed at single-stem-cell level by in vivo live imaging.</a> Nature. 507 (7492), 362-365 (2014).</li>
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<li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+stem+cells+in+small+intestine+and+colon+by+marker+gene+Lgr5%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5.</a> Nature. 449 (7165), 1003-1007 (2007).</li>
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<li>Choi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+crypts+recover+rapidly+from+focal+damage+with+coordinated+motion+of+stem+cells+that+is+impaired+by+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Intestinal crypts recover rapidly from focal damage with coordinated motion of stem cells that is impaired by aging.</a> Scientific Reports. 8 (1), 10989(2018).</li>
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<li>Erreni, M., Doni, A., Weigert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+acute+intravital+imaging+of+the+large+intestine+in+live+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Method for acute intravital imaging of the large intestine in live mice.</a> Methods in Molecular Biology. 2304, 285-299 (2021).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案结合显微激光消融与纵向活体显微成像技术，用于追踪肠道从早期损伤应答到长期组织重塑的再生过程。该技术的建立严格遵循伦理考量，以诱导并成像显微激光消融；若严格按照步骤操作，可确保实验动物的健康状态。手术过程中，必须确保肠道完整性得到良好保护。可通过使用无菌湿润棉签轻柔操作组织，防止组织出血或干燥。激光诱导的微观损伤程度也应在激光消融后通过成像目标区域的不同肠壁层次进行仔细评估。若研究人员希望调整本方案中所述实验步骤的频率，应在实验前咨询所在机构的动物伦理委员会，以明确其对动物福利可能造成的影响。
重复的活体显微镜技术可实现对同一只小鼠体内组织修复过程的长期动态监测。通过反复进行手术暴露肠道，可方便地获得对整个肠道的光学观察通路。组织固有的特征（如血管结构）可作为解剖标志，用于在每次成像过程中识别相同的肠段区域。因此，可在数周内对同一组织区域进行连续成像，从而实现对同一只小鼠同一肠区长期组织再生过程的定量分析。该联合手术与成像方法所提供的时空控制优势在于，可在同一只小鼠中分别观察器官在稳态与再生状态下的情况，这与以往的全器官损伤模型形成对比——在那些模型中，对照组与再生样本来自不同的小鼠11,12,18,19,20。因此，本实验设计显著减少了实验所需动物数量，并降低了个体间差异带来的影响。
实验方案的故障排除应首先回顾小鼠和肠道的操作技术，并检查显微镜设备及其设置。本方案中有多个关键步骤需要特别注意。首先，为确保动物福利以及持续获得高质量的数据，所有操作必须在洁净无菌的环境中采用无菌技术进行，且在手术及每次成像过程中均需维持小鼠体温。在成像期间使用无菌预热的生理盐水保持组织湿润至关重要，可防止组织发生纤维化。
为确保实验具有可重复性，使用前应对激光器进行校准以获得最佳采集效果，并在每次实验开始时测量多光子激光器的输出功率。物镜类型、放大倍数、像素驻留时间、激光功率和波长等参数均会影响显微激光消融的程度，需予以考虑。本研究中，激光消融和成像均使用 Fluotar VISIR 25×/0.95 WATER 物镜，在波长 960 nm、激光功率 1.2 W（物镜出口处）的条件下进行。改变波长或光学扫描特性会影响显微损伤的程度。较低的波长（如 840 nm）对应更高能量的光子，通常导致激光输出更高，可能增强显微损伤。更高的放大倍数（zoom）会使单位区域获得更多的能量，因此消融隐窝所需时间更短，反之亦然。也可通过增加或减少像素驻留时间来调节消融速度和损伤程度。当成像组织不稳定时（例如由于肠蠕动），需快速完成消融。为此，可通过提高放大倍数和/或增加激光输出等方式优化消融速度。
在多次成像过程中准确定位相同的肠段区域是确保实验成功的关键步骤之一，必须正确执行。为此，需要在所有时间点将肠道以完全相同的方式进行定位。我们建议始终以盲肠作为参考点，用于定位小肠和大肠中的相同区域。使用棉签轻轻拉伸目标组织，可确保感兴趣区域处于物镜工作距离范围内，并最大限度地提高可被追踪的区域数量。此外，建议在每只小鼠中消融并成像多个显微位置，以应对后续成像过程中可能无法重新定位的区域。即使肠道定位正确但仍无法找到目标区域时，可尝试重新调整小鼠体位并改变暴露区域的朝向。对于需要消融多个相邻隐窝等较大肠段区域的实验，长期追踪隐窝可能较为困难。此类损伤性操作可能引发超出上皮单层的组织重塑，最终导致用于长期追踪的组织标志物发生改变。选择距离损伤部位足够远的标志点，并获取超出损伤区域数百微米的更大视野，有助于提高长期实验的成功率。除肠道在显微镜载物台上的定位不当外，胃肠道的蠕动也可能干扰成像。该问题可通过两种方式缓解：若蠕动频率不高，可在相同区域通过增加曝光时间重复成像过程。&#160;或者，可使用更高剂量的麻醉剂以减少蠕动。我们建议将异氟烷的高剂量使用限制在短暂调整期间。总体而言，应尽可能缩短每次成像时间，理想情况下不超过3小时，以确保动物快速恢复。
与其它损伤模型相比，联合激光消融与纵向活体显微技术具有多项优势。以往的（化学性）损伤模型无法实现损伤区域的局部限定6,11,12,19,20。激光消融通过将损伤限制在特定感兴趣区域，克服了这一局限性。这使得研究人员能够精确控制损伤的位置以及损伤范围。通过调节损伤强度，可实现对隐窝或整个显微肠区的消融，从而研究隐窝尺度上的再生反应。除了空间控制能力外，激光消融还可精确控制损伤发生的时间，因此在时间精度上优于以往的药物、化学和感染模型9,10,11,12,19,20。本方案在先前使用激光诱导热消融以在肠道内造成局部损伤的研究基础上进行了拓展21,23。以往的激光诱导损伤模型仅对小肠局部区域21或远端结肠腔面23进行成像。本研究结合外科手术与激光消融技术，可实现对肠道上皮（尤其是隐窝）的高分辨率可视化，并可在小肠、盲肠及近端结肠的任意位置实施激光消融，随后对组织修复过程进行连续成像观察。该方法能够长期追踪同一肠道区域的恢复过程，根据实验设计可视化肠道的不同层次结构（黏膜层、黏膜下层、肌层和浆膜层）。本技术主要适用于持续数周至数月的长期重复成像研究。若需研究隐窝的短期恢复动态（例如损伤后连续数天内的变化），可将本文所述的激光消融方法与活体成像窗技术相结合27,28,40。
该方案可广泛应用于再生、免疫学和癌症研究等多个科学领域的研究。对肠道再生进行纵向成像，有助于揭示维持上皮完整性与屏障功能、介导宿主防御肠腔病原体侵袭，以及驱动致癌突变清除与扩散的细胞动态过程。每个科学问题对激光诱导损伤的程度和成像持续时间均有特定要求。利用荧光报告小鼠及注射染料可显著扩展并优化数据获取能力，实现对任何目标细胞和结构的可视化观察。例如，Lgr5-CreERt2:Rosa26-Confetti 小鼠可用于追踪干细胞子代，而 Rosa26-mTmG 报告系统则可揭示组织结构。这些最新技术进步共同使活体肠道实验成为深入理解肠道生物学与疾病机制的有力工具。

肠道的上皮衬层 constantly 受到胃酸、毒素和微生物群的挑战，这些因素可能导致上皮屏障的破坏。肠道结构和组织具有特殊的自我更新和修复损伤的能力。小肠的单层上皮组织形成隐窝-绒毛结构单元1。在稳态条件下，位于隐窝底部的 Lgr5+ 肠道干细胞能够自我更新，并产生分化的子代细胞。这些分化后的子代细胞以类似传送带的方式沿绒毛轴向上迁移，最终在绒毛顶端脱落，从而使整个肠上皮在 3–5 天内完成更新2,3。从长期来看，并非所有 Lgr5+ 细胞对组织更新的贡献均等，因为部分细胞还需具备逆着传送带方向向隐窝底部移动（即逆行运动）的能力4,5。事实上，当 Lgr5+ 细胞因辐射等因素被清除后，位于隐窝底部以外的前体细胞会迁移至隐窝底部，去分化并重新补充干细胞池6,7,8。
急性炎症可导致Lgr5+干细胞的丢失9,10。除了干细胞丢失外，许多外部因素还可在隐窝尺度上引起上皮的急性损伤。辐射、化学处理和抗生素已被证实会损伤肠隐窝和绒毛11。细菌、病毒和寄生虫感染则可影响更大范围的隐窝和绒毛区域12。肠道具有通过隐窝分裂（一个隐窝分裂为两个）在隐窝尺度上从内外损伤中显著恢复的能力13。在损伤发生后，损伤区域邻近的隐窝会通过分裂来补充隐窝数量。这一现象在稳态条件下也会发生，尽管程度较轻14,15。为了平衡稳态期间隐窝数量潜在的增加，隐窝也可发生融合（两个隐窝合并为一个）16,17。隐窝融合是否在损伤后重建隐窝数量中发挥作用，目前尚不清楚。此外，该过程的动力学特征及其调控因素仍有待阐明。
损伤模型对于研究至关重要&#160;组织再生 体内已采用多种损伤模型来研究肠道组织再生。以往的实验策略利用高剂量辐射来耗尽干细胞池18 或使用葡聚糖硫酸钠（DSS）处理以在小鼠中诱导慢性与急性结肠炎及隐窝丢失19,20通过遗传学或光学手段进行的单细胞消融已被用于精确控制组织损伤，被视为解析干细胞与前体细胞功能的一种有力工具21,22 并研究血管再生23此外，已开发出一种活检损伤系统，用于在多个隐窝和绒毛的较大区域诱导损伤24重要的是，对损伤性刺激的反应可能沿着肠道的近端-远端轴存在差异，这一点已在辐射研究中得到证实，辐射在小肠中造成的损伤比在结肠中更为严重。25这凸显了需要采用靶向方法，以控制肠道损伤程度及其在肠道中的定位。
损伤程度和恢复过程传统上通过静态方法进行评估，这些方法对组织恢复的动力学信息提供有限。活体显微成像技术（IVM）为量化干细胞行为、上皮重塑以及多种器官中的再生过程提供了独特的机会26,27,28,29,30，同时为肠道生物学研究带来了重要见解4,5,21,31,32,33,34,35,36。
本文介绍了一种可诱导时空特异性肠道损伤并捕捉肠上皮层修复过程的方法。我们利用双光子激光消融技术损伤肠道隐窝，并通过重复性活体显微成像追踪损伤后的即时伤口反应及长期修复过程。本方案可实现对局部组织损伤后肠道组织结构再生重塑过程的系统性描绘。隐窝动态变化，包括分裂与融合事件，均可被便捷地定量分析并进行时间序列追踪。激光消融结合重复活体成像技术可作为研究肠道组织架构在稳态及病理生理条件下（如肿瘤起始过程）组织尺度动态变化的平台。

<table><tbody><tr><td>麻醉诱导箱</td><td>Veterinary Technics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>高压灭菌器</td><td>Certoclav</td><td></td><td></td></tr><tr><td>聚维酮碘</td><td>Mylan</td><td>202809</td><td></td></tr><tr><td>护理垫（吸水垫）</td><td>Absorin comfort</td><td></td><td></td></tr><tr><td>杜蒙特镊子</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>11255-20 或 11272-40</td><td>不锈钢，型号 #55，用于夹持腹膜</td></tr><tr><td>酶解器械清洗剂</td><td>Roboz</td><td>EC-1000</td><td></td></tr><tr><td>80% 乙醇</td><td>自制</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>眼膏</td><td>Duratears Z (Alcon)</td><td>288/28282-6</td><td></td></tr><tr><td>直头精细剪刀，9 cm</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>14060-09</td><td>用于剪开小鼠皮肤和腹膜</td></tr><tr><td>纱布 5 cm×5 cm</td><td>Cutisoft (Bsn medical)</td><td>45847-00</td><td></td></tr><tr><td>格拉夫齿状弯镊</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>11051-10</td><td>用于夹持皮肤</td></tr><tr><td>哈特曼直型止血钳</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>13002-10</td><td>用于缝合</td></tr><tr><td>加热垫</td><td>Comfort</td><td>T5-5000</td><td></td></tr><tr><td>成像箱</td><td>定制</td><td></td><td></td></tr><tr><td>切口膜</td><td>Nobafilm</td><td>172215</td><td></td></tr><tr><td>带自动载物台的倒置多光子显微镜</td><td>Leica Microsystems</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷（vetflurane）</td><td>Pharmachemie BV, Haarlem, Netherlands</td><td>305788</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷蒸发器</td><td>Penlon sigma delta</td><td></td><td></td></tr><tr><td>纸质微孔胶带</td><td>Micropore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.9% 氯化钠</td><td>Braun</td><td></td><td>其他品牌可用</td></tr><tr><td>25G 针头</td><td>BD</td><td>300600</td><td></td></tr><tr><td>tesa 纸胶带</td><td>Tesa</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm 封口膜</td><td>Bemis</td><td>PM-994</td><td>半透明胶带</td></tr><tr><td>剃须刀片</td><td>Supermax 不锈钢</td><td></td><td>其他品牌可用</td></tr><tr><td>直肠探头</td><td>Kent Scientific</td><td>20250-91</td><td></td></tr><tr><td>Rimadyl 牛用（卡洛芬）</td><td>Zoetis B.V</td><td>注册号 REG NL 10130</td><td></td></tr><tr><td>学生用直头精细剪刀，11.5 cm</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>91460-11</td><td>用于剪纱布</td></tr><tr><td>外科器械清洗剂</td><td>Roboz</td><td>IC-1000</td><td></td></tr><tr><td>外科器械润滑剂</td><td>Roboz</td><td>IL-1000</td><td></td></tr><tr><td>注射器（1 ml）</td><td>BD</td><td>303172</td><td>其他品牌可用</td></tr><tr><td>他莫昔芬</td><td>Sigma</td><td>T5648</td><td></td></tr><tr><td>丁丙诺啡盐酸盐（Temgesic）</td><td>Indivior UK Limited/Reckitt Benckiser Healthcare</td><td>注册号 RVG 08725</td><td></td></tr><tr><td>薇乔聚乳酸-羟基乙酸缝线 5-0，FS-2 针</td><td>Ethicon</td><td>V292ZH</td><td></td></tr><tr><td>VirkonS</td><td>Bio-services</td><td></td><td>消毒溶液</td></tr><tr><td>木柄无菌棉签</td><td>Klinion</td><td>531530</td><td>其他品牌可用</td></tr></tbody></table>

激光消融与活体显微成像技术研究肠道重塑

Laser Ablation and Intravital Microscopy to Study Intestinal Remodeling

探究肠道修复 体内 是一项精细的技术挑战。由于缺乏纵向成像方案，人们对调控肠道再生的细胞和组织尺度动态过程仍缺乏深入理解。本文介绍了一种活体显微成像方法，可在单个隐窝尺度上局部诱导组织损伤，并在活体小鼠中追踪肠上皮的再生反应。通过高强度多光子红外激光，以时间和空间可控的方式消融单个隐窝或较大范围的肠组织区域。随后进行的长期重复活体成像，实现了对损伤区域随时间变化的追踪，并可在数周时间内监测组织修复过程中的隐窝动态。在激光诱导损伤后，邻近组织中观察到隐窝分裂、融合及消失等隐窝重塑事件。该方案可用于研究稳态及病理生理条件下（如衰老和肿瘤起始）的隐窝动态变化。

为了展示激光消融方法结合活体成像所能获得的实验结果类型，我们进行了如图1所示的实验。首先，我们向K19-CreERT2;mTmG（K19cre-mTmG）和Lgr5eGFP-IRES-CreERT2;Rosa26-Confetti（Lgr5cre-Confetti）小鼠注射他莫昔芬，以随机地标记细胞表达Confetti荧光颜色之一（在mTmG小鼠中则为绿色荧光蛋白[GFP]）。K19-cre可实现所有上皮细胞的谱系示踪，而Lgr5-cre仅标记干细胞的谱系8,18,37。他莫昔芬注射在手术及首次成像前4–6周进行，以确保隐窝中所有细胞均为单一克隆颜色。在数周内对相同组织区域进行可靠识别，对于追踪同一隐窝随时间变化的命运至关重要。组织固有的结构特征（如血管系统）可作为可靠的组织标志物，并通过显微镜内置相机进行记录。此外，使用（至少两种）不同颜色标记少量隐窝，有助于在每次成像过程中识别相同的隐窝，并追踪其在激光损伤后再生过程中的行为。在手术暴露小鼠肠道并获取目标区域的相机图像和荧光图像后（图2A），可利用多光子激光的漂白点设置消融一个或多个隐窝（图2B,C）。损伤的起始可通过绿色和红色通道中自发荧光的增强来识别。为了研究隐窝恢复的动力学过程，在首次成像后的数周或数月重复进行手术和成像操作，并利用组织固有结构（血管系统和克隆标记隐窝的分布模式）作为定位标志，以精确定位先前损伤的位置（图2）。当该方法应用于Lgr5Cre-Confetti小鼠（其中Lgr5-eGFP呈斑片状表达）时，可捕捉到激光损伤后隐窝数量和形态的变化（图3）。某些区域在隐窝数量和结构上未见明显变化（图3B），而其他区域则表现出广泛的隐窝重塑，表现为隐窝分裂与融合事件数量的增加（图3C），以及激光损伤两周后隐窝的丢失（图3D）。通过引入不同大小的损伤，并定量分析消融后发生的分裂、融合和隐窝消失事件（如图3E所示示例），可在不同小鼠模型中绘制损伤诱导再生的动力学图谱。
<img alt="他莫昔芬诱导的谱系示踪示意图；激光消融及肠道细胞成像恢复。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64756/64756fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：实验设计的示意图。 通过向基因修饰小鼠模型腹腔注射他莫昔芬，实现肠道细胞的体内标记，从而在肠隐窝中诱导Cre介导的重组。数天或数周后（当隐窝变为单一颜色的单克隆状态时），手术暴露肠道，并在带有温度控制腔室的多光子显微镜下进行激光消融。消融后立即评估隐窝损伤程度，随后让小鼠从手术中恢复。通过多次手术暴露和活体成像（IVM）来长期监测肠道的修复过程。利用血管系统的分布模式以及不同颜色的隐窝定位，在消融后数周甚至数月重新找到相同的区域。在消融部位，可在数周后观察到隐窝的重塑现象（例如分裂或融合）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64756/64756fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示组织再生的显微镜图像，分别为消融前和消融后，随时间变化使用 mTmG 标记。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64756/64756fig02v6.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：肠道激光损伤后组织再生的纵向成像。当肠道以完全相同的方式定位时，可利用其血管作为参考图谱，用于定位并成像完全相同的区域。(A) 肠道的相机概览图像。白色虚线表示损伤部位（白色方框）邻近区域的血管分布模式，作为定位另一时间点相同激光消融区域的解剖标志。下方两幅图像为白色方框区域的放大视图。箭头指示第1天及1个月后激光消融的确切位置。(B) 多光子显微镜拍摄的单个隐窝损伤的荧光图像。蓝色方框中的箭头显示第1天及1个月后损伤部位的位置。(C) 隐窝损伤区域的荧光图像。蓝色方框中的箭头标记第1天及1个月后损伤区域的位置。比例尺：1 mm (A，顶部)；0.25 mm (A，底部)；200 µm（大范围图像 B 和 C）；以及 50 µm（放大图像 B 和 C)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64756/64756fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="Lgr5-eGFP消融后隐窝重塑；荧光显微镜；分裂、融合、消失的相关数据。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64756/64756fig03v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：激光消融后隐窝命运的活体成像。 （A）利用Confetti模型，可随时间追踪被不同颜色标记的隐窝，以绘制修复动态图谱。白色箭头表示激光消融位点。黄色框代表邻近区域（距损伤部位＜100 µm），而蓝色和紫色框代表远离（＞100 µm）激光消融区域的部位。可观察到多种再生模式。（B）某些区域保持不变，如紫色框所示。（C）其他区域表现为隐窝重塑，形式为隐窝分裂或融合；白色虚线和箭头表示隐窝分裂事件，橙色虚线和箭头表示隐窝融合事件。（D）在某些区域可观察到隐窝消失，如黄色框中由橙色虚线标示的隐窝已消失。（E）一个量化示例，显示在损伤部位邻近区域（即小于100 µm）和远端区域（即大于100 µm）观察到的隐窝重塑事件数量。比例尺：200 µm（A）；50 µm（B-D）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64756/64756fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本文介绍了一种在激光诱导损伤后获取肠道图像的方法。通过将小鼠肠道暴露于多光子激光下，可在局部诱导单个或多个隐窝的丧失。通过在数月内对损伤区域进行重复成像，可实时捕捉肠道修复的动态过程。

研究体内肠道修复过程是一项极为精细的技术挑战。由于缺乏纵向成像方案，人们难以深入理解……

损伤模型对于在体内研究再生过程至关重要，然而，研究肠道再生已被证明是一项技术上的挑战。由于缺乏纵向成像方案，人们难以深入理解调控肠道再生的细胞和组织尺度上的动态过程。在本方案中，我们描述了一种活体显微镜方法，可在单个隐窝尺度上局部诱导组织损伤，并以时空可控的方式，在活体小鼠中追踪肠上皮对基于光子的激光消融损伤（无论是单个隐窝还是更大范围的肠区）所产生的再生反应。后续的长期重复活体成像能够随时间推移追踪损伤区域，并可在数周时间内监测组织修复过程中的隐窝动态变化。在手术前4至6周，通过注射溶解于葵花籽油中的他莫昔芬诱导小鼠。实施镇痛处理，在手术前30分钟皮下注射200微升布托啡诺。术前24小时在饮水中给予卡洛芬。将经高压灭菌的无菌手术器械放入生物危害柜中。打开加热垫，并将温度设置为37摄氏度。在成像前至少四个小时开启显微镜的温控培养室。保持培养室内温度稳定在37摄氏度。打开双光子显微镜、扫描仪和激光器。启动成像软件。将激光波长调节至 960 纳米，并打开快门。使用 2% 至 3% 异氟烷麻醉小鼠，并将其放置在覆盖无菌布的加热垫上。通过评估小鼠每秒一次的呼吸频率和呼吸质量，并检查小鼠的反射来确认麻醉深度。用眼药膏覆盖小鼠的眼睛。皮下注射200 µL预热的无菌生理盐水。剃除腹部毛发并清除毛发。更换手术区域的无菌布。插入直肠探针以监测小鼠体温。温度应保持在约37摄氏度。戴上一副新的无菌手套。用消毒液以环形方式擦拭手术区域，随后用80%乙醇擦拭，重复三次。用无菌手术巾覆盖小鼠。检查小鼠的反射。使用无菌手术刀通过皮肤做一条10毫米的垂直正中切口。使用剪刀切开腹白线，分离腹直肌以打开腹腔。用浸有预热无菌生理盐水的无菌棉签寻找小鼠的盲肠，并以此作为解剖定位的参考点。取一块纱布，在其上剪一小口，用预热的无菌生理盐水浸湿后，覆盖于切口上方。用浸有预热无菌生理盐水的无菌棉签取出肠道。通过添加灭菌的预热生理盐水保持肠道湿润。将小鼠转移至预热的无菌成像盒中。将肠道置于无菌玻璃片上。将小鼠头部放入成像盒的吸入管中。如有必要，使用无菌柔性薄膜和胶带固定小鼠。将装有小鼠的成像盒放入显微镜腔室中。通过每15分钟检查一次呼吸频率和深度，以及通过直肠探针监测体温来在成像过程中监控小鼠状态。异氟烷浓度应保持在1%至2%之间。使用显微镜的IPs找到肠道中的目标区域。使用显微镜的内置相机获取目标区域的宽视野图像。利用多光子显微镜的960纳米激光对目标区域进行成像。根据实验中使用的荧光染料调整激光功率和波长。在此示例中，隐窝表达的膜呈红色荧光蛋白，通过低剂量他莫昔芬诱导后，随机标记绿色荧光蛋白。对感兴趣区域采集10至20步、每步3微米的Z轴层扫图像。从先前的平铺图像中选择单个或多个位置。根据目标损伤大小，使用成像软件在32倍放大倍数下，以124 × 124像素分辨率和400赫兹扫描速度，结合双向扫描模式进行3至10秒的击穿点校准。隐窝区域损伤的起始可通过绿色和红色通道中自发荧光的增强来识别。消融后，采集损伤区域的Z轴层扫图像，以确认损伤的位置和范围。在同一小鼠的多个区域重复上述两个步骤。将仍处于麻醉状态的小鼠置于无菌缝合区域，并用无菌布单覆盖。使用浸有预热无菌生理盐水的无菌棉签，将暴露的肠管重新送回腹腔内。使用可吸收缝线通过单纯连续缝合法缝合白线。用外科结扎法封闭缝线的两端。对皮肤层重复相同的步骤。关闭异氟烷工作站，清洁并灭菌成像箱及内衬。将小鼠置于加热垫上的笼子中，使其术后恢复一小时。术后6至12小时，皮下注射200 µL布托啡诺。术后72小时内通过饮用水给予卡洛芬。术后每周每天称量小鼠体重并监测其健康状况。在第一次成像至少一周后的第二个时间点，重复手术和活体成像。利用血管的分布模式，在第一个时间点的图像上重新定位相同的感兴趣区域。如果无需在其他时间点对小鼠进行成像，则在麻醉下通过颈椎脱臼法处死小鼠。否则，继续进行手术部位的缝合及术后护理。在手术及首次成像前4至6周，对K19-Cre ERT mTmG小鼠注射他莫昔芬，以诱导细胞随机表达GFP标记。手术暴露小鼠肠道后，采集目标区域的明场及荧光图像，随后利用多光子激光的击穿点设置消融隐窝。损伤的起始可通过绿色和红色通道中自发荧光的增强来识别。一个月后重复相同的操作，利用血管系统作为解剖标志，重新定位到同一区域。使用 Lgr5-eGFP confetti 模型，可通过不同颜色标记的隐窝追踪其随时间的变化，从而绘制出恢复过程的动态图谱。在此示例中，绿色隐窝表达 Lgr5 Cre，而一个品红色隐窝则被标记为 confetti 颜色。激光消融后两周可观察到不同的再生模式。某些区域保持不变，而其他区域则表现出隐窝分裂（即一个隐窝分裂为两个）、隐窝融合（即两个隐窝合并为一个）或隐窝消失等形态的重塑。激光消融结合活体显微成像技术可将损伤限制在特定的目标区域。这使我们能够控制损伤的位置以及损伤的范围。通过调节损伤的严重程度，可以选择性地消融隐窝或整个肠区，从而帮助我们了解隐窝尺度上的再生反应。除了空间控制外，激光消融还能精确定义损伤发生的时间，并可在同一小鼠中对同一器官在稳态和再生状态下的情况进行连续成像，因而其精确性超过了以往的损伤模型。激光消融与重复活体成像技术的应用可作为多种研究问题和不同科学领域的研究平台，涵盖再生、免疫学以及癌症研究等领域。

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激光消融和活体显微镜研究肠道重塑

该视频展示了以微米级精度对三维类器官共培养模型进行激光显微切割的过程。在三维类器官模型中，成纤维细胞等间质成分与癌源性上皮细胞进行三维共培养。该三维模型作为一种实验工具，可在接近生理条件的环境中研究肿瘤侵袭及癌-间质相互作用。...

激光显微切割：一种从三维类器官培养模型中分离侵袭性结直肠癌细胞的技术

本视频展示了利用共聚焦显微镜在转基因小鼠中可视化γδ型上皮内淋巴细胞（IELs）。手术过程包括创建穿孔线并进行纵向切口，以暴露肠黏膜和绒毛。这些转基因小鼠仅在γδ IELs中表达报告蛋白，从而实现对这些细胞的追踪。活体成像捕捉到绿色荧光标记的γδ...

活体成像观察γδ上皮内淋巴细胞

活体显微成像是一种强大的工具，能够对活体动物中的多种生物学过程进行成像。本文介绍了一种详细的方法，用于对活体小鼠唾液腺中分泌颗粒等亚细胞结构动态进行成像。...

活体小鼠中表达荧光蛋白的亚细胞结构成像的活体显微镜技术

通过使用转基因报告小鼠和可注射的荧光标记物，长期活体旋转盘共聚焦显微镜技术能够直接观察ApcMin/+...

使用旋转盘共聚焦显微镜对 ApcMin/+ 小肠肿瘤中髓系细胞动态的实时成像

我们详细介绍了一种利用活体共聚焦显微镜在麻醉小鼠的肠系膜静脉中监测中性粒细胞和单核细胞在稳态及炎症条件下行为的实验方案。...

通过活体显微镜实时成像麻醉小鼠肠系膜静脉中的中性粒细胞和单核细胞

靶向特异性探针是分析多种疾病（例如，炎症、感染和肿瘤发生）中分子机制（如蛋白质表达）的一种创新工具。本研究描述了一种利用F4/80特异性荧光介导断层成像技术，对结肠炎小鼠模型中肠道巨噬细胞浸润进行定量三维断层评估的方法。...

用于检测与定量小鼠肠道巨噬细胞相关炎症的荧光介导断层成像技术

透明的 C. elegans 肠道可作为“在体内 用于在多细胞管状结构形成过程中，在单细胞和亚细胞水平上研究顶-基底膜及管腔生物发生的组织腔室。本方案描述了如何结合标准标记、基因功能缺失/RNAi以及显微镜技术，在分子水平上解析这些过程。...

TheC. elegans肠道作为细胞间管腔形态发生的模型体内极化膜在单细胞水平上的生物发生：抗体标记、RNAi功能缺失分析与成像

我们介绍了一种利用倒置旋转盘共聚焦显微镜对小鼠小肠进行活体成像，以观察表达GFP标记的γδ上皮内淋巴细胞（γδ...

小鼠小肠上皮内淋巴细胞的活体成像

利用活体显微技术，本文所介绍的方法能够实现对活体动物肠道上皮细胞脱落过程的实时可视化观察。因此，通过对麻醉小鼠的肠道黏膜进行局部染色（吖啶黄和罗丹明B-葡聚糖），可借助共聚焦显微镜以单细胞分辨率进行成像。...

基于活体显微镜的肠道通透性与上皮细胞脱落功能评估方法

胚胎发育需要细胞运动的大规模协调。双光子激发介导的激光消融技术可实现对深层大量细胞进行空间可控的三维消融。此外，该技术还可用于探究集体迁移细胞的反应 体内...

利用双光子显微镜在斑马鱼原肠胚中实现深度与空间可控的体积消融

白细胞和血小板的募集是动脉生成过程中侧支动脉有效生长所必需的关键组成部分。多光子显微镜是一种能够以高时空分辨率追踪细胞动态的高效工具。 体内...

多光子活体成像监测小鼠后肢模型中动脉生成过程中的白细胞募集

学习利用激光消融和活体显微镜技术在小鼠模型中研究肠道再生机制。该方法可在单隐窝水平精确诱导组织损伤，并通过长期重复成像追踪肠道上皮组织的修复动态，为再生生物学和组织工程研究提供重要见解。

激光消融与活体显微成像技术研究肠道重塑

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