使用开源液滴微流控技术进行质粒稳定性分析

我们开发了高通量的微流控芯片IC方法，用于研究细胞群体多样性及细胞间相互作用。在此过程中，凝胶微滴技术使我们能够在被捕获的细胞中以高度并行的方式完成一系列有用的实验步骤，例如裂解、染色、DNA操作以及显微成像。微滴微流控工作流程以其超高通量和多功能性著称，但其应用常受限于对高端仪器设备和专门技术知识的需求。

本方案通过高通量单细胞分析结合荧光染色以及可及的开源显微成像流程，改进了传统技术。该方法利用微流控技术将细胞包裹于凝胶微滴中，从而可同时分析微小细胞和微菌落。相较于缺乏特异性和分辨率的群体培养和培养板方法，本技术能够获得精确且具有代表性的多种现象统计结果。

我们的实验方案结合了液滴微流控技术、荧光显微镜和开源硬件，形成了一种基于标记的方法。该方法使单细胞分析更加灵活且经济实惠，使科学界能够解决有关微生物群落的复杂科学问题。首先，在Luria Bertani（LB）肉汤中将浓度为2%的超低凝胶温度琼脂糖加热至90摄氏度。

在温控摇床中将混合物振荡10分钟，然后将恒温摇床的温度降至39摄氏度，以冷却琼脂糖溶液。将大肠杆菌悬液管放入恒温摇床中加热4分钟，使其温度升至39摄氏度。将细菌悬液与琼脂糖溶液按1:1比例混合，使琼脂糖终浓度为1%，细胞悬液浓度为每毫升3.1×10⁶个细胞。

使用 LB 培养基与琼脂糖悬浮液按 1:1 比例配制阴性对照溶液，用于污染监测。获取完整的开源流控平台，包括气体压力驱动装置和流量传感器。在装置中配备载玻片和移液器吸头加热器，以控制琼脂糖细胞样品进入芯片时的温度。

接下来，将微流控芯片放置在增强频闪显微镜载物台上，确保液滴生成结点可见。通过控制软件界面将移液器吸头加热器和载玻片加热器设置为40摄氏度。使用带有管路和PDMS塞的注射器，将1%琼脂糖细胞悬浮液混合物装入200微升移液器吸头中。

将吸头插入吸头加热器中，并将其放置在微流控芯片水相入口处。更换吸头的PDMS密封件，将其与流控系统管路连接。接着，将油相管路插入第二个入口，将出口管路末端插入废液管中。

然后在用户界面上将油相和水相的压力均设为80毫巴，并开始注入细胞悬液和油。将油相压力调节至320毫巴，水相压力调节至180毫巴。等待一分钟，使液滴生成达到稳定状态。

液滴生成稳定后，将出口管路从废液管转移到收集管。继续在冰上收集液滴，直至样品储液管排空。收集完成后，将收集管置于 4°C 环境中静置一小时，使液滴内的琼脂糖凝胶充分凝固。

将含有细菌的凝胶微滴和阴性对照微滴在37摄氏度下孵育4小时或过夜，以促进菌落生长。孵育结束后，使用带有21号针头的3毫升注射器，小心地从凝胶微滴乳液底部尽可能去除油相。取50微升凝胶微滴转移至新的微量离心管中，在4摄氏度下保存，用于后续微滴分析；加入与剩余乳液体积相等的氟化油与PFO的1:1混合液。

接下来，在乳液上方加入约 200 µL 的 0.9% 氯化钠缓冲液。涡旋混合物，并在固定转速离心机中短暂离心。小心地从液体界面底部移除油相，并从顶部弃去 100 µL 氯化钠溶液。

将两微升凝胶微滴转移至成像腔载玻片中，并加入五微升氟化油，以帮助形成单层微滴，实现最佳成像效果。在显微镜上，从上方开启白色LED矩阵照明，用于明场成像。安装制备好的载玻片。

聚焦样品以找到单层液滴，并拍摄明场图像。接着，调节滤光轮使其与绿色波长滤光片对齐。切换至470纳米LED进行激发，在不移动样品的情况下，拍摄菌落的荧光图像。

将2 µL碘化丙啶染色的微凝胶转移至成像腔室芯片中，加入5 µL 0.9%氯化钠溶液，使微凝胶形成单层。封闭芯片的进样口和出样口，防止成像过程中液体蒸发。调节红色波长区间滤光片以进行碘化丙啶成像，采集明场和荧光图像。

通过明场显微镜确认了细胞在凝胶微滴中的包封情况，显微镜图像显示微滴均匀，且包封的细胞清晰可见。通过荧光比率分析鉴定出丢失质粒编码荧光的菌落。在分析的2,785个菌落中，有100个菌落失去荧光，表明质粒丢失率为3.6%。