使用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱法分析全甲基化粘蛋白 O-糖

我们正在研究胃肠道宿主微生物相互作用的糖生物学，重点关注覆盖胃肠道的黏液层，特别是黏蛋白及其糖链在健康和疾病中的作用。黏蛋白糖链越来越被认可为宿主与微生物相互作用中的重要因素，因为它们为细菌提供养分和结合位点。糖基化谱的变化可能导致微生物组的紊乱，反之亦然，这些表型在疾病状态中很常见。

然而，黏蛋白研究起来非常困难，因为它们糖基化程度很高。采样技术和后续生物信息学分析的创新，以及新的样本处理方法，能够提升通量并缩短从样本采集到结果的时间。其他分析技术允许对糖链进行更详细的结构表征，但需要较长时间的运行和分析时间。

本文描述的使用MALDI-TOF质谱技术具有速度优势，使其通量高，适合筛选和剖面分析。首先，将纯化粘蛋白与250微升β消除缓冲液混合在4毫升玻璃瓶中。用包有聚四氟乙烯的盖子密封小瓶，并在45摄氏度下培养反应16小时。

在冰上，将一毫升5%醋酸溶液滴入反应混合物中。脱盐时，用少量玻璃棉塞入玻璃移液器。从顶部向玻璃移液器加入1.5毫升树脂悬浮液，然后让它沉淀并排出。

现在，用两毫升5%醋酸清洗树脂，丢弃流水。然后将粘液样本加入脱盐柱，收集流水在5毫升管中。用一毫升5%醋酸清洗柱子两次以收集流水。

然后使用离心蒸发器去除醋酸，并将样品在5毫巴、30摄氏度下浓缩两小时。将样品溶解在0.5毫升甲醇醋酸中，并在氮气流下干燥。使用玻璃注射器，向装有氢氧化钠和甲醇混合物的小瓶中加入4毫升DMSO。

涡旋后，将溶液以2000克离心两分钟。小心地将上清液倒出，去除盐分，且不扰动凝胶。确认不再形成盐类后，将凝胶重新悬浮于4毫升无水DMSO中，准备过甲基基悬浮液。

接着，在干燥的黏液样品中加入无水DMSO和过甲基化碱，紧接着加入碘甲烷。在室温下用力摇晃，孵育过甲基化反应30分钟。然后加入0.5毫升水以终止反应。

样品变浑浊后，用氮气冲洗直到变透明。将样品装入亲水脂溶平衡96孔提取板上。施加正压，使样品以约每分钟一毫升的流速通过固相。

丢弃流水后，用一毫升水冲洗井口两次。用一毫升甲醇洗脱平板上的糖链两次。只需施加压力直到甲醇开始从板中流出，然后让重力流动维持所需的速率。

用离心蒸发器干燥样品，溶解在10微升TA50中。混合一微升样品与基质后，将其装入钢制MALDI靶板上，晾干。数据分析时，将导出的质谱ASCII文件导入GlycoWorkbench。

完成基线校正后，计算峰点，并在弹出窗口中选择合适的质量范围、最小信噪比和最小质谱峰值强度。然后，使用糖峰查找器工具识别与峰列表相符的结构组成。选择 perMe 作为导数，redEnd 作为约化端，并设定期望残基的最小和最大数。

对于黏蛋白，选择己糖、N-乙酰己胺、脱氧己糖和N-乙酰神经氨酸。对于硫酸化糖链，使用质量为87.9的“其他残基”选项。对于MALDI-TOF数据，将钠离子和电荷的最大数设为各一个，精度设为0.5道尔顿。

用Control键选择所有正确的注释，然后点击每一个。右键点击选中的注释，选择添加到带注释的峰值列表。要生成比较多个注释光谱的报告，请进入工具和报告，创建比较不同配置文件的报告。

打印报告后保存为PDF。对于碎片化光谱分析，将光谱加载到GlycoWorkbench，并如前所述生成峰值列表。绘制对应注释糖链组成的假定糖链结构。

要为每个结构生成片段，右键点击选择“复制片段到画布”，并在碎片工具中选择“计算碎片”。如需进一步的碎片分析，请点击频谱查看器中的感兴趣峰值。右键点击并选择“查找所有与峰匹配的结构”，以查询所选峰峰的主电荷比值，查询在线数据库。

选择感兴趣的假定结构，右键点击将其复制到画布窗口，并设置相应选项。要计算每个糖链结构可能的片段，请在画布中选择该结构。然后，在工具和片段中，选择当前结构的计算片段。

如果计算了多个糖链结构的片段，请在摘要标签下的片段表视图中查看比较表。选择每个潜在糖链结构中与峰列表匹配的片段。右键点击，从下拉菜单选择“复制片段到画布”。

最后，在工具标签页中，进入分析器，然后是标注所有结构的峰值。然后选择工具、报告，创建注释报告。通过离子交换脱盐，较大糖链的回收率更好，这些大结构占总糖链的31%，而PGC提取时为21%。

在鉴定的糖链结构中，一种糖链仅通过离子交换脱盐样品被鉴定。此外，离子交换和硼酸盐去除的去盐导致的光谱信噪比高于用PGC固相提取后产生的。过甲基化反应时间分别为30分钟和90分钟，鉴定出33个糖链峰，而5分钟反应仅识别出31个峰。