使用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱分析全甲基化黏蛋白 O-糖链

我们正在研究胃肠道中宿主与微生物相互作用的糖生物学，重点关注覆盖胃肠道的黏液层，特别是黏蛋白及其聚糖在健康与疾病中的作用。黏蛋白聚糖 increasingly 被认为是宿主-微生物相互作用中的重要因素，因为它们为细菌提供营养物质和结合位点。糖基化谱的改变可导致微生物群组成紊乱，反之亦然，这类表型在疾病状态下常被观察到。

然而，黏蛋白由于高度糖基化，研究起来极具挑战性。取样技术的创新以及后续的生物信息学分析方法的进步，连同样品处理新方法的开发，均可推动该领域的发展，提高通量并缩短从样品采集到获得结果的时间。其他分析技术能够实现对糖链更详细的结构表征，但需要较长的运行和分析时间。

此处所述的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）技术具有快速的优势，使其通量高，适用于筛选和分析。首先，将纯化的黏蛋白与250微升β-消除缓冲液混合于一个4毫升的玻璃小瓶中。用带聚四氟乙烯衬垫的盖子 tightly 密封小瓶，并在45°C下孵育反应16小时。

在冰上，将1毫升5%乙酸溶液逐滴加入反应混合物中。为对样品进行脱盐，用少量玻璃棉堵塞玻璃移液管。从顶部向玻璃移液管中加入1.5毫升树脂悬浮液，然后静置使其沉降并排出。

现在，用两毫升5%乙酸洗涤树脂，并弃去流出液。然后，将黏蛋白样品加入脱盐柱中，并用五毫升离心管收集流出液。用一毫升5%乙酸洗涤柱子两次，每次均收集流出液。

然后使用离心浓缩仪，在5毫巴、30摄氏度条件下蒸发去除乙酸并浓缩样品，持续2小时。将样品溶于0.5毫升甲醇-乙酸溶液中，并在氮气流下干燥。使用玻璃注射器，向含有氢氧化钠和甲醇混合液的小瓶中加入4毫升二甲基亚砜（DMSO）。

涡旋后，以2,000 G离心溶液2分钟。小心倾去上清液，并在不扰动凝胶的情况下去除盐分。确认不再有盐析出后，将凝胶重悬于4 mL无水DMSO中，以制备全甲基化碱悬浮液。

接下来，向干燥的黏蛋白样品中立即加入无水DMSO和完全甲基化碱，随后加入碘甲烷。将完全甲基化反应体系在室温下剧烈振荡孵育30分钟。然后，加入0.5毫升水以终止反应。

当样品变浑浊后，用氮气冲洗至澄清。将样品加载到亲水-疏水平衡96孔萃取板上。施加正压，以每分钟约1毫升的流速推动样品通过固相。

弃去流出液后，用一毫升水洗涤柱孔两次。用一毫升甲醇将糖链从板上洗脱两次。施加压力至甲醇开始从板中流出即可，随后依靠重力流维持所需流速。

使用离心蒸发仪干燥样品，并将其溶解在10微升TA50中。将1微升样品与基质混合后，加样至钢制MALDI靶板上，并使其干燥。进行数据分析时，在GlycoWorkbench中加载质谱导出的ASCII文件。

完成基线校正后，计算峰质心，在弹出窗口中选择合适的质荷比范围、最低信噪比和最低质谱峰强度。然后使用Glyco-Peakfinder工具鉴定与峰列表匹配的结构组成。选择perMe作为衍生化方式，redEnd作为还原端，并设置预期残基数的最小值和最大值。

对于黏蛋白，选择己糖（Hexose）、N-乙酰氨基己糖（N-Acetyl-Hexosamine）、脱氧己糖（Deoxy-Hexose）和N-乙酰神经氨酸（N-Acetylneuraminic Acid）。对于硫酸化糖链，使用“其他残基”（Other residue）选项，并将质量设为87.9。对于MALDI-TOF数据，将钠离子的最大数目和电荷数均设为1，并将质量精度设为0.5道尔顿（Daltons）。

按住 Control 键并单击选择所有正确的注释。右键单击所选注释，然后选择“添加到已注释峰列表”。如需生成报告以比较多个已注释光谱，请依次转到“工具”、“报告”，然后创建一个用于比较不同谱图的报告。

将报告打印为 PDF 以保存。对于裂解质谱分析，将质谱数据加载到 GlycoWorkbench 中，并按照之前的方法生成峰列表。绘制与注释的聚糖组成相对应的假定聚糖结构。

要为每个结构生成碎片片段，可右键单击并选择“复制碎片至画布”，然后在“碎片”工具下选择“计算碎片”。如需进一步进行碎片分析，请在谱图查看器中单击感兴趣的峰。右键单击并选择“查找所有与峰匹配的结构”，以将所选峰的母离子荷质比与在线数据库进行比对查询。

选择感兴趣的候选结构，右键单击并选择相应选项将其复制到画布窗口中。要计算每种聚糖结构可能产生的碎片，请在画布中选中该结构，然后在“工具”和“碎片”菜单下，选择“计算当前结构的碎片”。

如果已计算多个糖链结构的碎片，请转到“摘要”选项卡下的“碎片”表格视图，以查看比较表格。为每个可能的糖链结构选择与峰列表匹配的碎片。右键单击，然后从下拉菜单中选择“将碎片复制到画布”。

最后，在“工具”选项卡中，依次进入“分析器”（Profiler），然后选择“使用所有结构注释峰”。接着选择“工具”、“报告”以及“生成注释报告”。通过离子交换进行脱盐可更好地回收较大的糖链，这些较大结构占总糖链的31%，而PGC提取物中仅占21%。

在鉴定出的糖链结构中，有一种糖链仅在离子交换脱盐样品中被鉴定到。此外，与使用PGC固相萃取脱盐后获得的谱图相比，通过离子交换脱盐和硼酸去除所获得的质谱图具有更高的信噪比。30分钟和90分钟的全甲基化反应时间可鉴定出33个糖链峰，而5分钟的反应仅能鉴定出31个峰。