裂殖酵母Schizosaccharomyces pombe中线粒体呼吸链蛋白的表达及复合物组装分析

我们的研究范围是线粒体蛋白质翻译，旨在阐明影响线粒体呼吸链复合物翻译及其组装的分子机制。我们的研究发现，shy1 通过参与复合物 IV 的组装，在维持线粒体正常功能的稳定性中发挥重要作用。本实验室将进一步探究 M=甲氨蝶呤输注的作用机制。

[旁白] 首先，测量裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）细胞沉淀的湿重。将细胞重悬于8毫升S缓冲液中。加入二硫苏糖醇（Dithiothreitol），使其终浓度为10毫摩尔，再加入苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride）至终浓度为1毫摩尔，确保两种试剂均为新鲜配制。向细胞悬液中加入溶壁酶，以消化裂殖酵母的细胞壁。在30°C下，将试管置于摇床上旋转孵育，时间依据所用溶壁酶的推荐条件而定。使用显微镜观察原生质球（Spheroplasts）的形成。随后，在4°C下以1,000 G离心10分钟，沉淀原生质球。将沉淀重悬于8毫升冰浴S缓冲液中。经过两次洗涤后，将原生质球重悬于8毫升含蛋白酶抑制剂的冰浴匀浆缓冲液中。将混合液转移至预冷的玻璃Dounce匀浆器中，该匀浆器包含研杵和试管。使用紧密贴合的研杵上下移动约15次，对细胞进行机械匀浆。然后在显微镜下检查原生质球，确认细胞膜是否破裂。将匀浆后的悬液转移至离心管中。在4°C下以1,000 G离心5分钟，沉淀未破裂的细胞和碎片。将上清液转移后，在4°C下以3,000 G离心5分钟，沉淀细胞核。将上清液转移至新的离心管中。在4°C下以12,000 G离心15分钟，沉淀线粒体及其他细胞器。弃去上清液后，将沉淀重悬于1毫升冰浴山梨醇-EDTA-MOPS缓冲液中。随后在4°C下再次以12,000 G离心15分钟，以洗涤线粒体。将最终沉淀重悬于1毫升冰浴山梨醇-EDTA-MOPS缓冲液中。将纯化的线粒体分装至储存管中，用于后续实验。向40微升线粒体总蛋白中加入SDS-PAGE上样缓冲液。在指定时间和适当温度下孵育，使蛋白质变性。在进行免疫印迹前，将约20微克或4微升线粒体蛋白上样至12% SDS-PAGE凝胶中。为准备BN-PAGE样品，首先通过离心从之前的分装样品中沉淀线粒体。将线粒体重悬于200微升3×BN-PAGE凝胶缓冲液中。接着，用移液器加入2微升100×苯甲基磺酰氟和1微升1摩尔氯化镁。在4°C下再次以12,000 G离心15分钟。将线粒体沉淀重悬于160微升5%（w/v）Digitonin中。在冰上孵育30分钟，每10分钟轻轻混匀一次。在4°C下以20,000 G离心5分钟。将上清液转移至新管中。向Digitonin处理的样品中加入80微升3×BN-PAGE上样缓冲液，或向DDM处理的样品中加入32微升。组装预制的3–12%梯度天然Bis-Tris凝胶。将处理后的蛋白样品与高分子量蛋白标记物一同上样，进行天然聚丙烯酰胺凝胶电泳。使用含0.02%考马斯亮蓝G250（Kumasi G250）的阴极缓冲液，在80伏恒定电压和6毫安电流下电泳30分钟。更换不含考马斯亮蓝的阴极缓冲液，继续以10毫安电流电泳3小时，直至染料前沿到达凝胶底部。切下含有蛋白标记物的凝胶条带。用考马斯亮蓝R250（Kumasi R250）缓冲液染色15分钟，随后脱色至条带可见。将凝胶其余部分浸入BN-PAGE转膜缓冲液中平衡30分钟。用甲醇冲洗0.45微米PVDF印迹膜，并在转膜缓冲液中平衡10分钟。使用300毫安恒定电流，将蛋白从凝胶转移至PVDF膜上，持续2小时。用甲醇冲洗PVDF膜以去除考马斯染料。随后在25°C下，将膜在含5%脱脂奶粉的TBS封闭缓冲液中孵育1小时。将PVDF膜与针对裂殖酵母线粒体呼吸链复合物的特异性一抗孵育。在4°C下过夜孵育后，使用TBST缓冲液洗涤膜。然后在25°C下，将膜与二抗（1:10,000稀释）孵育1小时。用TBST缓冲液洗涤膜后，曝光并扫描PVDF膜，以观察免疫印迹结果。shy1基因的缺失导致线粒体DNA编码的呼吸链蛋白Cob1、Cox1、Cox2、Cox3和Atp6的稳态水平显著降低。蓝色天然PAGE分析显示，在Δshy1细胞中，Digitonin可溶性的呼吸链超复合物3242和324的丰度减少，而超复合物32.=和55N的水平未受影响。在Δshy1菌株中，DDM可溶性的二聚体复合物3的水平保持不变。