裂殖酵母粟酒裂殖酵母中线粒体呼吸链蛋白的表达和复合物组装分析

我们的研究范围是线粒体蛋白翻译，我们试图阐明影响线粒体呼吸链复合物翻译和组装的机制。我们的研究发现，shy1 通过参与复合四种输液的组装，在线粒体正常功能的可持续性中发挥作用。我们的实验室将研究 M=甲氨蝶呤输注的机制。

[旁白]首先，测量池麦裂殖酵母细胞沉淀的湿重。将细胞重新悬浮在八毫升 S 缓冲液中。加入终浓度为 10 毫摩尔的二硫苏糖醇，加入苯甲基磺酰氟至 1 毫摩尔，确保两种试剂都是新鲜制备的。将裂解酶添加到细胞悬液中以消化裂殖酵母的细胞壁。在摇床上以 30 摄氏度旋转试管，持续特定裂解酶推荐的持续时间。使用显微镜观察球体的形成。然后将样品在 1,000 G 下在 4 摄氏度下离心 10 分钟，以沉淀球体。将沉淀重新悬浮在八毫升冰冷的S缓冲液中。两次洗涤后，将球状体重新悬浮在含有蛋白酶抑制剂的8毫升冰冷均质缓冲液中。将混合物转移到装有杵和试管的预冷玻璃均质器中。通过用紧密贴合的杵上下进行大约 15 次冲动，机械地均质细胞。然后在显微镜下检查球体以检查膜是否破裂。现在将均质悬浮液转移到离心管中。在 4 摄氏度下以 1,000 G 离心 5 分钟，以沉淀未破碎的细胞和碎片。将所得上清液在 4 摄氏度下以 3,000 G 离心 5 分钟以沉淀细胞核。然后将上清液转移到新鲜的离心管中。在4摄氏度下以12,000G离心15分钟，沉淀线粒体和其他细胞器，倒出上清液后将沉淀重新悬浮在一毫升冰冷的山梨糖醇EDTA拖把缓冲液中。然后在4摄氏度下再次以12,000G离心15分钟以洗涤线粒体。将最终沉淀重新悬浮在一毫升冰冷的山梨糖醇EDTA拖把缓冲液中。然后将纯化的线粒体等分到储存管中以备将来实验。在 SDS 页面加载缓冲液中 40 微升线粒体总蛋白。通过在适当的温度下孵育混合物指定时间来使蛋白质变性。在免疫印迹之前，将大约 20 微克或 4 微升线粒体蛋白加载到 12% SDS 页面凝胶中。为了制备用于BN页的样品，首先通过离心从以前的等分试样中沉淀线粒体。将线粒体重新悬浮在 200 微升 3 个 XBN 页凝胶缓冲液中。接下来，移液两微升 100 X 苯甲基磺酰氟和一微升一摩尔氯化镁。在4摄氏度下以12,000 G再次离心15分钟。将线粒体沉淀重新悬浮在 160 微升 5% 体积体积的 digitorum 中。在冰上孵育 30 分钟，每 10 分钟轻轻混合一次。在4摄氏度下以20,000 G离心悬浮液五分钟。然后将上清液转移到新鲜的管中。向处理过的 digitorum 样品中加入 80 微升 3 页 XBN 样品缓冲液。或 32 微升到DDM处理的样品中。现在以 3% 到 12% 的梯度组装预制天然 Bis-Tris 凝胶。将处理过的蛋白质样品与高分子量蛋白质标记物一起加载，用于天然聚丙烯酰胺凝胶电泳。使用含有0.02%Kumasi G250的阴极缓冲液，以80伏的恒定电压和6毫安的电流运行凝胶30分钟。用不含 Kumasi 的阴极缓冲液替换缓冲液，并继续以 10 毫安运行三个小时，直到染料前沿到达凝胶底部。切割含有蛋白质标记物的凝胶泳道。用 Kumasi R250 缓冲液将标记物染色 15 分钟。然后去污，直到条带变得可见。将凝胶的剩余部分浸入BN页面转印缓冲液中30分钟以平衡。用甲醇冲洗 0.45 微米 PVDF 印迹膜，并在转印缓冲液中平衡 10 分钟。 使用 300 毫安的恒定电流将蛋白质从凝胶转移到 PVDF 膜上两小时。用甲醇冲洗PVDF膜以去除库马西染料。然后将膜在含有5%脱脂牛奶的TBS封闭缓冲液中在25摄氏度下孵育一小时。将PVDF膜与针对裂殖酵母线粒体呼吸链复合物的指定一抗一起孵育。在四摄氏度下孵育过夜后，使用TBST缓冲液洗涤膜。然后将膜在二抗中以 1 至 10,000 的稀释度在 25 摄氏度下孵育一小时。用 TBST 缓冲液洗涤膜后，曝光并扫描 PVDF 膜以可视化免疫印迹结果。shy1基因的缺失导致线粒体DNA编码的呼吸链蛋白Cob1、Cox1、Cox2、Cox3和Atp6的稳态水平显着降低。蓝色天然页面分析显示，Delta shy1细胞中DG可溶性呼吸链超级复合物3242和324的丰度降低。而超级复合物32.=和55N的水平不受影响。Delta shy1菌株中DDM可溶直径复合物3水平不变。