用于定量电穿孔阈值的高通量三维组织模型

我们的研究重点是使用电穿孔，特别是双极微秒脉冲来治疗癌症。目前我们正在研究软组织消融，但我们也将使用这些脉冲进入体内转染。我们的协议实际上使您能够更有效地查看不可逆和可逆的电穿孔阈值。

它也可能比基于立方体的系统好一点，因为它允许我们以 3D 而不是 2D 环境进行查看。3D 环境将与我们在组织中看到的环境更加相似。未来，我们将尝试在体内翻译我们在该模型中看到的内容，而该模型的真正作用是为我们在尝试提供 DNA 疫苗、化疗以及 CRISPR-Cas9 系统等产品时将要做出的参数选择提供信息。

首先，将细胞悬液和所需试剂放入生物安全柜中。将制备的细胞悬液与1型牛胶原蛋白溶液以1：1的比例充分混合。将混合物放在冰上或冷珠浴中，以防止过早聚合。

然后，移液 500 微升组合溶液以涂覆 12 孔板的每个孔的底部。轻轻旋转板以确保凝胶接触每个孔的壁。将凝胶与5%二氧化碳一起在37摄氏度的加湿培养箱中孵育6小时或直到凝胶变硬。

接下来，倾斜孔板并轻轻地向每个孔中加入 500 微升培养基，让其沿着孔板壁滑下。从两个 1.64 毫米 304 不锈钢钝头注射器针头上拆下塑料诱饵连接。将一根针放在一边作为针电极。

对于另一根针，将一端的最后 5 毫米压平。然后，切割一段直径为 19 毫米的 316 不锈钢管，其长度足以与孔板底部齐平，以形成环形电极。使用 CAD 软件设计电极支架以安装电极组件。

将环形电极和针状电极安装到电极支架中以组装电极，并将针头压平端压入支架中以固定环形电极。在生物安全柜中，倾斜准备好的板并从每个孔中吸出 400 微升培养基。向抽吸孔中加入每微升绿色荧光蛋白质粒溶液 20 微升 5 微克。

轻轻旋转板，以确保溶液均匀分布在凝胶表面。将凝胶在设置为 37 摄氏度的加湿培养箱中与 5% 二氧化碳孵育 10 分钟。接下来，将光纤温度探头插入针式电极并开始记录温度。

将电穿孔器的正极引线连接到针电极，将负极引线连接到针头，固定环形电极。现在打开热板并加热凝胶以保持 37 摄氏度的温度。然后将组装好的环和带有温度探头的针电极插入孔中，并确保凝胶已达到 37 摄氏度的温度。

激活电穿孔器以进行治疗。然后将 100 微升培养基添加到任何看起来干燥的凝胶中，并继续电作任何未经处理的凝胶。完成所有处理后，将凝胶在37摄氏度的加湿培养箱中与5%二氧化碳孵育10分钟。

孵育后，沿着板壁轻轻地向每个孔中加入 500 微升培养基。将凝胶在加湿培养箱中再次孵育24小时。倾斜板并从每个孔中吸出培养基。

然后，沿着板壁轻轻地向每个孔中加入 500 微升 PBS。将凝胶在加湿的培养箱中以 37 摄氏度与 5% 二氧化碳孵育 5 分钟。然后，从每个孔中吸出PBS。

轻轻地向每个孔中加入 500 微升 PBS，让它从板壁上滑落。轻轻旋转板，然后倾斜它并从每个孔中吸出PBS。现在，向每个孔中加入 100 微升新鲜 PBS，以保持凝胶水合以进行成像。

然后，使用标准荧光显微镜技术对板进行成像。成像后，向板的每个孔中加入500微升培养基并孵育24小时。对每个指定时间点重复完整的成像和恢复工作流程。

创建计算模型后，使用显微镜软件沿垂直轴和水平轴测量环形区域的外边缘和内边缘的直径。分别取外径和内径的平均值，除以 2 即可计算出相应的半径。最后，使用之前创建的查找表，推导出测量半径处的电场强度。

转染区域的外半径用于量化可逆电穿孔或RE阈值，方法是将其与计算模型中的电场强度相关联。而内半径用于确定不可逆电穿孔或 IRE 阈值。所有三种双极微秒脉冲方案都产生了具有清晰可见的 RE 和 IRE 边界的环形转染区域。

在测试的波形中，2-1-1突发平衡波形产生的IRE阈值最高，而2-1-1非平衡波形的IRE阈值最低。使用 420 伏的标准单极电穿孔方案产生了 RE 阈值为 642 伏/厘米的圆形转染区域，但未能产生细胞死亡，从而阻止了 IRE 阈值的确定。由于凝胶降解，随着时间的推移，组织变形导致转染区域失去圆形，从而难以进行准确的RE和IRE定量。

环形电极和针式电极与孔底的未对准也会产生不对称的非圆形转染模式，使阈值测量复杂化。