Name: 用于组装和使用微型生物反应器阵列 （MBRA） 的更新协议 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-09-05T14:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: 学习使用微型生物反应器阵列（MBRA）进行高通量肠道微生物组培养实验。该方法结合连续流动培养系统与下一代测序技术，帮助研究人员规模化研究微生物群落动态及其在病原体定植抗性中的生态机制。

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本工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）T32传染病分子基础博士前培训项目（NIH T32DK007664）以及NIH U19AI157981“黏膜表面微生物组发现与对抗抗生素耐药性的机制研究”项目的资助。
作者感谢 Hayden Curnyn 在本系统所用生物反应器支架和管路支架的设计与制造方面所做的贡献。
图2和图3部分使用&#160;https://BioRender.com 制作

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</ol>

作者声明无利益冲突

本方案描述了用于细菌群落高通量培养的微型生物反应器阵列（Minibioreactor Array, MBRA）的完整组装及基本操作流程，并对先前发表的方法进行了多项关键性优化。MBRA 系统仍是一种多功能且成本低廉的工具，可支持研究人员并行培养复杂的微生物生态系统，并实现大量实验重复。在本更新版本中，我们引入了若干改进措施，以提高实验可重复性、简化操作流程并降低污染风险。这些改进包括采用化学蚀刻的聚四氟乙烯（PTFE）吸管（图2）以防止其脱落，在培养基管线上增设进样吸管（图2）以减少生物膜形成，使用标准化长度的管路并配合3D打印的管路固定架（补充文件3），使装置更紧凑、布局更有序，以及优化了重复使用方案，避免了实验间完全拆卸的需要。上述优化措施是在本实验室长期、广泛地将MBRA系统应用于多种不同实验场景过程中逐步发展完善的。通过对关键组装步骤和实际操作改进的详细阐述，本文强调了MBRA&#160;作为微生物组研究中持续演进的模型系统的实用价值。
MBRA 系统的成功运行在很大程度上依赖于组件的精确组装和灭菌，以确保无污染操作。关键步骤包括正确安装 Q 系列瓶盖、管路和连接件，这些部件支持模块化组装，并实现培养基输入和废液收集。确保培养基瓶、废液储液罐与生物反应器腔室之间形成严密密封，对于防止泄漏并维持无菌环境至关重要。另一个关键步骤是在实验前验证蠕动泵的流速，因为流速不一致可能导致培养基输送不均，进而影响微生物的生长动态。大多数使用盒式结构的多通道蠕动泵都配有压扁度调节机制，应利用该机制对每个通道的流速进行精细调节。即使经过正确校准，E 型实验管路仍是变异性的主要来源。为减轻这一问题，在初始填充阶段以及实验开始时，必须目视监测进入每个生物反应器腔室的培养基液滴的频率和大小。这些目视检查有助于及早发现可能影响实验可重复性的流速异常。表 2 提供了在 MBRA 组装和使用过程中常见问题的故障排除策略。这些故障排除步骤可确保实验间的可重复性，并防止长期培养过程中出现中断。
尽管MBRA系统具有优势，但在设计实验时也必须考虑其某些局限性。与更先进的系统相比，MBRA缺乏主动监测功能，例如实时光密度（OD）测量、pH控制和温度调节。这种主动测量能力的缺失限制了系统对微生物生长和代谢活性动态变化的实时监测能力。此外，虽然该系统支持在培养腔内进行厌氧培养，但未配备集成的气体控制系统，这可能限制其在需要精确微需氧或富含CO2环境中的应用。对于需要此类控制的研究，采用内置气体调控功能的其他系统可能更为合适。
MBRA 系统相较于现有的生物反应器模型具有多项关键优势，包括高通量、可扩展性和成本效益，同时仍能维持在连续流动条件下培养复杂的细菌群落，以模拟人类胃肠道等动态环境6,8,10。其紧凑且模块化的设计支持多个生物反应器同时运行，非常适合高通量研究，例如筛选粪便来源的微生物群落对病原体入侵的抗性9。该模块化设计提供了广泛的实验灵活性：每个反应条可通过一个培养基瓶供液（如本方案所示），也可由最多六个不同的培养基来源分别供给，每个生物反应器腔室对应一种。工作体积由插入每个腔室废液口的细长聚四氟乙烯（PTFE）废液管长度决定，该长度设定了液面高度；在本方案中，25 mm 的废液管维持 15&#8239;mL 的工作体积，但通过裁剪或延长废液管，可实现 1–20&#8239;mL 范围内的不同体积。此外，较短的进液管插入培养基入口，以引导流入液体朝向腔室底部，防止培养基沿腔壁流下，从而减少液面以上区域的生物膜形成。泵的转速或泵管直径也可调节，以改变系统的更新速率。迄今为止，MBRA 系统已广泛用于研究微生物群落在多种因素影响下的功能与组成变化，包括抗生素10、癌症药物14以及多种膳食成分12,15,16,17。其结构简单且模块化的设计使其易于根据各种实验需求进行改造。例如，MBRA 已被改进用于在类似恒化器的条件下研究生物膜18，展示了其在浮游培养之外的微生物生态学研究中的广泛适用性。
MBRA 系统的未来迭代版本可通过进一步的工程改进，提升其功能、精确性和通量潜力。其中一项改进是在每个生物反应器腔室中增加额外的端口。这些端口可用于主动监测环境参数，如 pH、温度、气体或光密度，从而通过实现实时反馈与监测，解决该模型目前最主要的局限之一。优化腔室或端口的几何结构，可促进更彻底且便于操作的清洗，减少残留物积聚和变色，提高长期重复使用的可行性。集成更多带有可编程定时器的蠕动泵，可实现脉冲式或昼夜节律性的培养基输入，更真实地模拟宿主相关环境，例如人体肠道中的进食周期。最后，采用替代材料（如耐化学腐蚀、可高压灭菌的聚合物）进行 3D 打印，可能显著增强系统的耐用性，并提高与更广泛试剂的兼容性。这些改进措施共同作用，有望大幅拓展 MBRA 平台的实验范围和模拟保真度。
综上所述，MBRA 提供了一个功能强大、高通量的平台，可在受控条件下培养并研究微生物群落。尽管其在实时监测和 pH 控制方面存在局限性，但凭借其灵活性、可扩展性和成本效益，MBRA 已成为多种微生物学研究中不可或缺的工具，尤其适用于需要高重复性和高实验通量的研究。重要的是，该系统的模块化设计和制造方法使其具有内在的适应性；研究人员已经并可继续根据多种实验目标对 MBRA 进行定制。这种适应性确保了 MBRA 能够随着新兴科学问题和技术的发展而持续演进，保持其作为微生物组研究多功能平台的相关性与实用性。

人类微生物组是一个复杂的微生物生态系统，在多种生理过程中发挥着关键作用，并深刻影响人类健康。人类微生物组遍布全身多个解剖部位，每个部位都含有动态的微生物群落，它们以我们尚未完全理解的方式进行活跃的相互作用1。要拓展我们对微生物群落在健康与疾病中作用的认识，关键在于理解这些环境中发生的微生物相互作用1。为了有效研究并针对治疗目的调控这些复杂的系统，必须采用还原论的方法。利用简化的模型系统来探究单个微生物之间的相互作用，有助于更深入地理解微生物组的整体复杂性2。
可用于培养人源微生物群落的模型系统种类繁多。这些系统推动了我们对与人类相关的微生物群落的理解，其形式从单阶段批量培养到更为复杂的多阶段连续流动系统不等。例如，人类肠道微生物生态系统模拟器3双容器单阶段连续培养器&#160;系统4 肠道微生物群环境控制系统5 复制特定解剖部位的生理条件并提供密切 体外 微生物环境的近似模拟。然而，由于这些系统成本高昂、运行和维护需要高水平的技术专长，且通量有限，微生物学家对其采用仍受到限制。
为应对这些挑战，我们开发了微型生物反应器阵列（Minibioreactor Array, MBRA）系统——一种连续流动、单阶段培养系统，旨在促进来自不同来源的微生物群落在受控环境中稳定生长6,7,8。MBRA系统与其他肠道模型相比，具有组装和操作简便的优势，同时具备高通量能力，可实现多个微生物群落的同步培养，显著提升实验效率。此外，该系统结构简单紧凑，可在厌氧和微氧环境中运行，从而促进来自厌氧和低氧部位（如胃肠道和阴道）细菌的生长。该系统的多功能性已被用于筛选抗&#160;Clostridioides difficile的胃肠道微生物群落9，以及评估抗生素10,11和饮食底物12对微生物群落的影响。
MBRA 通过 3D 打印或增材制造技术制备，在材料选择上优先考虑透明度和防水性（聚合物信息见材料表）。每个阵列包含六个独立腔室，均配备用于培养基输入、废液排出和样品采集的端口。新鲜培养基通过两个蠕动泵精确控制流速，持续输入系统，同时并发地排出废液。系统内的内容物通过搅拌子和一个 60 位搅拌板持续搅动，以促进培养体系的均一性。本方案针对每个腔室 15&#8239;mL 的工作体积进行了优化，但每个生物反应器可根据实验需求容纳 1–20&#8239;mL 的体积范围。蠕动泵及其泵管可支持 0.016 至 2.9&#8239;mL/min 的流速范围，分别对应约 15.63 至 0.09 h 的换液速率。尽管该系统适用于多种培养基配方以及膳食或营养添加剂，但仍需考虑一些实际因素：高黏度培养基可能需要重新校准流速，未溶解颗粒或不溶性成分的存在可能导致泵管或狭窄连接处堵塞，尤其在较低流速下更易发生。系统的模块化设计允许通过调整培养基选择、样品采集方式、流速和工作体积，快速便捷地定制实验方案。结合四台 24 通道蠕动泵和两台 60 位搅拌板，该系统可在单个厌氧舱内同时运行 48 个独立腔室，支持高通量厌氧筛选。
本方案是本实验室先前发表的MBRA组装与操作方法的可视化指南及更新版本4。我们已引入多项关键改进，以提高实验的可重复性、简化操作流程并最大限度减少污染。首先，现对聚四氟乙烯（PTFE）吸管进行化学蚀刻处理，防止其脱落并掉入生物反应器腔室中。其次，在进液管路中新增一根培养基导向吸管，使培养基直接流入腔室底部，避免液体沿腔室壁滴落——这曾是生物膜形成的一个已知来源。第三，C-flex管路的长度已实现标准化并缩短，同时设计了3D打印的管路固定架，使整体装置更紧凑、更有序。最后，生物反应器在每次使用之间不再完全拆解，显著降低了重复实验所需的时间和材料成本。这些及其他逐步优化措施，反映了本实验室在多个项目中长期广泛使用该系统后所进行的迭代式改进。

<table><tbody><tr><td>&amp;nbsp;V-Tap 指南，标准尺寸 0-80 至 5/8&quot;</td><td>Big Gator Tools</td><td>STD500NP&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &amp;mu;m 注射器滤器</td><td>Fisher</td><td>SLGVR33RS</td><td></td></tr><tr><td>2mag MIXdrive 60 搅拌驱动器（仅驱动单元）</td><td>2MAG</td><td>MF 41060</td><td></td></tr><tr><td>Air-tite 皮下注射针头，22G ×3&quot;</td><td>VWR</td><td>89219-274</td><td></td></tr><tr><td>BD 1 mL Slip Tip 无菌注射器 无菌</td><td>Fisher</td><td>14-823-434</td><td></td></tr><tr><td>生物反应器</td><td>Proto-Labs</td><td>NA</td><td>使用DMS Somos Watershed塑料3D打印而成。模板见补充文件1</td></tr><tr><td>生物反应器支架</td><td>Proto-Labs</td><td>NA</td><td>使用PA 12黑色材料3D打印而成。模板见补充文件2。</td></tr><tr><td>Diba Omnifit Q系列溶剂瓶盖，GL38/38-430（玻璃），2个UNF(F)接口无阀门，蓝色</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-21942-86</td><td></td></tr><tr><td>Diba Omnifit 管路，PTFE 材质，1/8 英寸&quot; (3.2 mm) 外径 × 1.5 mm 内径</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-21942-76</td><td></td></tr><tr><td>Dibafit 适配器，1/4&quot;-28 UNF（M）平底转3.2 mm内径，聚醚醚酮（PEEK）</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-21941-49</td><td></td></tr><tr><td>IRWIN 12001ZR 扳手 #0-1/4&quot; T型手柄</td><td>亚马逊</td><td>B00004YOB0</td><td></td></tr><tr><td>Irwin Hanson 高碳钢 SAE 分数丝锥 1/4 英寸 1 支</td><td>佐罗</td><td>G7695682</td><td></td></tr><tr><td>Loctite 重型环氧树脂快速固化胶 8液盎司瓶装</td><td>亚马逊</td><td>B0044F59N0</td><td></td></tr><tr><td>雄性至雄性鲁尔锁接头</td><td>达尔文微流控</td><td>DM-MM-LUER-PP&amp;nbsp;</td><td>替代方案：Strategic Applications Inc 两通鲁尔接头（公对公）- 10个/包 - Fisher - NC9876577</td></tr><tr><td>Masterflex 接头配件，鲁尔接头转鲁尔接头，尼龙材质，Avantor</td><td>VWR</td><td>MFLX45502-56</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex 接头，尼龙材质，直型，雌性鲁尔接头转软管接头，1/16&quot; ID</td><td>VWR</td><td>MFLX45502-00</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex 接头，尼龙材质，直型，雌性鲁尔接头转软管接头，3/32&quot; ID</td><td>VWR</td><td>MFLX45502-02</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex 接头，尼龙材质，直型，雌性鲁尔接头转软管接头，1/8&quot;</td><td>VWR</td><td>MFLX45502-04</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex 接头，尼龙材质，直型，公型鲁尔锁扣转软管接头，1/8</td><td>VWR</td><td>MFLX45505-04</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex 接头，尼龙材质，直型，公鲁尔接头 × 1/4-28 UNF</td><td>VWR</td><td>MFLX45505-82</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex 接头，聚丙烯，弯头，雌性鲁尔接雌性鲁尔适配器</td><td>VWR</td><td>MFLX45508-26</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex Ismatec 泵管，2-通道，Tygon S3 E-Lab，内径 0.89 mm</td><td>VWR</td><td>MFLX96460-26</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex Ismatec 泵管，2-滚轮，Tygon S3 E-Lab，内径 1.14 mm</td><td>VWR</td><td>MFLX96460-30</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex&amp;reg; 转移管，C-Flex材质，不透明白色，1/8英寸&quot; ID x 1/4&quot; OD；25 英尺</td><td>VWR</td><td>MFLX06424-67</td><td></td></tr><tr><td>莫尔&amp;rsquo;用于管路的止血夹&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>470201-374</td><td></td></tr><tr><td>氯丁橡胶护舷垫圈 &amp;frac12;&amp;rdquo; OD x &amp;frac14;&amp;rdquo; ID x 1/16&amp;rdquo; 厚度&amp;nbsp;</td><td>亚马逊</td><td>B01A29F1R0</td><td></td></tr><tr><td>精密密封橡胶隔垫</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z553905</td><td></td></tr><tr><td>Spinbar 微型搅拌子</td><td>VWR</td><td>58948-375</td><td></td></tr><tr><td>四重蚀刻</td><td>R.S. Hughest 公司</td><td>TE-500</td><td></td></tr><tr><td>管路固定架</td><td>Proto-Labs</td><td>NA</td><td>使用PA 12黑色材料3D打印而成。模板见补充文件3。</td></tr><tr><td>Watson-Marlow 205S 多通道盒式泵</td><td>Watson-Marlow</td><td>020.3724.00A</td><td>已停用，替代产品：Ismatec IPC 数字式蠕动泵 MFLX7800142 - FISHER - 113-200-014 或 Masterflex Ismatec IPC 蠕动泵，转速范围 0.1 至 11.25 rpm，24 通道，115/230 VAC，Avantor，VWR，MFLX78006-48-CH</td></tr></tbody></table>

微型生物反应器阵列（mbra）组装与使用的更新方案

Updated Protocol for the Assembly and Use of the Minibioreactor Array (MBRA)

人类微生物组包含多样且动态变化的微生物群落，在宿主健康中发挥着至关重要的作用。深入了解这些群落及其对环境因素的响应，对于推动基于微生物组的治疗手段至关重要。传统的体外（in vitro）培养人源微生物群落模型通常缺乏可扩展性，且需要高度专业的技术操作，限制了其可及性和通量。为克服这些局限，我们开发了微型生物反应器阵列（Minibioreactor Array, MBRA）系统——一种模块化、单阶段、连续流式的高通量微生物群落培养平台。该系统可并行培养多达48个不同的微生物群落，在维持复杂生态系统稳定生长的同时，支持实验设计的灵活性。本实验方案详细介绍了MBRA的制备、组装、灭菌及操作流程。该系统的模块化设计便于其在厌氧环境中的整合，并可根据多种实验需求进行定制化调整。该系统已被用于研究微生物群落对抗生素、膳食成分及病原体入侵的响应，并可用于筛选抗病原体定植的微生物群落。凭借其良好的可及性、可扩展性和可重复性，MBRA系统为研究微生物相互作用及推动微生物组研究提供了一个强有力的模型平台。

为了促进胃肠道等来源的厌氧菌生长，可在厌氧环境中搭建并运行MBRA系统。为展示直接从人体相关部位培养复杂细菌群落的能力，本实验制备了一个人类粪便样本并在该系统中进行培养。所有操作均在设定为37°C的厌氧环境中进行，菌群在我们的生物反应器培养基BRM37中培养。
通过在厌氧条件下解冻人粪便，然后与磷酸盐缓冲盐水（PBS）混合，制备成终浓度为25%（w/v）的粪便悬液。确认无菌后，将9个生物反应器腔室分别接种3 mL相同的粪便悬液。微生物群落在无培养基输入和废物清除的条件下培养过夜，形成9个独立的分批培养体系，持续16小时。随后启动进料泵，设定流速为1.92 mL/h。连续流动培养四天后，从生物反应器中采集样品，采用16S rRNA基因测序分析微生物群落组成，并在QIIME 2中使用Deblur进行去噪处理，结合SILVA 138 SSU数据库进行分类学注释13。在所有9个重复样本中共检测到65个属，但生物反应器中的群落主要由18个属主导，每个属在任意一个重复样本中的相对丰度均不低于2%（图5）。生物反应器表现出高度可重复性，65个属中有22个在全部9个重复中均被检测到，另有17个属在至少一半的重复中出现。在至少一个反应器中未检出的43个属中，大多数（37个属）为稀有物种，其在生物反应器中的相对丰度均低于2%。综上所述，连续流动的MBRA培养系统能够支持来源于同一样本的复杂且可重复的微生物群落，即使各生物反应器腔室经历了16小时的独立分批培养后仍保持稳定。
<img alt="显示进料和废液管路系统的生物反应器示意图，展示实验流程系统的设置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68788/68788fig1.jpg" data-altupdatedat="1762509930000" data-alt="图1"> 
图1：微型生物反应器阵列（MBRA）。完全组装好的MBRA，包括进料和废液管路系统、生物反应器腔室以及生物反应器条带的标签。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68788/68788fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="实验室装置中培养基和废液管理用的聚四氟乙烯管路制备及吸管组装示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68788/68788fig2.jpg" data-altupdatedat="1762509930000" data-alt="图2"> 
图2：聚四氟乙烯（PTFE）刻蚀指南及MBRA端口布局。（A）用于培养基和废液聚四氟乙烯吸管刻蚀的操作流程图。（B）每个生物反应器腔室均包含一个用于培养基吸管加螺纹公鲁尔接头的端口、一个用于废液吸管加螺纹公鲁尔接头的端口，以及一个用于隔垫加螺纹公鲁尔接头的端口。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68788/68788fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="用于流体动力学研究和系统设计的模块化管道配置示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68788/68788fig3.jpg" data-altupdatedat="1762509930000" data-alt="图3"> 
图3：MBRA进料管路与废液管路系统示意图。 组装（A）进料管路系统和（B）废液管路系统的代表性示意图。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68788/68788fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="废液 containment 装置示意图；图中显示从一级到三级 containment 及连接点。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68788/68788fig4.jpg" data-altupdatedat="1762509930000" data-alt="图 4"> 
图 4：培养基瓶盖与废液分级收集系统。（A）组装好的 Q 系列瓶盖示例，用于将培养基吸入 MBRAs。（B）废液分级收集系统的图像。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68788/68788fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="不同反应器中微生物群落的相对丰度图和多样性箱线图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68788/68788fig5.jpg" data-altupdatedat="1762509930000" data-alt="图 5"> 
图 5：细菌属的相对丰度。（A）堆叠柱状图显示了在任一样本中相对丰度至少达到 2% 的所有属的组成情况。（B）九个生物反应器腔室之间的观测 OTU 数和 Shannon 多样性指数的 α 多样性指标。所有九个生物反应器腔室均接种了由人粪便制备的相同粪便悬液。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68788/68788fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
表1：MBRA组件。完全组装MBRA所需的所有单个部件的图像和描述，以及每个组件所需的数量。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68788/Table1.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
表2：故障排除指南。 运行MBRA过程中可能遇到的常见问题，及其潜在原因和推荐解决方案。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68788/Table2.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
补充文件 1：用于 3D 打印微型生物反应器阵列条的 Stl 文件。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68788/Supplementary%20File%201.stl" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件 2：用于3D打印生物反应器支架的Stl文件，该支架用于将生物反应器固定在搅拌板上。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68788/Supplementary%20File%202.stl" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件 3.：用于 3D 打印管架的 Stl 文件，该管架用于整理从 MBRA 延伸出的 C-flex 废液和进液管路。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68788/Supplementary%20File%203.stl" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

微型生物反应器阵列（MBRA）是一种高通量、可定制的连续流培养系统，能够培养复杂的微生物群落，支持并行实验，用于研究微生物组动态、治疗相互作用以及微生物对环境因素的响应。

微型生物反应器阵列（MBRA）组装与使用的更新方案

人类微生物组由多样且动态变化的微生物群落组成，在宿主健康中发挥着至关重要的作用。理解这些群落及其……

因此，我们的研究聚焦于肠道微生物组，特别是如何通过工程化手段阻止有害病原体的定植。同时，我们也致力于揭示这种定植抵抗背后的生态学规律与作用机制。诸如高通量测序、先进生物信息学、无菌小鼠以及体外肠道模型等技术，正在彻底改变我们研究微生物群落及其在健康与疾病中作用的方式。体外肠道模型面临的主要挑战之一是难以实现高通量运行。我们需要的是能够大规模功能性研究微生物群落的系统。微型生物反应器阵列是一种连续流动培养系统，旨在解决其他系统在通量能力方面的不足。它使我们能够在扩大实验规模的同时，仍然捕捉到复杂且可重复的微生物群落行为。首先，确保迷你生物反应器阵列条带已通过3D打印制备，并包含六个独立的生物反应器腔室。准备好组装所需的所有组件。使用1/4英寸28 NF细牙丝锥和T型手柄丝锥扳手，对每个腔室中的三个1/4英寸接口进行攻丝，以便安装接头。用水清洗腔室后，将一根10毫米×3毫米的磁力搅拌子放入每个腔室中，并加入1毫升蒸馏水。然后在生物反应器的每个端口上方放置一个橡胶垫圈。对于每个腔室，将一根带螺纹的公接头进液管、一根带螺纹的公接头废液管和一根空的带螺纹的公接头分别拧入端口中。现在将六个橡胶隔垫插入3/32英寸母接头刺针上，并将每个隔垫的上部护套向下翻折，覆盖住颈部。将这些连接到每个腔室的指定端口。按所需长度和数量裁剪C型弹性管。在每段管的一端连接一个1/8英寸的雌性卡扣接头，另一端连接一个雄性锁紧接头。然后将1/16英寸的雌性接头宝塔头插入内径为1.14毫米的红色双止位E-lab管两端，以及内径为0.89毫米的橙色双止位E-lab管两端。将准备好的E-lab管连接至C-flex管，并确保六段C-flex管的每一段均通过雌性接头宝塔头分别连接一条红色和一条橙色E-lab管。接下来，根据需要将C-flex管剪成不同的长度。将1/8英寸雌性卡扣接头和雄性卡扣锁紧接头分别连接到一段3英寸和一段12英寸C-flex管的两端。将雄性卡扣锁紧接头连接到其余管段的两端。按照三维示意图组装废液管路分支结构。根据C-flex管的长度，按升序将红色双止动E-lab管的裸露端连接到废液管路树上的终端雄性卡扣锁。然后将3英寸的C-flex管与1/8英寸雌性卡扣接头和雄性卡扣锁连接器连接至废液管路树的顶部。按照三维图示组装进液管路树。根据C-flex管的长度，按升序将橙色双止动E-lab管的暴露端连接到进液管路树的末端雄性接头上，并将12英寸的C-flex管连接到进液管路树的顶部。将进液管路树末端的可变长度C-flex管按从左至右由短到长的升序连接至生物反应器。将废液管路树末端的可变长度C-flex管按从左至右由长到短的降序连接至生物反应器条带，以适应泵的放置。将左侧条带上的所有C-flex进液管捆绑在一起，并用扭结扎带固定。在C-flex管路之间用橙色双止动E-lab管形成一个环，使用 autoclave 胶带固定该环；在生物反应器条带的废液侧，对红色双止动E-lab管重复此操作。用铝箔覆盖进液和废液管路末端的雌性接头，以防止污染。松开每个生物反应器腔室上带有隔垫的雄性螺纹诱饵，以便在高压灭菌过程中让蒸汽逸出。将组件放入高压灭菌筐后，将进料管路和废液管路的分支分别拉伸至盛有MBRA条的容器旁边的其他筐中。为将系统连接至泵，请移除固定废液和进料管路E型实验室管路的高压灭菌胶带，并解开C型柔性管路的捆扎。将 MBRA 置于搅拌板顶部的两个泵之间，使用 3D 打印支架将其固定，并与板上的标记搅拌位置对齐。现在将进样管路 E-lab 管连接到蠕动泵的泵头，并将管路挡块插入泵头插槽中。对位于搅拌器右侧泵上的废液管路E-lab管重复上述操作。然后将蠕动泵泵头卡入泵中。使用3D打印的管路固定架整齐排列C-flex管路。将废液管路分支的末端连接至与废液瓶相连的管路。接着，将进液管入口端的雌性接头连接至培养基瓶盖上12英寸长管的雄性接头。启动两台泵以开始培养基流动，并确保当废液侧位于泵的右侧时，两台泵均设置为顺时针旋转方向。观察每个生物反应器腔室中的液滴大小和滴速。如果发现任何变异或异常，应更换与该腔室相连的橙色双止动E-lab管路，以减少流速差异。待所有腔室充满后，关闭两台泵，并让生物反应器静置24至48小时，以检查是否存在污染，然后再开始实验。将培养基输入切换至含有1升去离子水中10%次氯酸钠溶液的容器，并将两台泵的流速调至最大，以用次氯酸钠溶液置换生物反应器腔室中的内容物。当腔室中的培养基完全被置换后，将MBRA倒置，使液面以上部分浸没在消毒液中消毒5分钟。5分钟后，将系统恢复至正常位置，再等待额外5分钟以完成灭菌。在清除培养基并消毒培养室10分钟后，将次氯酸钠溶液替换为一升去离子水，并冲洗系统直至水流完全通过。然后断开生物反应器E-lab管路与泵的连接，并取出膜生物反应器组件（MBRAs）。从生物反应器上取下已使用的隔膜，并排空各腔室，直至每个腔室仅剩一毫升水。更换隔垫、橙色双止动 E-lab 管，并按照之前演示的方法对完全组装好的条带进行高压灭菌。重复使用三个循环后，执行以下步骤。一份人类粪便样本已在 MBRA 系统中制备并培养。经过四天的连续流动后，所有九个生物反应器中的微生物群落均由18个细菌属主导，每个属在任一重复样本中的相对丰度均至少达到2%。在检测到的65个属中，有22个存在于全部九个生物反应器重复样本中，表明具有高度可重复性。Alpha多样性分析显示，在观测到的操作分类单元数和香农多样性指数方面，重复样本之间的差异极小。

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科研

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生物学

用于组装和使用微型生物反应器阵列 （MBRA） 的更新协议

来源： Hemmerich, J., et al. 利用自动化微型生物反应器技术优化异源蛋白生产的实验方案. J. Vis. Exp.

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微型生物反应器阵列（MBRA）组装与使用的更新方案

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