高效利用基于有机溶剂的提取与沉淀法从大肠杆菌（E. coli）中纯化弹性蛋白样多肽（ELPs）

本研究旨在探讨溶剂萃取沉淀法是否能够快速纯化ELP融合蛋白，同时保留其融合活性功能。近期进展包括采用基于溶剂的快速ELP纯化方法，并改进了内毒素控制，从而实现具有活性的自组装纳米颗粒用于靶向核酸递送。首先，称取一克大肠杆菌（E.coli）细胞沉淀。

加入 4 毫升新配制的裂解缓冲液以重悬细胞沉淀。轻轻涡旋震荡，直至沉淀完全分散并与缓冲液充分混匀。向重悬的细胞中加入约 5 毫克溶菌酶，以促进细胞壁的消化。

然后将离心管置于冰上，孵育一小时。孵育结束后，使用微尖探头超声破碎仪以五秒为间隔对样品进行超声处理。保持样品在冰上，持续超声直至获得均匀且无可见颗粒的裂解液，通常需要五至八分钟。

在20摄氏度下，以10,000 G离心超声裂解液10分钟以澄清样品。然后小心地将含有可溶性组分的上清液与含有不溶性组分的沉淀分离。用移液器吸取10至20微升上清液，并将等质量的沉淀重新悬浮于裂解缓冲液中。

将两种组分与4倍浓度的Laemmli缓冲液混合，使其终浓度为1倍。然后在95摄氏度下加热悬浮液5分钟。如果ELP主要为可溶状态，则使用澄清的上清液进行有机溶剂提取。

进行溶剂萃取时，向风干的沉淀或上清液中加入 4 毫升有机溶剂或溶剂混合物。对于二元溶剂混合物，应使用精确的体积比，例如 1:1 混合时每种溶剂各加 2 毫升。将悬浮液剧烈涡旋振荡 1 分钟，以确保溶剂充分渗透到沉淀中。

现在，将混合物在20摄氏度下孵育5分钟，以促进胞外蛋白的聚集以及ELP在有机相中的溶解。在20摄氏度下以13,000 G离心10分钟，以分离溶解的蛋白质与不溶性碎片。小心收集上清液，避免扰动沉淀物，因为其中含有已溶解的ELP。

准确测量所收集上清液的体积，以准备进行沉淀。接着，向上清液中加入其体积2.33倍的丙酮或乙腈，以实现蛋白质沉淀。将混合物在20°C下孵育5至7分钟。

在20°C条件下，以10,000 G离心样品10分钟。然后弃去上清液，并将沉淀在20°C下通过以下任一方法干燥：在温和的氮气流下吹干10至15分钟，或将未加盖的离心管倒置放在通风橱内的无绒布上干燥1小时。将干燥后的蛋白质沉淀重悬于50 µL PBS中。

然后轻轻吹打混匀，以确保完全溶解。将重悬的蛋白于-20摄氏度保存，用于短期至中期使用。若需通过SDS-PAGE进行验证，首先将纯化的蛋白与4x SDS-PAGE上样缓冲液混合。

短暂涡旋振荡溶液以确保均匀。将样品加入含有ELP和TEEN融合的分支酸变位酶的10% SDS-PAGE凝胶中。以100至120伏电压电泳，直至示踪染料迁移至凝胶底部。

现在，使用InstantBlue Coomassie染色液或合适的替代染色液在20摄氏度下染色两小时。用去离子水冲洗，直至背景清晰。在有机提取前的裂解步骤后，一条位于100千道尔顿的显著ELP和TEEN融合至分支酸变位酶的条带出现。

不同的有机溶剂组合对融合了分支酸变位酶的ELP和TEEN的提取效率和纯度产生了差异。AG和BG的等比例混合溶剂获得了最高的蛋白回收率。与ITC纯化蛋白相比，AG溶剂提取的融合了分支酸变位酶的ELP和TEEN保留了约80%的酶活性，而BG提取物保留了约50%的活性，V40对照组则几乎无活性。

重要发现包括：有机溶剂萃取沉淀法能够快速纯化ELP融合蛋白，同时实现低内毒素水平并保持融合蛋白活性。本方案解决了目前缺乏快速、无去垢剂方法来从大肠杆菌（E. coli）中纯化ELP融合蛋白的问题，无论目标蛋白是否形成包涵体，均可无需多步等温相变循环（ITC）即可完成纯化。该方案提供了一步法快速纯化流程，可直接从大肠杆菌菌体沉淀中进行操作，获得高纯度、低内毒素的ELP融合蛋白，并有效保持融合蛋白的功能。