Larval ringkjertel disseksjon: Isolering av utviklings endokrine organer fra Drosophila

Overview

Denne videoen beskriver Drosophila ringkjertelen, en kompleks endokrine struktur som er viktig for biosyntese og sekresjon av ecdysteroider og andre hormoner. Den omtalte protokollen demonstrerer avhandling, fiksering og immunstaining.

Protocol

Denne protokollen er et utdrag fra Imura et al.,Protokoller for visualisering av steroidogene organer og deres interaktive organer med immunostaining i Fruit Fly Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2017).

MERK: Det overordnede protokolloppsettet vises i figur 1.

1. Disseksjonen av larvalringkjertelen (RG)

MERK: I D. melanogaster, som tilhører cyclorrhaphous Diptera, er PG innenfor et kompositt endokrine organ kalt ringkjertelen (RG, figur 2D). Siden det er umulig at PG er kirurgisk adskilt fra andre typer celler (diskutert senere), er et praktisk mål å isolere en intakt, uskadet RG ved disseksjon.

1. Forberedelse av larver på de aktuelle utviklingsstadiene
   MERK: For å synkronisere utviklingsstadiene av D. melanogaster larver, er det nødvendig å samle egg innen et smalt tidsvindu og samle larver til passende tider.
   1. Samle egg i 2 timer på en grape-juice agar plate ved 25 °C.
   2. Samle nyutviklede 1^m instar larver under et dissekerende mikroskop med tang og overfør dem til et lite hetteglass som inneholder moset standard gjær / maismel fly mat.
      MERK: Larvens alder er representert av "timer etter egglegging (hAEL)", "timer etter luke (hAH)", eller "timer etter L3 ecdysis (hAL3E)".
   3. På riktig tidspunkt, samle de iscenesatte larver med en engangs plastsløyfe for å unngå uønsket skade. For å minimere en forskjell i utviklingsprogresjon av 3^rd instar larver, samle den^andre instar larver på 70 hAEL (48 hAH) og la dem smelte i 2 h intervaller. Samle deretter 3^rd instar larver innen 2 timer etter L3 ecdysis; denne prosedyren gir 0-2 hAL3E larver.
   4. Overfør de iscenesatte larver til en tallerken fylt med fosfatbufret saltvann (PBS).
   5. Skyll larvene med PBS for å fjerne gjenværende mat fra kroppen.
2. Grov disseksjon av larver under et dissekerende mikroskop
   1. Hold munnkroken til en larve med tang. Kutt larvekroppen i den fremre en tredjedel av kroppslengden ved hjelp av mikrosaks.
   2. Hold den kuttede enden av den fremre larvekroppen med ett par tang. Bruk det andre paret tang, skyv forsiktig spissen av hodet mot innsiden av kroppen; denne prosedyren vender larvekroppen ut og inn.
      MERK: Dette trinnet kan hoppes over for disseksjon av 1^m instar larver.
   3. Gjenta trinn 1.2.1-1.2.2 med ekstra larver i 5-10 min.
      MERK: Antall larver bør være lik eller mindre enn 20 for å spare tid til disseksjon.
3. Fiksering og farging av vev med immunhiistokjemi
   1. Sett den fremre en tredjedel av larvelegemene (trinn 1.2.2) i et 1,5 ml mikrorør fylt med 500 μL fikseringsløsningen (4% paraformaldehyd i PBS). Løs mindre enn 20 prøver samtidig, ellers kan PBS festet til de faste prøvene føre til en ugunstig fortynning av fikseringsmiddelet. For filet disseksjon, fjern en dråpe PBS og legg deretter til en dråpe fikseringsløsning.
      MERK: For løsning kan enten 3,7% formaldehyd eller 4% paraformaldehyd brukes.
   2. Inkuber dissekert vev i festeløsningen i 30 min ved romtemperatur (RT) eller alternativt i 2 timer ved 4 °C.
   3. Bytt ut festeløsningen med 500 μL PBS og skyll prøvene raskt 3 ganger. Vask prøvene med 500 μL 0,3% PBT (PBS + 0,3% octylfenol ethoxylate) i 15 min på en rocker på RT. For filet disseksjon, fjern insektpinnene og overfør prøvene til et 1,5 ml mikrorør.
      MERK: For å øke permeabiliteten av antistoffer i vev, behandles prøvene med 500 μL 2,0% PBT i 1-2 timer på en rocker ved RT.
   4. Erstatt PBT med 500 μL blokkeringsløsning (2% bovint serumalbumin i PBT). Inkuber prøvene i 1,5 timer på en rocker på RT.
   5. Bytt ut blokkeringsløsningen med 50 μL den primære antistoffløsningen, det vil si antistoffer fortynnet i blokkeringsløsningen.
   6. Inkuber prøvene over natten på en rocker ved 4 °C.
   7. Bytt ut den primære antistoffløsningen med 500 μL 0,3% PBT og skyll raskt prøvene 5 ganger. Vask prøvene 3 ganger med 500 μL 0,3% PBT i 15 minutter hver på en rocker på RT.
   8. Erstatt 0,3% PBT med 50 μL sekundær antistoffoppløsning (fargestoffkonjugede antistoffer fortynnet i blokkeringsløsningen). For kjernefysisk farging tilsetts 0,5 μL 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI, 0,1 mg/ml lageroppløsning) til 50 μL oppløsning. Inkuber prøvene på en rocker i 2 timer ved RT eller alternativt ved 4 °C over natten.
      MERK: Hold prøvene i mørket.
   9. Bytt ut antistoffoppløsningen med 500 μL 0,3% PBT og skyll 5 ganger. Vask prøvene 3 ganger med 500 μL 0,3% PBT i 15 minutter hver ved RT.
4. Fin disseksjon av hjerne-RG-komplekset som inneholder PG og montering
   1. Bruk en engangspipet til å overføre de immunosterte prøvene til en tallerken fylt med 0,3% PBT.
      MERK: For å unngå ubeleilige bobler under disseksjon og montering, kan 0,3% PBT erstattes med PBS.
   2. Hold neglebåndet eller munnkroken med ett par tang under et dissekeringsmikroskop. Bruk en 27 G nål festet til en 1 ml sprøyte som en "kniv", kutt den fremre spissen av spiserøret og øyeskivene for å fjerne hjerne-RG-øye-platekomplekset fra kroppskutt.
   3. Skill spiserøret og tarmen fra hjerne-RG-øye-skivekomplekset med tang. Siden spiserøret passerer gjennom hjernen over ventral nerveledning (VNC), trekk ut tarmen til bakre side.
      MERK: For å fjerne ekstra imaginale plater fra prøvene, kutt forbindelsene mellom hjernen, øyeskivene og benskivene med en nålkniv.
   4. Gjenta trinn 1.4.1-1.4.4 for andre prøver.
      MERK: For å forhindre at vevsrester fester seg til prøvene, overfør hver fullført prøve til en annen ren tallerken fylt med 0,3% PBT eller PBS.
   5. Overfør prøvene til midten av en ren glasssklie med en mikropipette.
      MERK: For 2^nd eller 3^rd instar larver, bør enden av en mikropipettespiss avkortes med et barberblad.
   6. Under et dissekerende mikroskop justerer du individuelle prøver med dorsalsiden opp ved hjelp av tang.
      MERK: RG er plassert på dorsalsiden av hjernen (Figur 2A). Denne justeringen forenkler spesifikasjonen av individuelle prøver under avbildning.
   7. Vipp en glasssklie og tørk av så mye overflødig PBT som mulig. Sett en dråpe monteringsreagens på en side av lysbildet. Plasser kanten på en dekselglidning fra den andre siden av dråpen og sett dekselslippet på prøvene sakte med tang.
      MERK: Denne prosedyren hindrer prøvene i å bevege seg utenfor dekselslippet.
   8. Oppbevar prøvene ved 4 °C. Hold prøvene i mørket.

Representative Results

Figur 1: Den overordnede protokollordningen. To distinkte disseksjonsmetoder gjelder for larver og voksne kvinner, avhengig av formålet med forsøkene. Monteringsmetodene er også utviklet i henhold til prøveforhold. Fiksering, farging og avbildningsteknikker er i utgangspunktet vanlige for alle prøver. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2: Visualisering av PG og PG-projiserende nevroner. (A og B) Hjerne-ringkjertelen (RG) komplekset av wild-type 3^rd instar larve. I (B) er PG omrisset av stiplede linjer. Den filamentøse strukturen mellom hjernen og RG er luftrøret. (C-E) Innervasjonen av PG ble visualisert med mCD8::GFP drevet av GMR45C06-GAL4 i FlyLight-samlingen. Pg og GFP-positive nevroner ble merket med anti-Sro antistoff (magenta) og anti-GFP antistoff (grønn), henholdsvis. Det fluorescerende bildet slås sammen med det overførte lysbildet for å spesifisere omrisset av vev. I (D) er PG, corpora allata (CA) og corpora cardiaca (CC) illustrert. PG-projiserende nevroner er mer fremtredende i høyeffektsbildet med 40X objektiv (piler i E) enn laveffektsbildet med 10X objektiv (C). Skalalinje = 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Egg collection
tissue culture dish (55 mm)	AS ONE	1-8549-02	for grape-juice agar plates
collection cup	HIKARI KAGAKU
yeast paste	Oriental dry yeast, Tokyo
100% grape juice	Welch Food Inc.
rearing larvae
small vials (12ml, 40×23.5 mm, PS)	SARSTEDT	58.487
disposable loop	AS ONE	6-488-01
standard fly food			The recipe is on the website of Bloomington stock center.
Dissection
dissecting microscope	Carl Zeiss	Stemi 2000-C
dissecting microscope	Leica	S8 AP0
tissue culture dish (35 x 10 mm, non-treated)	IWAKI	1000-035
Sylgard	TORAY		coarting silicon inside dishes
Terumo needle (27G, 0.40 x 19 mm)	TERUMO	NN-2719S	A "knife" to cut the tissue
forceps, Inox, #5	Dumont, Switzerland
insect pin (0.18 mm in diameter)	Shiga Brand		for fillet dissection
micro scissors	NATSUME SEISAKUSHO CO LTD.	MB-50-10
Fixation
ultrapure water	Merck Millipore
phosphate buffered saline (PBS)
Formaldehyde	Nacalai tesque	16222-65
Paraformaldehyde	Nacalai tesque	02890-45
Triton-X100	Nacalai tesque	35501-15
microtubes (1.5 ml)	INA OPTIKA	CF-0150
Incubation
As one swist mixer TM-300 (rocker)	As one	TM-300	rocker
Bovine Serum Albumin	SIGMA	9048-46-8
Primary antibody
anti-Sro (guinea pig), 1:1000
anti-GFP (rabbit), 1:1000	Molecular Probes	A6455	Shimada-Niwa ans Niwa, 2014
anti-GFP (mouse mAb, GF200), 1:100	Nakarai tesque	04363-66
anti-5HT (rabbit), 1:500	SIGMA	S5545
anti-Hts 1B1 (mouse)	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	1B1
anti-DE-cadherin (rat), 1:20	DSHB	DCAD2
anti-nc82 (mouse), 1:50	DSHB	nc82
Secondary antibody
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate	Life Technologies	A-11008
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate	Life Technologies	A-11001
Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 conjugate	Life Technologies	A-11081
Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate	Life Technologies	A-21435
Alexa Fluor 546 dye-conjugated phalloidin	Life Technologies	A-22283
Mounting reagents
Micro slide glass	Matsunami Glass Ind.,Ltd.	SS7213
Square microscope cover glass	Matsunami Glass Ind.,Ltd.	C218181
FluorSave reagent (Mounting reagent)	Calbiochem	345789
Transfer pipette 1 ml (Disposable dropper)	WATSON	5660-222-1S
Fly stocks
w; GMR45C06-GAL4			from Bloomington Drosophila Stock Center. (#46260)
UAS–GFP; UAS–mCD8::GFP			gifts from K. Ito, The University of Tokyo.
w[1118]
w; phantom-GAL4#22/UAS-turboRFP
w; UAS-mCD8::GFP; TRH-GAL4			Li, H. H. (2014) and Alekseyenko, O. V, Lee, C. & Kravitz, E. A. (2010)
w; UAS-mCD8::GFP			from Bloomington Drosophila Stock Center. (#32188)
yw;; nSyb-GAL4			from Bloomington Drosophila Stock Center. (#51941)