Novel Tank Diving Assay: Un método para estudiar las respuestas innatas al estrés en el pez cebra

Overview

El artículo describe un método de comportamiento para evaluar el estrés en el pez cebra. En respuesta al estrés, el pez cebra tiende a nadar en el fondo de un tanque hasta que se elimina el estrés. El protocolo de ejemplo describe el método paso a paso para realizar el ensayo.

Protocol

1. Nueva configuración de pruebas de tanques

1. Prepare un vaso de precipitados de 250 ml precargado con agua del sistema de peces y al menos dos tanques de retención.
2. En la mañana de la prueba, transfiera al menos 10 peces cebra adultos de prueba para ser utilizados para cada condición experimental (controles y adultos experimentales) de las instalaciones de pesca a un tanque de retención, transfiéralas a la sala de comportamiento y déjalas aclimatarse durante al menos una hora.
   NOTA: Un análisis de potencia debe realizarse antes de la experimentación, pero en nuestras manos, un n = 10 suele ser suficiente para detectar la significación estadística. Además, el tanque de retención no debe contener más de cinco individuos por litro de agua. Una aclimatación de una hora es suficiente, ya que se ha demostrado que los adultos de pez cebra habituan dentro de los 30 minutos de un nuevo tanque. Además, los ritmos conductuales se ven afectados por los procesos circadianos, por lo que las réplicas experimentales realizadas en diferentes días deben realizarse en las mismas horas. Normalmente realizamos todos los experimentos entre las 11:00 am y las 6:00 pm.
3. Etiquete los tanques de tal forma que la condición o genotipo de los animales sea ciega al experimentador.
   NOTA: Los experimentos se pueden cegar fácilmente al experimentador etiquetando tanques utilizando un sistema de letras o números (es decir, un tanque está etiquetado como 'A', otro 'B', etc.). Una parte que no participa en los experimentos etiqueta los tanques con un sistema de este tipo y enmascara las identidades del experimentador hasta después de que se complete el postanálisis.
4. Usando una red, coloque suavemente a un solo adulto en el vaso de precipitados precargado desde el paso 1.1. Deje que el pescado adulto se aclimate en el vaso de precipitados durante 10 minutos.
   NOTA: Registre el sexo del adulto, ya que podría ser importante después del análisis para buscar diferencias específicas del sexo.
5. Después de la aclimatación en el vaso de precipitados, introducir el pez en el tanque novedoso (establecer detalles a continuación) vertiendo suavemente el agua y adulto del vaso de precipitados.
   NOTA: Los pasos de esta sección describen la configuración del nuevo ensayo de tanque. Se muestra un diagrama del producto final en la Figura 1B.
   1. Coloque el tanque novedoso en el centro de la mesa.
   2. Coloque las luces infrarrojas detrás del tanque y coloque la lámina acrílica blanca o la pantalla del difusor entre el tanque y la fuente de luz LED.
   3. Coloque el difusor para que extienda al máximo la luz procedente de los LED, y la intensidad de la luz es suficiente para iluminar el tanque novedoso. Cuanto más cerca esté el tablero de la fuente de luz, más brillante serán las luces, pero menos se difundirá. Por el contrario, colocar la placa difusor lejos de la fuente de luz reducirá la intensidad de la luz, pero extenderá mejor la luz.
   4. Llene aproximadamente tres cuartas partes del nuevo tanque con agua del sistema de peces.
      NOTA: El agua del sistema se genera utilizando ósmosis inversa del agua del grifo, seguida de la dosificación de tal forma que la conductividad es igual a 900 ± 100 μS, que el pH es neutro (7,2), y que la temperatura es de 27 ± 1 °C.
   5. Conecte la cámara al soporte de la cámara y conecte la cámara al ordenador. Abra el software de adquisición de vídeo y ajuste la cámara para que se enfrente a la parte delantera del tanque y asegúrese de que se pueda ver todo el tanque novedoso y que no haya áreas oscurecidas en el video. Ajuste el tanque y las luces infrarrojas de tal forma que haya suficiente e incluso iluminación en todo el tanque cuando se observe a través de la cámara.
      NOTA: Antes de continuar con los experimentos, a menudo puede ser útil realizar una ejecución de prueba, en la que se captura un vídeo de un pez y se realiza el seguimiento. Esto garantizará que la configuración sea suficiente para la experimentación del comportamiento.
6. Después de introducir al adulto en el tanque novedoso, inicie la grabación de la cámara y aléjese de la configuración para evitar molestias adicionales a los peces.
7. Una vez finalizada la grabación, retire al individuo del nuevo tanque y colóquelo en un nuevo tanque de sujeción.
   NOTA: Se debe utilizar un tanque de retención diferente del que está en el paso 1.2 para evitar repetidas pruebas en los mismos individuos.

Representative Results

Figura 1. Diagrama de la nueva configuración del tanque. (A) Dimensiones del tanque de novela trapezoidal de 1,8 L visto desde el lado de grabación del tanque. (B) Diagrama de la configuración que incluye posiciones de las luces infrarrojas, cámara y barreras utilizadas para minimizar la interferencia humana.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Camera			We use Point Grey Grasshopper3 USB camera with lens from Edmund Optics.
Infrared filter	Edmund Optics
Video Acquisition Program			Use programs such as Virtualdub or FlyCapture because the acquisition framerate can be set.
Infrared LED lights
Assay tank	Aquaneering	Part number ZT180	Size: M3 1.8 liter
Stand and clamp, or standard tripod for camera
250mL beaker
Tracking software			We use Ethovision XT 13 from Noldus Information Technology