Роман Танк Дайвинг Анализ: Метод для изучения врожденных стрессовых реакций в Зебрафиш

Overview

В статье описывается поведенческий метод оценки стресса у зебры. В ответ на стресс, зебрафиш, как правило, плавают на дне бака, пока стресс удаляется. Протокол выборки описывает метод stepwise для выполнения анализа.

Protocol

1. Новая установка испытания бака

1. Приготовьте стакан 250 мл, предварительно заполненный рыбной системой воды, и по крайней мере два резервуара для хранения.
2. На утро испытания, передача по крайней мере 10 испытаний взрослых зебры, которые будут использоваться для каждого экспериментального состояния (контроля и экспериментальных взрослых) из рыб объекта в резервуар для хранения, передать их в комнату поведения, и позволить им акклиматизироваться, по крайней мере один час.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ мощности должен быть выполнен до экспериментов, но в наших руках, n No 10, как правило, достаточно для обнаружения статистической значимости. Кроме того, резервуар должен содержать не более пяти человек на литр воды. Акклиматизация одного часа достаточно, как зебрафиш взрослых было показано, чтобы привыкнуть в течение 30 минут после нового танка. Кроме того, поведенческие ритмы страдают от циркадных процессов, и, таким образом, экспериментальные репликации, выполненные в разные дни, должны выполняться в течение одного и того же часа. Обычно мы выполняем все эксперименты с 11:00 до 18:00.
3. Наклеить этикетку на танки таким образом, чтобы состояние или генотип животных было слепым к экспериментатору.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперименты можно легко ослепить экспериментатора, маркируя танки с помощью буквы или номерной системы (т.е. один танк помечен как «А», другой «Б» и т.д.). Сторона, не участвуют в экспериментах этикетки танков с такой системой, и маски идентичности от экспериментатора до тех пор, пока после анализа завершена.
4. Используя сетку, аккуратно поместите одного взрослого в предварительно заполненный стакан из шага 1.1. Дайте взрослой рыбе акклиматизироваться в стакане в течение 10 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Запись пола взрослого, так как это может быть важно после анализа, чтобы искать секс-специфических различий.
5. После акклиматизации в стакане, ввести рыбу в новый бак (установить детали ниже), осторожно выливая воду и взрослых из стакана.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги в этом разделе описывают создание нового анализа танка. Диаграмма конечного продукта приведена на рисунке 1B.
   1. Поместите новый танк в середине стола.
   2. Распоистите инфракрасные огни за баком и поместите белый акриловый лист или диффузорный экран между баком и светодиодным источником света.
   3. Поместите диффузор так, чтобы он максимально распространяет свет, поступающий от светодиодов, и интенсивность света достаточно, чтобы осветить новый бак. Чем ближе доска к источнику света, тем ярче будут огни, тем меньше она будет распространяться. В отличие от этого, размещение диффузорной доски от источника света уменьшит интенсивность света, но лучше распределит свет.
   4. Заполните приблизительно три четверти нового резервуара водой рыбной системы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Системная вода генерируется с использованием обратного осмоса водопроводной воды, а затем досирования таких, что проводимость равна 900 ± 100 ЗС, что рН является нейтральным (7,2), и что температура 27 ± 1 КК.
   5. Прикрепите камеру к стенду камеры и подключите камеру к компьютеру. Откройте программное обеспечение для приобретения видео и отрегулируйте камеру лицом к передней части танка и убедитесь, что весь новый танк можно увидеть и что в видео нет скрытых областей. Отрегулируйте бак и инфракрасные огни таким образом, чтобы было достаточно и даже освещения по всему танку при наблюдении через камеру.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Прежде чем приступить к экспериментам, часто бывает полезно выполнить пробный запуск, в котором видео рыбы захвачен и отслеживания выполняется. Это гарантирует, что установка достаточна для экспериментов с поведением.
6. После введения взрослого в новый бак, запустите запись камеры, и отойти от установки, чтобы предотвратить дополнительное бедствие для рыбы.
7. После того, как запись закончена, удалите человека из нового танка и поместите в новый танк.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Другой танк холдинга от одного в шаге 1.2 должны быть использованы для предотвращения повторных испытаний на тех же лиц.

Representative Results

Рисунок 1. Диаграмма новой установки бака. (A) Размеры 1,8 L трапециевидного нового танка, как видно из записи стороне танка. (B)Диаграмма установки, включая положения инфракрасных огней, камеры и барьеров, используемых для минимизации вмешательства человека.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Camera			We use Point Grey Grasshopper3 USB camera with lens from Edmund Optics.
Infrared filter	Edmund Optics
Video Acquisition Program			Use programs such as Virtualdub or FlyCapture because the acquisition framerate can be set.
Infrared LED lights
Assay tank	Aquaneering	Part number ZT180	Size: M3 1.8 liter
Stand and clamp, or standard tripod for camera
250mL beaker
Tracking software			We use Ethovision XT 13 from Noldus Information Technology