Neuartige Tanktauchen Assay: Eine Methode, um angeborene Stressreaktionen in Zebrafischen zu studieren

Overview

Der Artikel beschreibt eine Verhaltensmethode zur Bewertung von Stress bei Zebrafischen. Als Reaktion auf Stress, Zebrafische neigt dazu, am Boden eines Tanks zu schwimmen, bis Stress entfernt wird. Das Beispielprotokoll beschreibt die schrittweise Methode zum Durchführen des Assays.

Protocol

1. Neuartige Tanktest-Setup

1. Bereiten Sie einen 250 ml Becher vor, der mit Fischsystemwasser vorgefüllt ist, und mindestens zwei Haltebecken.
2. Am Morgen des Tests mindestens 10 testerwachsene Zebrafische, die für jede Versuchsbedingung (Kontrollen und experimentelle Erwachsene) von der Fischanlage in einen Haltebecken verwendet werden, in den Verhaltensraum übertragen und sie für mindestens eine Stunde akklimatisieren lassen.
   HINWEIS: Eine Leistungsanalyse sollte vor dem Experimentieren durchgeführt werden, aber in unseren Händen reicht in der Regel ein n = 10 aus, um die statistische Signifikanz zu erkennen. Darüber hinaus sollte der Haltetank nicht mehr als fünf Personen pro Liter Wasser enthalten. Eine Eingewöhnungszeit von einer Stunde reicht aus, da Zebrafische erwachsene innerhalb von 30 Minuten nach einem neuen Tank gewöhnt haben. Auch Verhaltensrhythmen werden durch zirkadiane Prozesse beeinflusst, und daher sollten experimentelle Replikationen, die an verschiedenen Tagen durchgeführt werden, innerhalb der gleichen Stunden durchgeführt werden. Wir führen in der Regel alle Experimente zwischen 11:00 Uhr und 18:00 Uhr durch.
3. Beschriften Sie die Tanks so, dass der Zustand oder Genotyp der Tiere für den Experimentator blind ist.
   HINWEIS: Experimente können leicht für den Experimentator geblendet werden, indem Tanks mit einem Buchstaben- oder Zahlensystem gekennzeichnet werden (d. h. ein Tank ist mit "A", ein anderer "B" usw. gekennzeichnet). Eine Partei, die nicht an den Experimenten beteiligt ist, beschriftet die Panzer mit einem solchen System und maskiert die Identitäten des Experimentators, bis die Nachanalyse abgeschlossen ist.
4. Mit einem Netz, legen Sie vorsichtig einen einzelnen Erwachsenen in den vorgefüllten Becher ab Schritt 1.1. Lassen Sie die erwachsenen Fische im Becher für 10 Minuten zu akklimatisieren.
   HINWEIS: Zeichnen Sie das Geschlecht des Erwachsenen auf, da es nach der Analyse wichtig sein könnte, nach geschlechtsspezifischen Unterschieden zu suchen.
5. Nach der Akklimatisierung im Becher, führen Sie die Fische in den neuartigen Tank (Set up Details unten), indem Sie sanft das Wasser und Erwachsene aus dem Becher.
   HINWEIS: In den Schritten in diesem Abschnitt wird die Einrichtung des neuartigen Tank-Assays beschrieben. Ein Diagramm des Endprodukts ist in Abbildung 1Bdargestellt.
   1. Legen Sie den neuartigen Tank in die Mitte des Tisches.
   2. Positionieren Sie die Infrarotlichter hinter dem Tank und platzieren Sie die weiße Acrylfolie oder den Diffusorschirm zwischen Tank und LED-Lichtquelle.
   3. Platzieren Sie den Diffusor so, dass er das Licht der LEDs maximal ausbreitet, und die Intensität des Lichts reicht aus, um den neuartigen Tank zu beleuchten. Je näher das Brett an der Lichtquelle ist, desto heller werden die Lichter sein, aber desto weniger wird es diffundieren. Im Gegensatz dazu reduziert das Platzieren der Diffusorplatine von der Lichtquelle die Lichtintensität, verbreitet das Licht aber besser.
   4. Füllen Sie etwa drei Viertel des neuartigen Beckens mit Fischsystemwasser.
      HINWEIS: Das Systemwasser wird mit Hilfe der Umkehrosmose des Leitungswassers erzeugt, gefolgt von einer Anschließenden Sogierung, dass die Leitfähigkeit 900 ± 100 s entspricht, dass der pH-Wert neutral ist (7,2) und dass die Temperatur 27 ± 1 °C beträgt.
   5. Schließen Sie die Kamera am Kameraständer an, und schließen Sie die Kamera an den Computer an. Öffnen Sie die Videoaufnahmesoftware und stellen Sie die Kamera so ein, dass sie vor dem Tank zu sehen ist und dass sich keine verdeckten Bereiche im Video befinden. Stellen Sie den Tank und die Infrarotleuchten so ein, dass eine ausreichende und gleichmäßige Beleuchtung im gesamten Tank vorhanden ist, wenn sie durch die Kamera beobachtet wird.
      HINWEIS: Bevor Sie zu Experimenten übergehen, kann es oft nützlich sein, einen Testlauf durchzuführen, bei dem Videos eines Fisches erfasst und Tracking durchgeführt werden. Dadurch wird sichergestellt, dass die Einrichtung für das Experimentieren des Verhaltens ausreicht.
6. Nachdem Sie den Erwachsenen in den neuartigen Tank eingeführt haben, starten Sie die Kameraaufnahme und entfernen Sie sich vom Setup, um zusätzliche Spenszulagen für die Fische zu verhindern.
7. Nachdem die Aufnahme abgeschlossen ist, entfernen Sie die Person aus dem neuartigen Tank und legen Sie sie in einen neuen Haltebehälter.
   HINWEIS: Ein anderer Haltebehälter als der in Schritt 1.2 sollte verwendet werden, um wiederholte Tests an denselben Personen zu verhindern.

Representative Results

Abbildung 1. Diagramm des neuartigen Tankaufbaus. (A) Abmessungen des 1,8 L trapezförmigen neuartigen Tanks, von der Aufnahmeseite des Tanks aus gesehen. (B) Diagramm des Setups einschließlich der Positionen der Infrarotlichter, Kamera und Barrieren verwendet, um menschliche Störungen zu minimieren.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Camera			We use Point Grey Grasshopper3 USB camera with lens from Edmund Optics.
Infrared filter	Edmund Optics
Video Acquisition Program			Use programs such as Virtualdub or FlyCapture because the acquisition framerate can be set.
Infrared LED lights
Assay tank	Aquaneering	Part number ZT180	Size: M3 1.8 liter
Stand and clamp, or standard tripod for camera
250mL beaker
Tracking software			We use Ethovision XT 13 from Noldus Information Technology