Summary
Qui si descrive un metodo per l'isolamento delle cellule stellate epatiche dal fegato di topo. Per la purificazione delle cellule stellate, fegati mouse sono digeriti
Abstract
Cellule stellate epatiche sono fegato residenti cellule simili a stelle morfologia e si trovano nello spazio di Disse tra fegato e cellule endoteliali sinusoidali 1,2 epatociti. Cellule stellate sono derivati dai precursori del midollo osseo e memorizzare fino a 80% del totale del corpo di vitamina A 1, 2. Dopo l'attivazione, le cellule stellate differenziarsi in miofibroblasti per produrre la matrice extracellulare, contribuendo così alla fibrosi epatica 3. Sulla base delle loro capacità di contrarsi, le cellule stellate myofibroblastic in grado di regolare il tono vascolare associata a ipertensione portale 4. Recentemente, abbiamo dimostrato che le cellule stellate epatiche sono cellule che presentano l'antigene potenti e possono attivare le cellule NKT così come convenzionali linfociti T 5.
Qui vi presentiamo un metodo efficiente per la preparazione delle cellule stellate epatiche dal fegato di topo. Grazie alla loro localizzazione perisinusoidal, l'isolamento delle cellule stellate epatiche è un processo multi-step. Al fine di rendere accessibile a cellule stellate isolamento dallo spazio di Disse, fegati mouse sono perfusi in situ con l'pronasi E enzimi digestivi e Collagenasi perfusione P. In seguito, il tessuto epatico viene sottoposto ad ulteriore trattamento enzimatico con pronasi Collagenasi E e P vitro. Successivamente, il metodo sfrutta la massiccia quantità di vitamina A-la memorizzazione gocce lipidiche nelle cellule stellate epatiche. Questa funzione consente la separazione delle cellule stellate da altri tipi di cellule epatiche per centrifugazione su una pendenza dell'8% Nycodenz. Il protocollo qui descritto produce una popolazione altamente pura e omogenea delle cellule stellate. Purezza delle preparazioni può essere valutata dalla colorazione per il marcatore molecola di proteina gliale fibrillare acida (GFAP), prima dell'analisi al microscopio a fluorescenza e citometria a flusso. Inoltre, microscopia luce rivela l'apparizione unica di cellule epatiche stellate a forma di stella che ospitano grandi quantità di goccioline lipidiche.
Nel loro insieme, vi presentiamo un protocollo dettagliato per l'isolamento efficiente delle cellule stellate epatiche, comprese le immagini rappresentative del loro aspetto morfologico e di espressione GFAP che contribuiscono a definire l'entità delle cellule stellate.
Protocol
Topi C57BL / 6 dovrebbero essere usati a ~ 20 settimane di età o più. L'utilizzo di topi maschi del peso 25-30g è raccomandato. La resa di cellule stellate può essere aumentata di alimentazione topi un A-arricchito di vitamina dieta per 2 mesi prima di isolamento delle cellule stellate. Circa 2x10 5 cellule stellate epatiche può essere purificato dal fegato di un C57BL / 6 del mouse, mentre la resa di cellule stellate da topi BALB / c è nettamente superiore. Il protocollo che segue è regolata a 5 topi. La cura degli animali e la sperimentazione sono state eseguite in conformità approvato Animal Care istituzionali e protocolli Comitato Usa.
1. Perfusione in situ di fegato mouse con enzimi digestivi
- Scaldare il tampone SC1 e soluzioni per perfusioni enzima in un bagno d'acqua a 37 ° C.
- Montare un set di infusione alato sul tubo di silicone di una pompa peristaltica.
- Calibrare la pompa con PBS per ottenere un flusso laminare di 6.5ml/min, che è la portata che saranno utilizzati per la perfusione in situ del fegato. Equilibrare il tubo in silicone con SC1 soluzione.
- Anestetizzare il topo mediante iniezione intraperitoneale di ketamina (90 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg) e la soluzione di prova per la perdita di riflessi per garantire la narcotizzazione profondo.
- Fissare il mouse in posizione supina su una base adatta.
- Usare le forbici e pinze per eseguire una incisione longitudinale nella pelle addominale ed esporre il peritoneo.
- Aprire con cautela il peritoneo e spostare l'intestino dalla cavità addominale al lato sinistro dell'animale al fine di esporre la vena porta.
- Inserire la cannula del set per infusione nella vena porta. Per questo passaggio, l'uso di uno stereomicroscopio è raccomandato.
- Avviare la perfusione del fegato con la soluzione SC1 30ml. Aprire la vena cava inferiore subito dopo l'inizio del flusso. Lavaggio di successo del fegato è indicato da una perdita di colore del tessuto del fegato.
- Perfusione del fegato con una soluzione di 30ml E pronasi. Al momento la digestione di successo, i lobi del fegato si gonfierà, i lobuli e appariranno distinte attraverso la capsula.
- Perfusione del fegato con una soluzione di 30ml P Collagenasi. Il fegato a questo punto ha perso la sua forma e aspetto atonica e amorfo.
- Accuratamente separato il fegato dal diaframma e gli organi circostanti e riporlo in 70ml SC2 soluzione sul ghiaccio.
- Ripetere la procedura per topi aggiuntivi.
2. Nella digestione in vitro di fegato del mouse
Tutte le fasi ulteriori di lavoro deve essere effettuata in condizioni sterili in una cappa a flusso laminare.
- Tagliare il fegato a pezzi di circa 2x2x2mm 3 usando forbici affilate.
- Combina la sospensione di 70ml SC2 compresi i pezzi di fegato con 50 ml di pronasi E-Collagenasi soluzione P e aggiungere 1 ml di soluzione di DNasi I.
- Digerire il fegato per 20 minuti a 37 ° C sotto agitazione.
3. Gradiente di densità centrifugazione
- Filtrare la sospensione cellulare attraverso filtri cellula 70μm in 6 tubi Falcon da 50 ml e aggiungere fino a 50 ml con SC2 buffer. Centrifugare per 10 minuti a 600 grammi e 4 ° C.
- Con attenzione aspirare 40 ml del surnatante, quindi aggiungere 150μl DNasi soluzione che ad ogni provetta e sospendere nuovamente le cellule.
- Si riuniscono gli sospensioni cellulari in 4 tubi Falcon da 50 ml e lavare con GBSS-B, centrifugare per 10 minuti a 600g e 4 ° C.
- Con attenzione aspirare la maggior quantità di surnatante possibile senza disturbare il pellet e aggiungere 150μl DNasi soluzione che ad ogni provetta. Risospendere il pellet cellulare in 10 ml GBSS-B per provetta.
- Piscina le cellule in 2 tubi Falcon da 50 ml e aggiungere GBSS-B per un volume totale di 36ml per provetta. Aggiungere 14 ml soluzione Nycodenz a ciascuna provetta e mescolare bene.
- Trasferire 10 ml di sospensione cellulare in un unico tubo 12ml gradiente di centrifugazione, con conseguente 10 tubi in totale. Delicatamente sovrapposizione la sospensione cellulare con 1,5 ml GBSS-B per provetta.
- Centrifugare i gradienti per 15 minuti a 1500g e 4 ° C senza freno. Successivamente, epatociti verranno pellet sul fondo della provetta mentre le cellule stellate si trovano nella interfase come un anello bianco.
- Accuratamente raccolto l'interfase contenente le cellule stellate e lavarli con GBSS-B; centrifugare per 10 minuti a 600 grammi e 4 ° C.
- Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in 20 ml di DMEM supplementato con 10% di siero FBS, 1% HEPES penicillina / streptomicina, 2mM L-Glutammina, piruvato di sodio 1mM, e 10mm. Trasferire le cellule in fiasche coltura tissutale con una concentrazione di 2x10 4 cellule / cm 2. Incubare le cellule a 37 ° C e 5% di CO 2.
- Cambiare il supporto, non appena le cellule stellate epatiche sono aderenti (circa 2 ore dopo la preparazione) per lavare via le cellule morte e detriti cellulari.
- Il giorno seguente, la cellula stellates dovrebbe sviluppare la loro caratteristica forma di stella con morfologia perinucleare vitamina A-la memorizzazione vescicole lipidiche.
- Per gli esperimenti successivi, le cellule stellate epatiche può essere facilmente staccato partire da lastre di superfici in plastica con lievi soluzioni enzimatiche come Accutase, ad esempio,
4. Rappresentante dei risultati:
Dopo la preparazione delle cellule stellate epatiche utilizzando il protocollo previsto, la purezza delle popolazioni isolate possono essere testati in considerazione tre caratteristiche principali di questo tipo di cellule, come le stelle, come forma, gocce lipidiche perinucleare, e l'espressione della proteina acidica fibrillare gliale (GFAP ). Immagini rappresentative per l'aspetto caratteristico delle cellule stellate epatiche 2 ore dopo l'isolamento delle cellule, così come il giorno 1 e 3 della coltura in vitro sono rappresentati in figura 1. La Figura 2 mostra una colorazione rappresentante immunofluorescenza per GFAP nelle cellule stellate epatiche, che sono state coltivate per 3 giorni dopo l'isolamento delle cellule. Cellule stellate epatiche si differenziano in cellule myofibroblastic durante la coltura in vitro. Un tratto distintivo caratteristico di queste cellule stellate attivate è l'espressione di actina alfa del muscolo liscio (αSMA). La figura 3 mostra immunofluorescenza per ASMA e miosina IIA in cellule stellate attivate il giorno 7 di coltura in vitro.
Figura 1. Morfologia caratteristica delle cellule stellate epatiche. Cellule stellate sono state isolate da fegato del mouse utilizzando il protocollo previsto. Le immagini ritraggono le cellule stellate 2 ore dopo l'isolamento delle cellule (a, b), così come il giorno 1 (c) e il giorno 3 (d) della coltura in vitro. Cellule stellate epatiche presentano elevate quantità di vescicole lipidiche nei siti perinucleare e acquistano il loro caratteristico astrale-come morfologia durante i primi giorni di coltura in vitro (ingrandimento 200x).
Figura 2. Cellule stellate epatiche specificamente esprimere GFAP nel fegato. Cellule stellate sono state isolate e immunofluorescently colorate per GFAP (rosso) il giorno 3 di coltura in vitro. Nuclei delle cellule sono rappresentate in blu (Hoechst macchia).
Figura 3. Cellule stellate epatiche differenziarsi in miofibroblasti. Cellule stellate epatiche isolate da topi C57BL / 6 sono state coltivate per 7 giorni. Successivamente, sono stati trasferiti alle diapositive da camera e colorate per ASMA (mostrato in rosso) e miosina IIA (rappresentato in verde). I nuclei delle cellule erano di contrasto con Hoechst (blu).
| SC1 Buffer | |
| EGTA | 190mg |
| Glucosio | 900 mg |
| HEPES | 10 ml di soluzione madre 1M |
| KCl | 400mg |
| Na 2 HPO 4 x 2 H 2 O | 151mg |
| NaCl | 8g |
| NaH 2 PO 4 x H 2 O | 78mg |
| NaHCO 3 | 350mg |
| Rosso fenolo | 6mg |
| dH 2 O | riempire fino a 1l |
| SC2 Buffer | |
| CaCl 2 x 2H 2 O | 560mg |
| HEPES | 10 ml di soluzione 1M |
| KCl | 400mg |
| Na 2 HPO 4 x 2 H 2 O | 151mg |
| NaCl | 8g |
| NaH 2 PO 4 x H 2 O | 78mg |
| NaHCO 3 | 350mg |
| Rosso fenolo | 6mg |
| dH 2 O | riempire fino a 1l |
| GBSS-A Buffer | |
| KCl | 370mg |
| CaCl 2 x 2H 2 O | 225mg |
| Glucosio | 991mg |
| KH 2 PO 4 | 30mg |
| MgCl 2 x 6 H 2 O | 210mg |
| MgSO 4 x 7 H 2 O | 70mg |
| Na 2 HPO 4 x 2 H 2 O | 75mg |
| NaHCO 3 | 227mg |
| Rosso fenolo | 6mg |
| dH 2 O | riempire fino a 1l |
| GBSS-B Buffer | |
| CaCl 2 x 2H 2 O | 225mg |
| Glucosio | 991mg |
| KCl | 370mg |
| KH 2 PO 4 | 30mg |
| MgCl 2 x 6 H 2 O | 210mg |
| MgSO 4 x 7 H 2 O | 70mg |
| Na 2 HPO 4 x 2 H 2 O | 75mg |
| NaCl | 8g |
| NaHCO 3 | 227mg |
| Rosso fenolo | 6mg |
| dH 2 O | riempire fino a 1l |
| Pronasi Soluzione E perfusione | |
| E pronasi | 100mg (4000 PU / mg min) |
| SC2 Buffer | 200ml |
| Collagenasi P perfusione Solution | |
| Collagenasi P | 85mg (1,78 U / mg lyo) |
| SC2 Buffer | 200ml |
| Pronasi E-Solution Collagenasi P | |
| E pronasi | 50mg (4000 PU / mg min) |
| Collagenasi P | 85mg (1,78 U / mg lyo) |
| SC2 Buffer | 50ml |
| DNasi I Solution | |
| DNasi I | 6mg (ca. 2000U/mg) |
| GBSS-B | 3ml |
| Nycodenz Soluzione | |
| Nycodenz | 8g |
| GBSS-A | 28ml |
Tabella 1. Tamponi e soluzioni enzima necessario per l'isolamento delle cellule stellate epatiche. Il pH di tutti i buffer dovrebbe essere regolata per 7,3-7,4. Inoltre, filtrazione sterile di tutti i buffer è raccomandato. E 'importante adeguare la quantità di enzima utilizzato a seconda delle determinata attività enzimatica.
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Discussion
Cellule stellate epatiche regolano essenziali processi fisiologici e fisiopatologici nel fegato. Inoltre, le cellule stellate possiedono proprietà presentanti l'antigene, rendendoli una componente importante della risposta immunitaria epatica. Sebbene le cellule stellate epatiche costituiscono il 10-15% del numero totale di cellule nel fegato, l'isolamento di queste cellule è impegnativo a causa della loro localizzazione nello spazio di Disse perisinusoidal.
Qui vi presentiamo un metodo semplice per isolare le cellule stellate epatiche da fegato mouse nella digestione situ e centrifugazione gradiente successive. Questo protocollo permette l'isolamento delle cellule stellate elevata purezza idonei per saggi immunologici.
L'entità delle cellule isolate possono essere controllati in considerazione tre caratteristiche principali delle cellule stellate epatiche, tra cui stelle, come forma, perinucleare vitamina A-la memorizzazione vescicole lipidiche, ed espressione di GFAP. In base a questi criteri, le cellule stellate ottenuti utilizzando il protocollo descritto sono regolarmente ~ puro al 99% come valutato dalla colorazione immunofluorescenza e la citometria a flusso. Potenziali contaminanti di isolamento delle cellule stellate sono Kupffer cellule dendritiche e le cellule del fegato (DC). Pertanto, abbiamo analizzato colture di cellule stellate dalla colorazione citometria a flusso per le molecole di superficie F4/80 (cellule di Kupffer) e CD11c (DC). Di conseguenza, l'assenza di F4/80 + e + CD11c cellule escluso la contaminazione di preparati di cellule da parte delle cellule stellate di Kupffer o DC. Così, senza ulteriori metodi di arricchimento o di ordinamento sono necessari, rendendo il protocollo descritto per l'isolamento delle cellule stellate epatiche una procedura comoda e veloce.
Per quanto riguarda l'entità delle cellule stellate epatiche, è importante tenere presente che nelle cellule coltivate in vitro si attivano e differenziarsi in miofibroblasti che sono fondamentalmente diverse dalle cellule stellate quiescenti. Durante questa metamorfosi, le cellule stellate epatiche espressione libera di GFAP e upregulate αSMA, che consente di rilevare tempestivamente il giorno 7 di coltura in vitro. In particolare, l'attivazione delle cellule stellate in vitro ricorda molto il loro pattern di attivazione in vivo 6. Ciò si riflette il loro coinvolgimento nella fibrosi epatica, ad esempio, anche se le altre popolazioni produttrici di collagene miofibroblasti contribuire allo sviluppo della malattia 7. Per concludere, le cellule stellate epatiche ottenute dal protocollo descritto fornire un modello per le cellule stellate quiescenti nonché per miofibroblasti fegato attivato a seconda del loro stadio di differenziazione.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato dalla famiglia Smith Award per l'eccellenza nella ricerca biomedica e NIH RO1 AI083426-01 (FW). Patrick Maschmeyer e Melanie Flach sono supportati da borse di dottorato da Boehringer Ingelheim Fondazione.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70μm Cell Strainer | BD Biosciences | 352350 | |
| CaCL2 x 2H2O | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Collagenase P | Roche Group | 11249002001 | |
| DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 11960 | |
| DNase I | Roche Group | 10104159001 | |
| DPBS | Cellgro | 21-031-cv | |
| EGTA | Fluka | 3777 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO, by Life Technologies | 16000 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| Gradient Centrifugation Tubes | Greiner Bio-One | 163160 | |
| HEPES | GIBCO, by Life Technologies | 15630 | |
| KCL | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| L-Glutamine | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | |
| MgCl2 x 6H2O | Fluka | 63068 | |
| MgSO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | M2773 | |
| Na2HPO4 x 2H2O | Fluka | 71643 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| NaH2PO4 x H2O | Fluka | 71507 | |
| NaHCO3 | Fluka | 71628 | |
| Nycodenz | Accudenz AG | AN7050/BLK | |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
| Peristaltic Pump | Cole-Parmer | HV-7523-70 | |
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | P4633 | |
| Pronase E | Calbiochem | 7433-2 | |
| Silicone Tube | Masterflex (Cole Palmer) | HV-96440-14 | |
| Sodium Pyruvate | GIBCO, by Life Technologies | 11360 | |
| Tissue culture flask (25cm2) | BD Biosciences | 353108 | |
| Winged Infusion Set | Terumo Medical Corp. | 1SV27EL |
References
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