Summary
Een nieuwe methode om macrofagen te verkrijgen van de primaire cultuur van de levercellen wordt beschreven. Deze methode maakt gebruik van de proliferatie van macrofagen in de cultuur, gevolgd door het schudden van de cultuur kolven en zuivering door middel van selectieve gehechtheid aan plastic schaaltjes. Deze techniek biedt een efficiënte lever macrofagen, zonder ingewikkelde apparatuur en vaardigheden.
Abstract
Kupffercellen zijn lever-specifieke inwoner macrofagen en spelen een belangrijke rol in de fysiologische en pathologische functies van de lever 1-3. Hoewel de isolatie methoden van de lever macrofagen zijn goed beschreven 4-6, de meeste van deze methoden vereisen geavanceerde apparatuur, zoals een centrifugaal elutriator en technische vaardigheden. Hier bieden we een nieuwe methode om de lever macrofagen te verkrijgen in voldoende aantal en de zuiverheid van de gemengde primaire culturen van volwassen ratten levercellen, zoals schematisch weergegeven in Figuur 1.
Na dissociatie van de levercellen door twee-staps methode perfusie 7,8, een fractie voornamelijk uit parenchymale hepatocyten wordt voorbereid en gezaaid in T75 weefselkweek kolven met kweekmedium uit DMEM en 10% FCS.Parenchymal hepatocyten verliest de epitheliale cel morfologie binnen een paar dagen in cultuur en gedegenereerde of transformeren tot fibroblast-achtige cellen (figuur 2). Als de cultuur opbrengst, rond dag 6, fase-contrast-heldere, ronde macrofaag-achtige cellen beginnen te woekeren op de fibroblastische cel sheet (figuur 2). De groei van de macrofaag-achtige cellen voort te zetten en te komen tot een maximale niveaus rond dag 12, die de cel vel op de kolf oppervlak. Door schudden van de cultuur flacons, zijn macrofagen gemakkelijk opgehangen in het kweekmedium. Daaropvolgende overdracht en korte incubatie in plastic borden leiden tot een selectieve hechting van macrofagen (figuur 3), waar hij als andere contaminerende cellen blijven geschorst. Na meerdere keren wordt gespoeld met PBS, zijn bevestigd macrofagen geoogst. Meer dan 10 6 cellen kan herhaaldelijk worden geoogst uit dezelfde T75 weefselkweek kolf bij twee tot drie dagen intervallen van meer dan twee weken (figuur 3). Zuiverheden van de geïsoleerde macrofagen waren 95 tot 99%, zoals geëvalueerd door flowcytometrie of immunocytochemie met ratten macrofaag-specifieke antilichamen (figuur 4). De geïsoleerde cellen vertonen actieve fagocytose van polystylene kralen (figuur 5), proliferatieve respons op recombinant GM-CSF, secretie van inflammatoire / anti-inflammatoire cytokines na stimulatie met LPS, en de vorming van meerkernige reuscellen 9.
Tot slot bieden we een eenvoudige en efficiënte methode om de lever macrofagen te verkrijgen in voldoende aantal en zuiverheid, zonder ingewikkelde apparatuur en skills.This methode moet wellicht worden voor andere zoogdieren.
Protocol
1. Perfusie van de lever
- Verdoven een volwassen mannelijke Sprague-Dawley rat (bij 10 tot 15 weken oud; lichaamsgewicht 150-200 g) door een intraperitoneale injectie van een natriumpentobarbital oplossing (50 mg natrium-pentobarbital / kg lichaamsgewicht).
- Plaats het dier in een roestvrijstalen pan en spuit 70% ethanol op zijn buik en thorax.
- Maak een klein sneetje en afschilferen van de huid. Open de buik van de snede met een schaar.
- Bevestig de locatie van de poortader, langs een chirurgische draad onder de poortader en losjes klomp.
- Clump het distale deel van de vena cava inferior en mesenteriale ader om bloed reflux te voorkomen in de lever. Open de borstholte door het snijden van het diafragma met een schaar, en bloot het hart.
- Plaats een plastic katheter (2 mm diameter) in de poortader en draai de draad stevig rond de katheter.
- Sluit de katheter om een perfusie systeem dat is geladen met wasoplossing (Ca 2 +-Mg 2 + gratis HBSS met 0,5 mM EGTA, 10 mM HEPES en 4,2 mM NaHCO 3, pH 7,2) voorverwarmd bij 37 ° C.
- Begin perfusie in situ met een snelheid van 10 ml / min. Op hetzelfde moment, maak een snede in de rechterboezem muur. Blijven perfusie gedurende 10 minuten.
- Schakel de perfusie oplossing voor collagenase oplossing [HBSS met 10 mM HEPES en 4.2mm NaHCO 3, aangevuld met Type I collagenase (0,05%) en trypsine-remmer (50 ug / ml); pH 7,5], en perfuseren voor 10 - 20 minuten bij een snelheid van 10 ml / min, totdat de lever zwelt een beetje en toont het teken voor de desintegratie van de lever structuur onder sereuze membraan.
2. Voorbereiding van parenchymale Hepatocyte-rijke Cell Fraction
- Verwijder voorzichtig de lever over in een steriele beker met 25 ml collagenase oplossing. Mince in kleine stukjes door de schaar.
- Voeg 75 ml koud MEM in de resulterende celsuspensie. Na de zachte pipetteren, filtraat door middel van een cel zeef (100 micrometer) om bindweefsel en onverteerd weefsel fragmenten te verwijderen.
- Breng het filtraat in 50 ml conische buizen en centrifugeer bij 50 xg gedurende 1 min bij 4 ° C (rem uit).
- Verwijder voorzichtig het supernatans. Resuspendeer de pellet met koud MEM.
- Herhalen 2.4) drie keer.
3. Gemengde Primaire Cultuur van de levercellen
- Hang de cellen verkregen in 2.5) in het groeimedium bestaat uit DMEM met 10% hitte-geïnactiveerd FCS, aangevuld met 100 uM β-mercapto-ethanol, 10 ug / ml insuline, 100 ug / ml streptomycine en 100 U / ml penicilline, en het zaad in vijf voor tien weefselkweek kolven (oppervlakte: 75 cm 2) bij een dichtheid van 6,7 x 10 4 cellen / cm 2 (5 x 10 6 cellen / fles / 12 -15 ml medium).
- Incubeer de cultuur flasksat 37 ° C in een atmosfeer van 5% CO 2 - 95% lucht.
- Vervang het groeimedium om de 2 tot 3 dagen intervallen.
4. Selectieve Isolatie van macrofagen
- Na 12 dagen van cultuur, macrofagen verspreiden op de cel vel. Deze cellen worden geschorst door wederkerige schudden van de cultuur kolven bij 80 tot 120 slagen per minuut gedurende 30 minuten bij 37 ° C.
- Overdracht het kweekmedium in 100 mm niet-weefselkweek bestemde plastic schaaltjes. Het zwembad van het medium uit twee T75 flessen in een plastic schaaltje. Refill cultuur kolven met het medium en stuur ze terug naar de incubator.
- Incubeer plastic schaaltjes gedurende 30 minuten bij 37 ° C in een atmosfeer van 5% CO 2 - 95% lucht. Macrofagen gemakkelijk hechten aan niet-weefselkweek bestemde plastic schaaltjes onder deze inleggen, terwijl andere contaminerende cellen niet.
- Zuig het medium en zacht spoel de plastic schotel met PBS. Herhaal deze stap drie keer.
- Voeg 1 ml van TrypLE Express-oplossing in de schaal, en incubeer gedurende 10 minuten bij 37 ° C in een atmosfeer van 5% CO 2 - 95% lucht.
- Voeg 9 ml van het groeimedium. Voorzichtig schrapen de bijgevoegde macrofagen door een cel schraper.
- Breng de celsuspensie in een 15 ml conische buis en centrifugeer op 180 xg gedurende 5 minuten bij 25 ° C (rem op).
- Verwijder het supernatant en voeg 1 ml van het groeimedium. Dissociëren in enkele cellen door krachtig pipetteren. Inventariseer het aantal cellen met een hemocytometer tellen.
- Isolatie stappen kunnen worden herhaald met dezelfde cultuur kolven twee tot drie dagen intervallen van meer dan twee weken.
- Geïsoleerde macrofagen kunnen worden gekweekt in het groeimedium wordt beschreven in 3.1.
5. Representatieve resultaten
Een voorbeeld van een gemengde primaire cultuur van volwassen ratten levercellen is weergegeven in figuur 2. Parenchymale hepatocyten verliest de epitheliale cel morfologie binnen een paar dagen in cultuur en gedegenereerde of transformeren tot fibroblast-achtige cellen.Dan, rond dag 6 tot 12 fase-contrast-heldere, ronde macrofaag-achtige cellen vigourouly prolifereren op de fibroblastische cel blad. Door schudden van de cultuur flacons, zijn macrofagen gemakkelijk opgehangen in het kweekmedium, en de daaropvolgende overdracht en incubatie in plastic borden leiden tot een selectieve hechting van macrofagen (figuur 3). De macrofaag-achtige cellen kunnen worden geoogst vanaf dag 8, en de nummers maximale niveaus bereikt over dag 12 tot 14. Meer dan 10 6 cellen kunnen worden geoogst uit een T75 cultuur fles herhaaldelijk op 2 tot 3 dagen voor de intervallen van meer dan twee weken, waarvan een totale cel opbrengst per fles van 10 7 per T75 cultuur kolf (figuur 3). De zuiverheden van de geïsoleerde macrofagen waren 95 tot 99%, zoals geëvalueerd door flowcytometrie of immunocytochemie met ratten macrofaag-specifieke antilichamen, zoals ED-1 (figuur 4), ED-3, OX-41 (figuur 4) en Iba1 9. de geïsoleerde cellen vertonen typische kenmerken van macrofagen, zoals actieve fagocytose van polystylene kralen (figuur 5), proliferatieve respons op recombinant GM-CSF, secretie van inflammatoire / anti-inflammatoire cytokines na stimulatie met LPS, en de vorming van meerkernige reuscellen 9.
Figuur 1. Een regeling voor selectieve isolatie en zuivering van macrofaag-achtige cellen uit gemengde primaire cultuur van de levercellen.
Figuur 2. Primaire cultuur van levercellen en de proliferatie van macrofaag-achtige cellen. Pijl geeft een multinucleaire gigantische cel. Schaalbalk = 100 micrometer. Overgenomen uit het Journal of immunologische methoden, Vol.360, 47-55 (2010) 9 met toestemming van Elsevier.
Figuur 3. Selectieve isolatie van macrofaag-achtige cellen door het schudden en gehechtheid methode. Cellen werden gesuspendeerd in het kweekmedium door schudden van de kolven, en vervolgens overgebracht in niet-weefselkweek bestemde plastic schaaltjes, en geïncubeerd bij 37 ° C. Zo vroeg als 10 min na plating, macrofaag-achtige cellen aan de schotel oppervlak, terwijl de andere contaminerende fibroblastische cellen bleven opgeschort. Na het spoelen met PBS, was een sterk gezuiverd macrofaag bevolking verkregen. Deze cellen opgedaan typische macrofaag morfologie na 40 min van de cultuur, en de mitotische cellen werden vaak waargenomen (pijlen). Latere wijzigingen in de cel aantallen hersteld van kolven op andere cultuur periodes worden weergegeven. Waarden zijn een gemiddelde ± SD drie tot vijf flessen. Experimenten werden drie keer herhaald en de gegevens worden aangegeven met verschillende symbolen. Schaalbalk = 100 micrometer. Overgenomen uit het Journal of immunologische methoden, Vol.360, 47-55 (2010) 9 met toestemming van Elsevier.
Figuur 4. Immunocytochemische kleuring van macrofaag-achtige cellen met monoklonale antilichamen tegen rat macrofagen.
Figuur 5. Fagocytose van FITC-gelabelde microbolletjes van macrofaag-achtige cellen.
Discussion
Hier melden wij een eenvoudige en efficiënte methode om macrofagen te verkrijgen van de gemengde primaire culturen van volwassen ratten levercellen. Onze methode berust eerst op de roman proliferatieve activiteit van macrofagen in de gemengde cultuur van levercellen, en vervolgens de daaropvolgende isolatie en zuivering van deze cellen op basis van hun biologische kenmerken als macrofagen 9. Het kan mogelijk zijn de macrofagen verspreidden zich in de gemengde primaire cultuur van volwassen levercellen kunnen afkomstig zijn van Kupffer of verwante cellen die besmet in de parenchymale hepatocyten fractie. De macrofagen zou hebben gereageerd op specifieke veranderingen in het milieu veroorzaakt door de transformatie van de parenchymale hepatocyt 10 en andere fibroblastische cellen in de gemengde primaire culturen.
Tot slot, onze methode biedt de isolatie van macrofaag-achtige cellen in voldoende aantal en de zuiverheid van de primaire cultuur van rat lever cellswithout met behulp van geavanceerde apparatuur en technische vaardigheden. Bovendien kan de isolatie procedure worden herhaald met dezelfde cultuur kolf gedurende meer dan twee weken. Deze methode zou kunnen worden voor andere zoogdieren.
Disclosures
Alle dieren werden gehouden en geëxploiteerd in het dier faciliteit in de National Institute of Animal Health, volgens de richtlijnen en verordeningen weer door het Comite van de instelling voor dierproeven.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door een onderzoekssubsidie en een Grant-in-Aid van het Voedsel-Nanotechnologie Project van het ministerie van Landbouw, Bosbouw en Visserij van Japan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium pentobarbital solution | Kyoritsu Seiyaku | Somnopentyl Injection | |
| Hank’s balanced salt solution (HBSS) | Invitrogen | 14185-052 | |
| Ethylene glycol tetraacetic acid(EGTA) | Sigma-Aldrich | E-4378 | |
| Collagenase | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 032-10534 | Cell dissociation grade (Lot check needed) |
| Trypsin inhibitor | Sigma-Aldrich | T-9128 | |
| Eagle’s minimum essential medium (MEM) | Sigma-Aldrich | M-4655 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM) | Sigma-Aldrich | D-6459 | High glucose-type |
| Fetal calf serum (FCS) | Hyclone | SH30070.03 | Heat inactivated at 56°C for 30 min. (Lot check needed) |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12605 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline (PBS) | Invitrogen | 14190 | Ca2+-Mg2+ free |
| β-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M-7522 | Stock: 100 mM in distilled water |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I-5500 | Stock: 10 mg/ml in 0.1N HCl |
| Penicillin/ streptomycin | Invitrogen | 15070 | |
| Cell strainer | BD Biosciences | 352360 | Mesh size: 100 μm |
| Tissue culture flask | Sumitomo Bakelite Co., Ltd. | MS-21250 | Surface area: 75 cm2 |
| Non-tissue culture plastic dishes | BD Biosciences | 351005 | |
| Cell scraper | Corning | 3010 | |
| Reciprocal shaker | TAITEC | NR-1 |
References
- Crispe, I. N. The liver as a lymphoid organ. Annu. Rev. Immunol. 27, 147-163 (2009).
- Roberts, R. A. Role of the Kupffer cell in mediating hepatic toxicity and carcinogenesis. Toxicol. Sci. 96, 2-15 (2007).
- Gao, B., Jeong, W. I., Tian, Z. Liver: An organ with predominant innate immunity. Hepatology. 47, 729-736 (2008).
- Janousek, J., Strmen, E., Gervais, F. Purification of murine Kupffer cells by centrifugal elutriation. J. Immunol. Methods. 164, 109-117 (1993).
- Olynyk, J. K., Clarke, S. L. Isolation and primary culture of rat Kupffer cells. J. Gastroenterol. Hepatol. 13, 842-845 (1998).
- Heuff, G., Meyer, S., Beelen, R. H. Isolation of rat and human Kupffer cells by a modified enzymatic assay. J. Immunol. Methods. 174, 61-65 (1994).
- Seglen, P. O. Preparation of isolated rat liver cells. Methods Cell Biol. 13, 29-83 (1976).
- Yoshioka, M. Primary culture and expression of cytokine mRNAs by lipopolysaccharide in bovine Kupffer cells. Vet. Immunol. Immunopathol. 58, 155-163 (1997).
- Kitani, H., Takenouchi, T., Sato, M., Yoshioka, M., Yamanaka, N. A novel isolation method for macrophage-like cells from mixed primary cultures of adult rat liver cells. J. Immunol. Methods. 360, 47-55 (2010).
- Gorrell,
