Summary
Un nuevo método para obtener los macrófagos de los cultivos primarios de células de hígado de rata se describe. Este método utiliza la proliferación de los macrófagos en la cultura, seguida de temblor en frascos de cultivo y la purificación por el apego selectivo para platos de plástico. Esta técnica proporciona de manera eficiente los macrófagos del hígado sin necesidad de equipo y habilidades complejas.
Abstract
Las células de Kupffer son el hígado específicos de los macrófagos residentes y juegan un papel importante en las funciones fisiológicas y patológicas del hígado 1-3. Aunque los métodos de aislamiento de los macrófagos del hígado han sido bien descritos por 4-6, la mayor parte de estos métodos requiere de equipo sofisticado, como un elutriador centrífuga y habilidades técnicas. En este sentido, proporcionar un nuevo método para obtener los macrófagos del hígado, en cantidad y pureza de la mezcla de cultivos primarios de células de hígado de rata adulta, como se ilustra esquemáticamente en la Figura 1.
Después de la disociación de las células del hígado en dos etapas método de perfusión 7,8, una fracción compuesta principalmente por los hepatocitos del parénquima se prepara y se sembró en frascos T75 de cultivo de tejidos con medio de cultivo compuesto por DMEM y 10% de los hepatocitos FCS.Parenchymal perder la morfología de las células epiteliales dentro de unos días en la cultura, degenerada o transformarse en células similares a fibroblastos (Figura 2). A medida que avanza la cultura, alrededor del día 6, de contraste de fase brillante, redondo como los macrófagos-células comienzan a proliferar en la lámina de células fibroblastos (Figura 2). El crecimiento de las células como los macrófagos-continuar y llegar a los niveles máximos alrededor del día 12, que cubre la capa celular en la superficie del frasco. Por agitación de los frascos de cultivo, los macrófagos son fácilmente suspendidas en el medio de cultivo. Posterior traslado e incubación corto en el resultado platos de plástico en la adhesión selectiva de los macrófagos (Figura 3), donde, como otras células contaminantes permanecen suspendidas. Después de varios lavados con PBS, los macrófagos adjunta se recogen. Más de 10 6 células pueden ser cosechadas varias veces de la misma T75 frasco de cultivo de tejidos de dos a intervalos de tres días por más de dos semanas (Figura 3). Las purezas de los macrófagos aislados de 95 a 99%, tal como se evaluó por citometría de flujo o inmunocitoquímica con ratas macrófagos anticuerpos específicos (Figura 4). Las células aisladas muestran fagocitosis activa de cuentas polystylene (Figura 5), la respuesta proliferativa a GM-CSF recombinante, la secreción de antiinflamatorios / anti-citoquinas inflamatorias a la estimulación con LPS, y la formación de células gigantes multinucleadas 9.
En conclusión, nos proporcionan un método simple y eficiente para obtener los macrófagos del hígado, en cantidad y pureza, sin un equipo complejo y skills.This método podría ser aplicable a otras especies de mamíferos.
Protocol
1. La perfusión del hígado
- Anestesiar a un macho adulto de rata Sprague-Dawley (de 10 a 15 semanas de edad, peso corporal 150-200 g) mediante una inyección intraperitoneal de una solución de pentobarbital sódico (50 mg de sodio pentobarbital / kg de peso corporal).
- Colocar el animal en un recipiente de acero y gas etanol al 70% en el abdomen y el tórax.
- Hacer un pequeño corte y retire la piel. Abrir el abdomen por el corte con una tijera.
- Confirmar la ubicación de la vena porta, pasar un hilo quirúrgico en la vena porta y se agrupan libremente.
- Grupo la parte distal de la vena cava inferior y la vena mesentérica para prevenir el reflujo de sangre hacia el hígado. Abrir la cavidad torácica por el diafragma de corte con las tijeras, y exponer el corazón.
- Insertar un catéter de plástico (2 mm de diámetro) en la vena porta y apretar firmemente el hilo alrededor del catéter.
- Conectar el catéter a un sistema de perfusión que se carga con solución de lavado (Ca 2 +-Mg 2 + libre HBSS que contenía 0,5 mM EGTA, 10 mM HEPES y 4,2 mM NaHCO 3, pH 7.2) previamente calentada a 37 ° C.
- Comenzar la perfusión in situ a una velocidad de 10 ml / min. Al mismo tiempo, hacer un corte en la pared de la aurícula derecha. Continuar la perfusión durante 10 minutos.
- Cambie la solución de perfusión a la solución de colagenasa [HBSS que contiene HEPES 10 mM y 4,2 mm de NaHCO3 complementados con colagenasa tipo I (0,05%) y los inhibidores de tripsina (50 ug / ml), pH 7.5], y la perfusión de 10 a 20 minutos a una velocidad de 10 ml / min hasta que el hígado se inflama y se muestra un poco el signo de la desintegración de la estructura del hígado debajo de la membrana serosa.
2. Preparación de la fracción del parénquima celular de hepatocitos ricos
- Retire con cuidado la transferencia del hígado en un vaso estéril que contiene 25 ml de solución de colagenasa. Picar en trozos pequeños con tijeras.
- Añadir 75 ml de MEM frío en la suspensión celular resultante. Después de pipeteo suave, filtrado a través de un colador celular (100 m) para eliminar los tejidos conectivos y los fragmentos de tejido sin digerir.
- Transferir el filtrado en tubos de 50 ml y se centrifuga a 50 g durante 1 min a 4 ° C (freno desactivado).
- Elimine con cuidado el sobrenadante. Resuspender el precipitado con el MEM frío.
- Repita 2,4) tres veces.
3. Cultura mixta primaria de las células hepáticas
- Suspender las células obtenidas en 2.5) en el medio de cultivo compuesto por DMEM con 10% de FCS inactivado por calor, suplementado con 100 mM β-mercaptoetanol, 10 mg / ml de insulina, 100 ug / ml de estreptomicina y 100 U de penicilina / ml, y la semilla en nueve y cincuenta y cinco frascos de cultivo de tejido (con una superficie: 75 cm 2) a una densidad de 6,7 x 10 4 células / cm 2 (5 x 10 6 células / frasco / 12 ml -15 de media).
- Incubar la cultura flasksat 37 ° C en una atmósfera de 5% de CO 2 a 95% de aire.
- Vuelva a colocar el medio de cultivo cada 2 ó 3 intervalos de días.
4. Aislamiento selectivo de los macrófagos
- Después de 12 días de cultivo, los macrófagos proliferan en la capa celular. Estas células son suspendidas por mutuo temblor de los frascos de cultivo de 80 a 120 golpes por minuto durante 30 minutos a 37 ° C.
- Transferencia al medio de cultivo en 100 mm no de cultivo de tejido de plástico platos grado. Piscina del medio a partir de dos frascos T75 en un plato de plástico. Frascos de rellenar la cultura con el medio de cultivo y devolverlos a la incubadora.
- Incubar los platos de plástico por 30 minutos a 37 ° C en una atmósfera de 5% de CO 2 a 95% de aire. Macrófagos fácilmente se adhieren a los platos de cultivo de tejidos no de plástico de grado en este proceso de incubación, mientras que otras células contaminantes no.
- Aspirar el medio y enjuague suavemente el plato de plástico con PBS. Repita este paso tres veces.
- Añadir 1 ml de solución TrypLE Express en el plato, y se incuba durante 10 minutos a 37 ° C en una atmósfera de 5% de CO 2 a 95% de aire.
- Añadir 9 ml del medio de cultivo. Raspe suavemente los macrófagos unida por un rascador de células.
- La transferencia de la suspensión de células en un tubo cónico de 15 ml y centrifugar a 180 xg durante 5 min a 25 ° C (freno).
- Eliminar el sobrenadante y añadir 1 ml de medio de cultivo. Se disocian en células individuales mediante pipeteo vigoroso. Enumerar el número de células por un hemocitómetro de conteo.
- Medidas de aislamiento se puede repetir con los frascos de cultivo mismo de dos a intervalos de tres días por más de dos semanas.
- Macrófagos aislados pueden ser cultivados en el medio de cultivo se describen en 3.1.
5. Resultados representante
Un ejemplo de una cultura mixta primaria de adultos células de hígado de rata se muestra en la Figura 2. Hepatocitos del parénquima perder la morfología de las células epiteliales dentro de unos días en la cultura, degenerada o transformarse en células similares a fibroblastos.Luego, alrededor del día 6 al 12 de contraste de fase brillante, redondo como los macrófagos-células vigourouly proliferan en la lámina de células de fibroblasto. Por agitación de los frascos de cultivo, los macrófagos son fácilmente suspendidas en el medio de cultivo, y la posterior transferencia e incubación en platos de plástico resultar en una adhesión selectiva de los macrófagos (Figura 3). Las células como los macrófagos-se puede cosechar a partir del día 8, y el número llegó a niveles máximos en los días de 12 a 14. Más de 10 6 células se pueden cosechar en un frasco de cultivo T75 repetidamente de 2 a 3 días a intervalos de más de dos semanas, lo que permite un rendimiento total de células por frasco de frasco de cultivo de 10 7 por T75 (Figura 3). La pureza de los macrófagos aislados de 95 a 99%, según lo evaluado por citometría de flujo o inmunocitoquímica con ratas macrófagos anticuerpos específicos, tales como ED-1 (Figura 4), ED-3, OX-41 (Figura 4) y 9 Iba1. Las células aisladas muestran características típicas de los macrófagos, como la fagocitosis activa de cuentas polystylene (Figura 5), la respuesta proliferativa a GM-CSF recombinante, la secreción de antiinflamatorios / anti-citoquinas inflamatorias a la estimulación con LPS, y la formación de células gigantes multinucleadas 9.
Figura 1. Un esquema para el aislamiento selectivo y la purificación de los macrófagos-células de cultivo mixto primarios de células de hígado de rata.
Figura 2. Cultivo primario de células de hígado de rata y la proliferación de los macrófagos-células. La flecha indica una célula gigante multinuclear. Barra de escala = 100 micras. Reimpresión de la Revista de Métodos inmunológicos, Vol.360, 47-55 (2010) 9, con permiso de Elsevier.
Figura 3. Aislamiento selectivo de los macrófagos-células de la agitación y el método de fijación. Las células fueron suspendidas en el medio de cultivo agitando los frascos, posteriormente trasladados en cajas de no cultivo de tejidos de plástico de grado, y se incuba a 37 ° C. A los 10 min después de la siembra, como los macrófagos-células pegadas a la superficie del plato, mientras que otras contaminación de las células fibroblásticas quedó suspendida. Después de lavar con PBS, una población de macrófagos altamente purificada se obtuvo. Estas células ganó la morfología típica de los macrófagos después de 40 min de la cultura, y las células mitóticas se observaron con frecuencia (flechas). Los cambios posteriores en el número de células recuperadas de los frascos en los períodos de cultura diferente se muestran. Los valores son un promedio ± SD desde tres hasta cinco frascos. Los experimentos se repitieron tres veces y los datos se indican con símbolos diferentes. Barra de escala = 100 micras. Reimpresión de la Revista de Métodos inmunológicos, Vol.360, 47-55 (2010) 9, con permiso de Elsevier.
Figura 4. Coloración inmunocitoquímica de los macrófagos-células con anticuerpos monoclonales contra los macrófagos de rata.
Figura 5. Fagocitosis de FITC microesferas por los macrófagos-células.
Discussion
Aquí, se presenta un método simple y eficiente para obtener los macrófagos de la mezcla de culturas primarias de adultos células de hígado de rata. Nuestro método se basa primero en la novedosa actividad proliferativa de macrófagos en el cultivo mixto de células de hígado de rata, y posterior aislamiento y purificación de estas células sobre la base de sus características biológicas como los macrófagos 9. Puede ser posible que los macrófagos proliferan en el cultivo mixto primarios de células de hígado en adultos podría haberse originado a partir de Kupffer o las células relacionadas que contaminó en la fracción del parénquima hepatocitos. Los macrófagos podrían haber respondido a determinados cambios ambientales provocados por la transformación de las células del parénquima hepatocitos fibroblástica 10 y otros en los cultivos primarios mixtos.
En conclusión, el método proporciona un aislamiento de los macrófagos-células en cantidad suficiente y la pureza del cultivo primario de hígado de rata cellswithout utilizando sofisticados equipos y conocimientos técnicos. Además, el procedimiento de aislamiento se puede repetir con el mismo frasco de cultivo por más de dos semanas. Este método podría ser aplicable a otras especies de mamíferos.
Disclosures
Todos los animales fueron mantenidos y operados en las instalaciones de los animales en el Instituto Nacional de Salud Animal, de acuerdo con las directrices y regulaciones establecidas por el Comité de la Institución para los experimentos con animales.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por una beca de investigación y una beca en la ayuda del Proyecto de Nanotecnología de Alimentos del Ministerio de Agricultura, Silvicultura y Pesca de Japón.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium pentobarbital solution | Kyoritsu Seiyaku | Somnopentyl Injection | |
| Hank’s balanced salt solution (HBSS) | Invitrogen | 14185-052 | |
| Ethylene glycol tetraacetic acid(EGTA) | Sigma-Aldrich | E-4378 | |
| Collagenase | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 032-10534 | Cell dissociation grade (Lot check needed) |
| Trypsin inhibitor | Sigma-Aldrich | T-9128 | |
| Eagle’s minimum essential medium (MEM) | Sigma-Aldrich | M-4655 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM) | Sigma-Aldrich | D-6459 | High glucose-type |
| Fetal calf serum (FCS) | Hyclone | SH30070.03 | Heat inactivated at 56°C for 30 min. (Lot check needed) |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12605 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline (PBS) | Invitrogen | 14190 | Ca2+-Mg2+ free |
| β-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M-7522 | Stock: 100 mM in distilled water |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I-5500 | Stock: 10 mg/ml in 0.1N HCl |
| Penicillin/ streptomycin | Invitrogen | 15070 | |
| Cell strainer | BD Biosciences | 352360 | Mesh size: 100 μm |
| Tissue culture flask | Sumitomo Bakelite Co., Ltd. | MS-21250 | Surface area: 75 cm2 |
| Non-tissue culture plastic dishes | BD Biosciences | 351005 | |
| Cell scraper | Corning | 3010 | |
| Reciprocal shaker | TAITEC | NR-1 |
References
- Crispe, I. N. The liver as a lymphoid organ. Annu. Rev. Immunol. 27, 147-163 (2009).
- Roberts, R. A. Role of the Kupffer cell in mediating hepatic toxicity and carcinogenesis. Toxicol. Sci. 96, 2-15 (2007).
- Gao, B., Jeong, W. I., Tian, Z. Liver: An organ with predominant innate immunity. Hepatology. 47, 729-736 (2008).
- Janousek, J., Strmen, E., Gervais, F. Purification of murine Kupffer cells by centrifugal elutriation. J. Immunol. Methods. 164, 109-117 (1993).
- Olynyk, J. K., Clarke, S. L. Isolation and primary culture of rat Kupffer cells. J. Gastroenterol. Hepatol. 13, 842-845 (1998).
- Heuff, G., Meyer, S., Beelen, R. H. Isolation of rat and human Kupffer cells by a modified enzymatic assay. J. Immunol. Methods. 174, 61-65 (1994).
- Seglen, P. O. Preparation of isolated rat liver cells. Methods Cell Biol. 13, 29-83 (1976).
- Yoshioka, M. Primary culture and expression of cytokine mRNAs by lipopolysaccharide in bovine Kupffer cells. Vet. Immunol. Immunopathol. 58, 155-163 (1997).
- Kitani, H., Takenouchi, T., Sato, M., Yoshioka, M., Yamanaka, N. A novel isolation method for macrophage-like cells from mixed primary cultures of adult rat liver cells. J. Immunol. Methods. 360, 47-55 (2010).
- Gorrell,
