एक सरल और कुशल वयस्क जिगर की कोशिकाओं के मिश्रित प्राथमिक संस्कृति से मैक्रोफेज पृथक विधि

Summary

चूहा जिगर की कोशिकाओं के प्राथमिक संस्कृति से मैक्रोफेज प्राप्त करने के एक उपन्यास विधि वर्णित है. इस विधि इस्तेमाल संस्कृति में मैक्रोफेज के प्रसार, चयनात्मक लगाव संस्कृति बोतल और शुद्धि के द्वारा प्लास्टिक के बर्तन करने के लिए झटकों से पीछा. इस तकनीक कुशलतापूर्वक जटिल उपकरणों और कौशल के बिना जिगर मैक्रोफेज प्रदान करता है.

Protocol

1. जिगर के छिड़काव

1. सोडियम pentobarbital समाधान (50 मिलीग्राम सोडियम pentobarbital / किलोग्राम शरीर के वजन) की एक intraperitoneal इंजेक्शन के द्वारा, एक वयस्क पुरुष चूहा Sprague Dawley (शरीर के वजन 150-200 ग्राम 10 से 15 सप्ताह पुरानी) anesthetize.
2. एक स्टेनलेस पैन में पशु प्लेस और अपने पेट और छाती पर 70% इथेनॉल स्प्रे.
3. एक छोटे से काट और त्वचा छील. कैंची की एक जोड़ी के साथ कटौती से पेट खोलें.
4. पोर्टल शिरा के स्थान की पुष्टि करने के लिए, पोर्टल शिरा और शिथिल पेड़ों का झुरमुट के तहत एक शल्य धागा पास.
5. अवर रग Cava और जिगर में खून भाटा को रोकने के mesenteric नस के बाहर का हिस्सा पेड़ों का झुरमुट. कैंची के साथ डायाफ्राम काटने से वक्ष गुहा खोलें, और दिल को बेनकाब.
6. पोर्टल नस में एक प्लास्टिक कैथेटर (2 मिमी व्यास) डालें और धागा कैथेटर चारों ओर मजबूती से कस.
7. 37 में prewarmed डिग्री सेल्सियस, एक छिड़काव प्रणाली है जो धोने (7.2 ^पीएच 2 ^Ca + ^{मिलीग्राम 2} + मुक्त HBSS युक्त 0.5 मिमी EGTA, 10 मिमी HEPES और 4.2 मिमी _NaHCO 3) समाधान के साथ भरी हुई है कैथेटर कनेक्ट
8. बगल में 10 मिलीग्राम / मिनट की दर से छिड़काव शुरू करो. एक ही समय पर, सही atrium दीवार में कटौती करने के. 10 मिनट के लिए छिड़काव जारी रखें.
9. स्विच छिड़काव collagenase समाधान के लिए समाधान [10mm HEPES और 4.2mM NaHCO ₃ प्रकार के साथ पूरक युक्त HBSS मैं collagenase (0.05%) और trypsin अवरोध करनेवाला (50 μg / मिलीलीटर), पीएच 7.5] के लिए 10 perfuse और एक दर पर 20 मिनट से 10 मि.ली. / मिनट तक जिगर थोड़ा पहुँच जाती है और तरल झिल्ली के तहत जिगर संरचना के विघटन के लिए हस्ताक्षर से पता चलता है.

2. Parenchymal hepatocyte अमीर सेल भिन्न की तैयारी

1. निकालें और ध्यान से एक बाँझ collagenase समाधान के 25 मिलीलीटर युक्त बीकर में जिगर हस्तांतरण. कैंची द्वारा छोटे - छोटे टुकड़ों में क़ीमा.
2. परिणामी कक्ष निलंबन में ठंड सदस्य के 75 मिलीलीटर जोड़ें. कोमल pipetting के बाद, छानना एक सेल झरनी (100 सुक्ष्ममापी) के माध्यम से संयोजी ऊतक और पचाया नहीं ऊतक टुकड़े को दूर करने के लिए.
3. 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूबों और अपकेंद्रित्र में 4 डिग्री सेल्सियस (ब्रेक बंद) पर 1 मिनट के लिए 50 XG पर छानना स्थानांतरण.
4. ध्यान से सतह पर तैरनेवाला त्यागने. ठंड के सदस्य के साथ गोली Resuspend.
5. दोहराएँ 2.4) तीन बार.

3. जिगर की कोशिकाओं के मिश्रित प्राथमिक संस्कृति

1. विकास DMEM 10% गर्मी निष्क्रिय FCS में 100 सुक्ष्ममापी β-mercaptoethanol, 10 इंसुलिन / μg मिलीलीटर, 100 स्ट्रेप्टोमाइसिन μg / मिलीग्राम और 100 यू / मिलीलीटर पेनिसिलिन, और बीज के साथ पूरक युक्त बना मध्यम 2.5 में प्राप्त कोशिकाओं) में निलंबित 6.7 x 10 ⁴ कोशिकाओं / ² सेमी (5 x 10 ⁶ कोशिकाओं / फ्लास्क मध्यम / 12 -15 मिलीलीटर) की एक घनत्व: पांच से दस टिशू कल्चर बोतल (75 ² सेमी की सतह क्षेत्र) .
2. संस्कृति सेते 37 flasksat ° 5% सीओ ₂ के माहौल में सी - 95% हवा.
3. विकास मध्यम हर 2 से 3 दिनों के अंतराल बदलें.

4. मैक्रोफेज के चयनात्मक अलगाव

1. संस्कृति के 12 दिनों के के बाद, मैक्रोफेज सेल पत्रक पर पैदा करना. पारस्परिक द्वारा इन कोशिकाओं को निलंबित कर रहे हैं, 80 में संस्कृति बोतल की मिलाते - 37 में 30 मिनट के लिए 120 प्रति मिनट स्ट्रोक डिग्री सेल्सियस
2. 100 मिमी गैर टिशू कल्चर ग्रेड प्लास्टिक के बर्तन में संस्कृति के माध्यम से स्थानांतरण. दो T75 बोतल से एक प्लास्टिक पकवान में मध्यम पूल. मध्यम विकास और के साथ फिर से भरना संस्कृति बोतल उन्हें इनक्यूबेटर पर लौटने के लिए.
3. 30 मिनट के लिए 37 प्लास्टिक के बर्तन सेते ° 5% सीओ ₂ के माहौल में सी - 95% हवा. मैक्रोफेज आसानी से इस ऊष्मायन प्रक्रिया के तहत गैर - ऊतक संस्कृति ग्रेड प्लास्टिक के बर्तन करने के लिए देते हैं, जबकि अन्य contaminating कोशिकाओं नहीं है.
4. Aspirate मध्यम और धीरे पीबीएस के साथ प्लास्टिक पकवान कुल्ला. इस कदम को तीन बार दोहराएँ.
5. डिश में TrypLE एक्सप्रेस समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ें, और 37 में 10min के लिए सेते ° _5% सीओ 2 के माहौल में सी - 95% हवा .
6. मध्यम विकास के 9 मिलीलीटर जोड़ें. धीरे से एक सेल खुरचनी द्वारा संलग्न मैक्रोफेज परिमार्जन.
7. एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार और 25 से कम 5 डिग्री सेल्सियस (ब्रेक) मिनट के लिए 180 XG ट्यूब अपकेंद्रित्र में सेल निलंबन स्थानांतरण.
8. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और मध्यम विकास के 1 मिलीलीटर जोड़ने. जोरदार pipetting द्वारा एकल कक्षों में अलग कर देना. सेल नंबर एक hemocytometer की गणना के द्वारा की गणना करें.
9. अलगाव चरणों का अधिक से अधिक दो सप्ताह के लिए दो से तीन दिन के अंतराल पर एक ही संस्कृति बोतल के साथ दोहराया जा सकता है.
10. पृथक मैक्रोफेज वृद्धि 3.1 में वर्णित मध्यम में संवर्धित किया जा सकता है है.

5. प्रतिनिधि परिणाम

वयस्क चूहे जिगर की कोशिकाओं के एक मिश्रित प्राथमिक संस्कृति का एक उदाहरण चित्रा 2 में दिखाया गया है. Parenchymal hepatocytes संस्कृति में कुछ दिनों के भीतर उपकला सेल आकारिकी खो पतित, या fibroblast - तरह कोशिकाओं में बदलना.फिर, दिन भर में 6 से 12, चरण विपरीत उज्ज्वल, गोल बृहतभक्षककोशिका कोशिकाओं की तरह vigourouly fibroblastic सेल पत्रक पर पैदा करना. संस्कृति बोतल की मिलाते मैक्रोफेज मध्यम संस्कृति में आसानी से निलंबित कर रहे हैं, और बाद में और प्लास्टिक के बर्तन में हस्तांतरण ऊष्मायन मैक्रोफेज की चुनिंदा आसंजन (चित्रा 3) में परिणाम. बृहतभक्षककोशिका की तरह कोशिकाओं को 8 दिन के रूप में जल्दी के रूप में काटा जा सकता है, और संख्या 12 करने के लिए 14 दिन पर अधिक से अधिक स्तर पर पहुंच गया. 10 से अधिक ⁶ कोशिकाओं T75 संस्कृति कुप्पी से काटा जा सकता है बार बार 2 से 3 दिन के अंतराल पर दो सप्ताह से ^अधिक के लिए, 7 10 T75 प्रति संस्कृति फ्लास्क (चित्रा 3) के एक फ्लास्क प्रति कुल सेल उपज को सक्षम. पृथक मैक्रोफेज के purities 95 99%, के रूप में flowcytometry या चूहे जैसे प्रवर्तन निदेशालय (चित्रा 4)-1, प्रवर्तन निदेशालय-3, बैल-41 (चित्रा ⁴⁾ और 9 Iba1. बृहतभक्षककोशिका विशेष एंटीबॉडी के साथ immunocytochemistry द्वारा मूल्यांकन थे अलग कक्षों मैक्रोफेज polystylene मोतियों की सक्रिय phagocytosis (चित्रा 5), पुनः संयोजक जीएम-CSF, भड़काऊ / विरोधी भड़काऊ साइटोकिन्स की LPS साथ उत्तेजना, और multinucleated विशाल ⁹ कोशिकाओं के गठन पर स्राव proliferative प्रतिक्रिया जैसे विशिष्ट विशेषताओं, दिखाते हैं.

चित्रा 1 चयनात्मक और चूहा जिगर की कोशिकाओं के मिश्रित प्राथमिक संस्कृति से बृहतभक्षककोशिका कोशिकाओं की तरह के अलगाव की शुद्धि के लिए एक योजना है.

चित्रा 2 चूहा जिगर की कोशिकाओं और बृहतभक्षककोशिका की तरह कोशिकाओं के प्रसार के प्राथमिक संस्कृति. एरो एक multinuclear विशाल कक्ष को इंगित करता है. स्केल बार = 100 सुक्ष्ममापी. रोग प्रतिरक्षण तरीके के जर्नल Vol.360, 47-55 (2010) Elsevier से अनुमति के साथ ⁹ से Reprinted.

चित्रा 3 मिलाते और अनुलग्नक विधि द्वारा बृहतभक्षककोशिका की तरह कोशिकाओं के चयनित अलगाव. कक्ष बोतल मिलाते द्वारा संस्कृति के माध्यम में निलंबित कर दिया गया, बाद में गैर - टिशू कल्चर के ग्रेड प्लास्टिक के बर्तन में स्थानांतरित, और 37 डिग्री सेल्सियस पर incubated चढ़ाना के बाद के रूप में जल्दी के रूप में 10 मिनट, बृहतभक्षककोशिका की तरह पकवान की सतह से जुड़ी है, जबकि अन्य contaminating fibroblastic कोशिकाओं निलंबित बने रहे कोशिकाओं. पीबीएस के साथ rinsing के बाद, एक उच्च शुद्ध बृहतभक्षककोशिका आबादी प्राप्त हुई थी. इन कोशिकाओं को संस्कृति के 40 मिनट के बाद ठेठ बृहतभक्षककोशिका आकारिकी प्राप्त की, और mitotic कोशिकाओं अक्सर (तीर) मनाया गया. सेल नंबर में बाद में परिवर्तन अलग संस्कृति समय पर बोतल से बरामद दिखाए जाते हैं. मान औसतन ± तीन से पांच बोतल के लिए एसडी हैं. प्रयोगों से तीन बार दोहराया गया और डेटा को विभिन्न प्रतीकों द्वारा संकेत कर रहे हैं. स्केल बार = 100 सुक्ष्ममापी. रोग प्रतिरक्षण तरीके के जर्नल Vol.360, 47-55 (2010) Elsevier से अनुमति के साथ ⁹ से Reprinted.

चित्रा 4 बृहतभक्षककोशिका की तरह चूहे मैक्रोफेज के खिलाफ मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं के Immunocytochemical धुंधला हो जाना .

चित्रा 5 बृहतभक्षककोशिका की तरह कोशिकाओं द्वारा FITC लेबल microbeads के phagocytosis.

Discussion

यहाँ, हम एक सरल और कुशल विधि वयस्क चूहे जिगर की कोशिकाओं के मिश्रित प्राथमिक संस्कृतियों से मैक्रोफेज प्राप्त रिपोर्ट. हमारी विधि मैक्रोफेज के उपन्यास proliferative गतिविधि पर पहला चूहा जिगर की कोशिकाओं की मिश्रित संस्कृति में, निर्भर करता है और फिर बाद अलगाव और ⁹ मैक्रोफेज के रूप में उनके जैविक विशेषताओं के आधार पर इन कोशिकाओं की शुद्धि. यह संभव हो सकता है वयस्क जिगर की कोशिकाओं के मिश्रित प्राथमिक संस्कृति में proliferated मैक्रोफेज Kupffer या संबंधित कोशिकाओं है कि parenchymal hepatocytes अंश में दूषित से उत्पन्न हो सकता है हो सकता है. मैक्रोफेज विशिष्ट पर्यावरण parenchymal मिश्रित प्राथमिक संस्कृतियों में hepatocyte ¹⁰ और अन्य fibroblastic कोशिकाओं के परिवर्तन के कारण परिवर्तन करने के लिए जवाब हो सकता है है .

अंत में, हमारे विधि पर्याप्त संख्या और चूहा जिगर cellswithout के प्राथमिक संस्कृति अत्याधुनिक उपकरण और तकनीकी कौशल का उपयोग कर से पवित्रता में बृहतभक्षककोशिका की तरह कोशिकाओं के अलगाव प्रदान करता है. इसके अलावा, अलगाव की प्रक्रिया अधिक से अधिक दो सप्ताह के लिए एक ही संस्कृति फ्लास्क के साथ दोहराया जा सकता है. इस विधि अन्य स्तनधारी प्रजातियों के लिए लागू हो सकता है.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium pentobarbital solution	Kyoritsu Seiyaku	Somnopentyl Injection
Hank’s balanced salt solution (HBSS)	Invitrogen	14185-052
Ethylene glycol tetraacetic acid(EGTA)	Sigma-Aldrich	E-4378
Collagenase	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	032-10534	Cell dissociation grade (Lot check needed)
Trypsin inhibitor	Sigma-Aldrich	T-9128
Eagle’s minimum essential medium (MEM)	Sigma-Aldrich	M-4655
Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM)	Sigma-Aldrich	D-6459	High glucose-type
Fetal calf serum (FCS)	Hyclone	SH30070.03	Heat inactivated at 56°C for 30 min. (Lot check needed)
TrypLE Express	Invitrogen	12605
Dulbecco’s phosphate buffered saline (PBS)	Invitrogen	14190	Ca2+-Mg2+ free
β-mercapt–thanol	Sigma-Aldrich	M-7522	Stock: 100 mM in distilled water
Insulin	Sigma-Aldrich	I-5500	Stock: 10 mg/ml in 0.1N HCl
Penicillin/ streptomycin	Invitrogen	15070
Cell strainer	BD Biosciences	352360	Mesh size: 100 μm
Tissue culture flask	Sumitomo Bakelite Co., Ltd.	MS-21250	Surface area: 75 cm2
Non-tissue culture plastic dishes	BD Biosciences	351005
Cell scraper	Corning	3010
Reciprocal shaker	TAITEC	NR-1