In-vivo Zwei-Photonen-Mikroskopie einzelner Nervenenden in der Haut

Summary

Das Protokoll für die dynamische Längs Bildgebung und Selective Laser Läsion des Nervenenden in Reporter-transgenen Mäusen wird vorgestellt.

Abstract

Nervenenden in der Haut sind in physiologischen Prozessen wie Abfühlen ¹ als auch in pathologischen Prozessen, wie neuropathischem Schmerz ² beteiligt. Ihre enge-Boden-Positionierung erleichtert mikroskopischen Abbildung von Hautnervenenden in lebenden intakten Tier. Mit Multiphotonen-Mikroskopie ist es möglich, feine Bilder Überwindung des Problems der starken Lichtstreuung des Hautgewebes zu erhalten. Reporter transgenen Mäusen, die EYFP unter der Kontrolle der Thy-1-Promotor in Neuronen (einschließlich Peripherie sensorischen Neuronen) exprimieren, sind für die Längsschnittstudien von einzelnen Nervenenden über längere Zeit gut geeignet bis zu mehreren Monaten oder sogar lebenslang. Außerdem wurde unter Verwendung der gleichen Femtosekundenlaser für die Bildverarbeitung, ist es möglich, hochselektive Läsionen der Nervenfasern für die Studien der Nervenfaser Umstrukturierung erzeugen. Hier, in-vivo-Bildgebung stellen wir ein einfaches und zuverlässiges Protokoll für Mehrphotonen und Längslaserbasierte Mikrochirurgie auf der Haut von Mäusen Nervenenden.

Introduction

Kutanen Nervenenden unterziehen dynamischen Veränderungen unter verschiedenen pathophysiologischen Zuständen. Nervenfasern können durch den Prozess der Degeneration und Regeneration oder Umstrukturierung im Zuge von Krankheiten wie periphere Neuropathie ² oder Morton-Neurom ³ gehen. Nach einer traumatischen Verletzung, ein wichtiger Bestandteil der Nervenenden in der Haut ist Dynamik reinnervation des beschädigten Bereichs. , Ist der gemeinsame Ansatz zur Untersuchung von Nervenenden jedoch ex vivo histologische Schnitte, die Echtzeit-Informationen über die laufenden Prozesse ⁴ fehlt. Verwendung genetisch kodierte Fluoreszenzmarker, ist es möglich, die Nervenenden in der Haut von lebenden Tieren zu verfolgen, wodurch man reich und deutlich mehr relevante Informationen über die strukturellen Veränderungen. Die Untersuchung der kutanen Nervenenden ist möglich mit herkömmlichen Fluoreszenzmikroskopie jedoch die starke Lichtstreuung des Hautgewebes stark untergräbt die Qualitätder Daten erworben ^5. Multiphotonenmikroskopie ermöglicht die Erfassung von Bildern mit hoher Auflösung in den stark streuenden Gewebe durch die nicht-lineare Summierung der Energie der Anregungslichtphotonen was zur Emission von Fluoreszenz nur von dem Brennpunkt des Objektivs. Dieser Effekt führt zu einer robusten Zunahme der Eindringtiefe und die Verbesserung des Signal-zu-Rausch-Verhältnis bei der Messung der Hautgewebe ^6. Unter Verwendung des gleichen Lasers, wie für die Bildgebung, ist es möglich, eine selektive Zerlegung der Nervenfasern ⁷ herzustellen. In dem folgenden Protokoll zeigen wir die Methode der Längs Imaging von Hautnervenenden in vivo in transgenen Mäusen Reporter kombiniert mit selektiven Laser-Läsion mit kommerziell erhältlichen Multiphotonen-Mikroskop-System.

Protocol

Verfahren, die tierischen Patienten haben von der Nationalen Tierexperimentierboard, Finnland zugelassen.

1. Vorbereitung der Tiere für Imaging

1. Betäuben eine Maus durch intraperitional (IP) Injektion von Ketamin (0,08 mg pro Körpergewicht) und Xylazin (0,01 mg pro Körpergewicht). Überprüfen Sie die Narkose mit dem hinteren Fuß Prise Reflex.
2. Tauchen Augen Tieres in Augentropfen (Viscotears), um die Augen vor dem Austrocknen zu schützen.
3. Sie mit der Maus auf einem Heizkissen (Supertech) bei 37 ° C Unterkühlung zu verhindern.
4. Reinigen Sie die für die Bildgebung mit 70% Ethanol bezeichnet Fuß-Pad.
5. Fügen Sie einen Tropfen Wasser auf der Haut des Fuß-Pad für den Tauch Kopplung zwischen Haut und Deckglas.
6. Setzen Kunststoffverpackungsmaterial unter der Hinterpfote, die unter einem Metallring mit Abdeckung Klasse positioniert ist.
7. Stellen Sie die Dicke der Kunststoffverpackungsmaterial, um die Haut zu glätten.
8. Geben Sie einen Tropfen Wasser auf den Deckglass für das Eintauchen zwischen Deckglas und dem Ziel.

2. Metall Fixateur Ring Vorbereitung

1. Für die Stabilisierung der Haut nutzen die Metall Fixateur. Wir verwenden das Gemeinschaftsgeschmacksmuster geschützt zweiflügelige Fixateur mit einem Metallring (mit freundlicher Genehmigung von Neurotar Ltd, Finnland). Füllen Sie die Spritze mit Sekundenkleber, legte die kleinen Tropfen Sekundenkleber durch die Nadel auf dem Ring und sanft verteilen Sie den Kleber für gleichmäßige Abdeckung der Ringfläche. Es ist wichtig, die minimale Menge von Klebstoff, der nur für eine gleichmäßige Abdeckung benötigt wird gesetzt, da eine zu hohe Menge an Klebstoff kann das Feld der Ansicht zu verkleinern und behindert nachfolgende Bilderzeugung.
   HINWEIS: Alternativ kann die Kombination aus einem Metallstab (von unten) und Standard-Mikroskopobjektträger aus Glas (als Abdeckung) verwendet werden, um die Haut zu glätten und um eine ordnungsgemäße optische Ankopplung der Baugruppe ¹⁴ zu gewährleisten. Zwei Büroklammern verwendet werden, um die Pfote zwischen Glas und Metallstange Oberfläche zu fixieren (Abbildung 4
2. Bedecken Sie den Ring mit Mikroskop Deckglas (5 mm Durchmesser, Elektronenmikroskopie Science).
3. Schrauben Sie den Ring Fixateur an der starren Metallstange, die auf dem motorisierten Mikroskoptisch montaged wird.

3. Bildgebungsverfahren

1. Im Falle der Verwendung THY1-YFP-H-Mäuse, wählen Sie den blauen Teil des Fluoreszenzlampe Spektren Nervenfasern sichtbar zu machen. Finden Sie den Nerv der Interesse an Epi-Fluoreszenz-Modus und konzentrieren sich auf sie.
2. Schreiben Sie die Koordinaten eines Punktes für Längs Bildgebung. Verwenden Sie einen Handwurzelunterlage als Bezugspunkt. Während der folgenden Imaging-Sitzungen, erkennen die ersten Handwurzel Pad und dann finden die gleichen stromaufwärts großen Nervenfasern und gehen Sie zurück über die gespeicherten Koordinaten. Es ist wesentlich, um die Fußauflage in der gleichen Richtung senkrecht zu der Metallstange zu positionieren, um dasselbe Bezugssystem zu halten.
3. Einschalten des Zwei-Photonen-Modus. Für die Thy1-YFP-H Mäusen ist es geeignet, die 950 nm-Wellenlänge von Laserstrahlung zu verwenden, um die Nervenfasern zu visualisieren.
4. Wählen Laserwellenlänge und Emissions Kanäle (450-480 nm für die zweite Generation Erkennung harmonisch, 520-550 nm für die Bildgebung von YFP-markierten Nerven und 580-630 nm zur Detektion von YFP Fluoreszenz und Autofluoreszenz der Haare), mit zu beginnen niedrige Laserleistung (3-5%) auf Lichtschäden und Bleich verhindern. Die typische Spannung an den Photovervielfacherröhren ist 600-700 V für diese Art der Bilderzeugung.
5. Stellen Sie die gewünschte Auflösung (512 x 512 oder 640 x 640 für schnelle Messungen Veranstaltungen, 800 x 800 oder 1.024 x 1.024 für die morphologische Bildgebung), axiale Stufe (1-3 Mikrometer), Dicke der Probe und die Zeitintervalle (1-10 min). Die Belichtungszeit ist in der Größenordnung von 1 ms pro Pixel.
6. Erste markieren die oberen und unteren Grenzen des Abbildungsvolumens in der Software.
7. Erwerben die Referenzbildstapel für die Referenz vor der Läsion. Bei Bedarf ist es möglich, den Ausgangswert während einige Minuten aufzeichnen.
8. Nach der Bild sauber das Pad mit einem Taschentuch und legte die Maus in einem Rückgewinnungskasten bei 36 ° C, bis sie ganz wach.
   HINWEIS: In der Regel wird die Dauer eines Bildgebungssitzung in Verbindung mit Laser-induzierte Läsion (siehe unten) nicht 1 h überschreiten. Wir empfehlen, zu überprüfen, ob das Tier tief narkotisiert alle 10-15 min; Dies sollte nicht mit der Abbildung selbst stören, sollte aber beachtet werden, wenn experimentelle Verfahren ist geplant werden. Die Dauer der Wirkung einer Einzel Ketamin / xylazyne Dosis ist etwa 30 bis 40 min, so empfehlen wir, gelten zusätzliche ¼ bis ½ Dosis nach 25-30 min.
   HINWEIS: Es sollte auch berücksichtigt werden, wenn die Experimente plant, dass die Frequenz des Bilderzeugungseinheiten für ein bestimmtes Tier zu 1 Sitzung für 2 Tage nicht überschreiten, um nachteilige Wirkungen zu vermeiden Wiederbewerbs Anästhesie.

4. Laser Läsion

1. Nach dem Erwerb der Referenzbildstapel, verwenden Sie das Bleich Protokoll, um eine Mikro Läsion zu machen.
2. Erhöhung der Laserleistung auf 100%.
3. Erhöhen Sie die Belichtungszeit auf 100-1000 ms pro Region von Interesse (100-1,000x mehr als bei Standard-Imaging).
4. Skizzieren Sie die Fläche für die Läsion.
5. Machen die Läsion durch Einschalten der Bleiche.
6. Wechseln Sie wieder zu den regulären Bildgebungsmodus und fahren Sie mit Zeitraffer-Aufnahmen.

5. Datenverarbeitung und Analyse

1. Fahren Sie mit Entmischung mit Entmischung in ImageJ Plugin ⁸ (Joachim Walter, http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/spectral-unmixing.html ).
2. Öffnen Sie das Bild Stapel aufgeteilt und die Kanäle.
3. Finden Sie den Bereich frei von den Nerven oder Haare für die Hintergrundmessungen. Setzen Sie ein Region of Interesse in diesem Bereich.
4. Skizzieren sorgfältig die Teil der Haare, wo sie sich deutlich von den Nerven ist.
5. Skizzieren Sie die Nerven in dem Teil des Bildes, wo es getrennt von der Haar ist.
6. Sparen Mischmatrix.
7. Gelten gemessenen Mischmatrix für das gesamte Stack.
8. Speichern Sie die neuen Bildstapel verarbeitet in TIF-Format *.

Representative Results

Mit dem beschriebenen Verfahren ist es möglich, dieselbe Faser nach der Läsion zu verfolgen und um den Abbau der beschädigten Nervenenden (1) zu untersuchen. Erwerb der Stapel mit der Dicke von 120-150 um ist in der Regel die richtige für die wiederholte Bildgebung während mehreren Tagen um die ganze Faser in das Blickfeld zu halten.

Die Läsion kann in der Regel kurz erzeugt werden, wenn das Kunststoffverpackungsmaterial, eingestellt wird, um die Haut zu glätten, so dass die Kollagenschichten mit gleichförmiger Intensität auf das Bild (2) angezeigt. Die Nervenenden über der Kollagenschicht sind am besten geeignet, um die genaue Läsion zu erzeugen.

Falls die Haut nicht abgeflacht, kann das Bild unscharf auftreten (Abbildung 3). Die Intensität kann in dieser Situation immer noch geeignet für morphologische Untersuchungen der Nervenfasern, aber die Laser Läsion Verfahren wäre behindert wird.

Abbildung 1. Zeitspur der Wirkung der Laser Läsion an der Nervenfaser als maximale Projektionsbilder dargestellt. Die oberen Bilder zeigen die Faser vor und direkt nach der Verletzung, die untere Tafel zeigt die gleiche Faser nach 30 min und 10 Tage (links und Recht Platten, entsprechend). Es gibt einige YFP exprimieren Strukturen von nicht-neuronalen Natur, die 10 Tage nach der Läsion auftreten. Diese Strukturen sind wahrscheinlich Keratinozyten, die bekannt sind, um Thy1 Gen transient unter traumatischen Bedingungen auszudrücken. Die YFP-Fluoreszenz von Nervenfasern ist in gelb dargestellt. Ein Pfeil markiert den Bereich der Läsion. Maßstab 30 um.

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Abbildung 2. Maximale Bildprojektion für Nervenenden in der Haut abgeflachten Bereich. Die YFP-Fluoreszenz von Nervenfasern wird gelb dargestellt, ist die Erzeugung der zweiten Harmonischen des Kollagens in blau dargestellt. Maßstab 50 um.

Abbildung 3. Die Nervenenden in der gekrümmten Fläche der als maximale z-Projektion für mehrere optische Schnitte erhalten Haut. YFP Die Fluoreszenz von Nervenfasern und Autofluoreszenz der Haare wird gelb dargestellt, ist die Erzeugung der zweiten Harmonischen des Kollagens gezeigt in blau. Maßstab 50 um.

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Abbildung 4. Das Pfoten Fixierung Prozedur mit dem Mikroskop Objektträger aus Glas als Abdeckung. Die Folie wird auf die Metallstange mit Standard-Büroklammern.

Discussion

In diesem Video zeigen wir die Protokoll-Methode zur nicht-invasiven Längs Zwei-Photonen-Imaging von einzelnen Nervenenden.

Die Dynamik der Haut Innervationen in Krankheiten wie Psoriasis und periphere Neuropathie ^2, und in traumatischen Verletzungen ⁹ betroffen. Zwei-Photonen-Bildgebung ermöglicht eine detaillierte Untersuchung der Nervenfasern Strukturen Kollagenmatrix. Die Verwendung von transgenen Mäusen Reporter hilft, die Probleme der Färbung der Nervenfasern zu vermeiden. THY1-YFP-H-Stamm scheint ausreichend robust für die morphologische Datenanalyse ¹⁰ sein, während die Thy1-mitoCFP Mäuse können eine Gelegenheit funktionelle Studien der mitochondrialen Dynamik in den Nervenfasern ¹¹ liefern. Das YFP-16 / ICR Leitung für die Beobachtung von Meissner Körper ¹² verwendet werden. Der alternative Ansatz kann die virale Injektion in dorsalen Wurzelganglien zur selektiven Verfolgung spezifische neuronale Populationen13.

Es ist bemerkenswert, dass die Herstellung von selektiven Läsion innerhalb der Kollagenmatrix stark im Vergleich zu den oberen Schichten der Haut behindert wird. Deshalb manchmal Belichtungszeiten für die Dissektion von Nervenfasern kann so viel wie das Zehnfache unterscheiden, während die Intensität der Fluoreszenz für die Abbildung unterscheidet sich in dem Bereich von 10-20%. Um eine gute Qualität des Bildes die ständige Eint Kupplung muss gehalten werden halten.

Die Auflösung des Bildes hängt in der Regel auf der wünschenswerten Geschwindigkeit des Erwerbs. Typische Zeit für die Produktion einer 30 Rahmen- Stapel mit einer Auflösung von 800 x 800 Pixel ist 1 min, so kann man die Auflösung oder die Dicke der abgebildeten Bereich auf schnelle Veränderungen zu erkennen oder zu erhöhen Auflösung für feine morphologische Merkmale Studien zu verringern.

Fixierung der Fußballen sollte fest genug sein, um die Drift des Bildes zu ermöglichen, aber gleichzeitig sollte sie nicht auf die Durchblutung in ter Haut. Zur Optimierung des Verfahrens, Injektionen von Blutgefäßen Tracer (zB TexasRed markierten 70 kDa-Dextran) möglich, so dass man das Kunststoffverpackungsmaterial Druck über die Überwachung des Blutdurchsatzes. Bewegungsartefakte in dem in diesem Protokoll beschriebenen Herstellung ist es unwahrscheinlich, weil das Tier tief narkotisiert, das Pfoten selbst fest an der Befestigungsanordnung befestigt ist, und weil Herzschlag und Atmung Bewegung nicht direkt an der Pfote übertragen. Allerdings sind leichte Bewegungen möglich, besonders wenn hohe Vergrößerung Bildgebung durchgeführt wird. In diesem Fall können wir empfehlen mit ImageJ-Plugins entwickelt, um Bewegungsartefakte zu kompensieren.

Die sich wiederholenden Abbildung der gleichen Fläche kann durch die Verwendung solcher Referenzpunkte wie Karpalballen ^14, oder im Falle der Injektion von manchen Stoffen in den Fußballen der Spot von Injektion kann als Wahrzeichen ⁶ dienen erreicht werden. Die andere Möglichkeit ist das Tätowieren der Haut.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Round cover glass	Electron Microscopy Science	72296-05	5 mm diameter #1.5 thickness
Eye drops Viscotears	Novartis		2 mg/g
Superglue Loctite 401	Henkel	135429
Ketaminol	Intervet		Ketamine 50 mg/ml, working solution 10 mg/ml (use it 80 µg per gram of animal weight)
Rompun	Bayer Healthcare		Xylazine 20 mg/ml, working solution 1.25 mg/ml (use it 10 µg per gram of animal weight)
Ethanol 70%
Distilled water or Milli-Q water
Syringes 1 ml	BD	300013
30 G 1/2" needles	BD	304000
Plastic packaging material			Could be purchased from general hardware store
FV-1000MPE microscope	Olympus	FV-1000MPE	Microscope with motorized stage and rigid metal bar for fixation
25X XLPlan objective	Olympus	XLPLN 25XWMP	Water immersion objective optimized for multiphoton imaging
Mai-Tai DeepSee laser (2 W)	SpectraPhysics
Heating pad	Supertech	TMP-5b	Heating pad with a temperature controller
Metal ring fixator	Neurotar Ltd.
ImageJ	NIH		Open source software for image processing and analysis, http://rsbweb.nih.gov/ij/
Thy1-YFPH mice strain	JaxLab	003782